Tecnologia VHH Anticuerpos Monoclonales Recombiantes Que pasó despues de Milstein? Dra VivianaParreño Bioquimica Morón Investitigadora adjunta CONICET Labortatorios de Virus Entericos Instituto de Virologia INTA Hamers-Casterman IgG de los camélidos IgG de cadena pesada Fracciones IgG2 (bisagra larga) e IgG3 Bisagra corta) (25-45% de IgG totales en suero) IgG convencional Fracción IgG1 (55-75% de IgG totales en suero) IgG1 IgG2 – IgG3 VHH monoclonal recombinante -15 kDa: pequeño tamaño -1 sola cadena polipeptidica - Hidrosolubles Guanacos Vicuñas Llamas Alpacas C. Hamers-Casterman y col,1993, Nature poseen anticuerpos de cadena pesada Poseen 4 isotipos de Inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgD e IgG convencionales (IgG1) y de cadena pesada (IgG2 e IgG3) Camello Bactriano Figure 2. Simplified vertebrate phylogenetic tree emphasizing those taxa possessing singledomain Igs or TCRs. Flajnik MF, Deschacht N, Muyldermans S (2011) A Case Of Convergence: Why Did a Simple Alternative to Canonical Antibodies Arise in Sharks and Camels?. PLoS Biol 9(8): e1001120. doi:10.1371/journal.pbio.1001120 http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.1001120 VHH propiedades CDR1 Pequenó tamaño (15kDa) 1 sola cadena polipetídica polypeptide chain alta resistencia fisico-quimica CDR2 CDR3 • Temperatura • Refolding Elevada afinidad y especificidad (nanomolar) VHH h CH2 CH3 s-s s-s M s-s Camel extra S-S llama extra S-S L Figure 3 FR 1 CDR 1 FR 2 CDR2 s-s Canonical disulfide bond FR 3 CDR3 FR 4 Propiedades de los VHH Las moléculas VHH combinan propiedades de un anticuerpo monoclonal convencional con propiedades de drogas de pequeño tamaño Al igual que los Ac Monoclonales... Al igual que las drogas de pequeño tamaño... = = -Acceden a hendiduras en receptores -Acceden a sitios activos de enzimas Afinidad Especificidad Toxicidad -Acceden a epitopes ocultos para Anticuerpos convencionales -Penetran con facilidad los tejidos -Atraviesan la barrera hematoencefálica Además... -Fáciles de producir y purificar -Pueden expresarse en varias plataformas -Administración por vía intravenosa, oral, tópica etc -Se pueden modificar *Por ingeniería genética (multimeros y fusión a otras proteínas) *Químicamente Direccionamiento de Terapia génica Purificación de proteínas Estudios intracelulares Kits diagnósticos Terapia de infecciones Diagnóstico por imágenes Aplicaciones potenciales de los Anticuerpos recombinantes monoclonales VHH Terapia anti-cancer y Enfermedades autoinmunes Leches inmunes Nanosensores Anti-caries Anti- caspa Nanoanticuerpos VHH anti Rotavirus con propiedades polineutralizantes in vitro y actividad protectiva in vivo contra la diarrea por Rotavirus Humano Lorena Garaicoechea ROTAVIRUS ES LA PRINCIPAL CAUSA DE DIARREA EN NIÑOS MENORES A CINCO AÑOS DE EDAD A NIVEL MUNDIAL (Tate, Burton et al. 2012) Este patógeno entérico causa anualmente 2500 millones de casos de diarrea en niños <5 años 25 millones de consultas médicas , 2 millones de hospitalizaciones, y aproximadamente 400.000 muertes anuales en lactantes y niños pequeños En Argentina: 42% de las hospitalizaciones en niños menores a 3 años de edad se deben a Rotavirus Genotipo prevalente en niños a nivel mundial G1P[8] P-tipos: P[4], P[6], P[7], P[8], P[9], P[14] G-tipos: G1, G2, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10, G12 UN Millenium Development Goal 4: disminución de la tasa de mortalidad infantil en 2/3, 1990 - 2015 Prevención Inmunidad pasiva Anticuerpos por via materna Inmunidad activa Vacunación: buena efectividad y cobertura. Alcance?, situación en los países en desarrollo?, presión selectiva? Características Productor N° Serotipos Serotipos incluidos Formulación N° de dosis Edad de administración Rotarix® Rotateq® GSK Biologicals Merck Sharp & Dohme Monovalente Pentavalente P1A[8]G1 P7[5]G1, P7[5]G2, P7[5]G3, P7[5]G4, P1A[8]G6 Monodosis, liofilizada, reconstituir con buffer Monodosis, líquida Dos Tres 2 y 4 meses 2, 4 y 6 meses No existen tratamientos específicos contra RVH. VP7 Outer Capsid Glycoprotein Induces neutralizing Ab (27 G-types) VP2 Inner capsid VP6 Intermediate Capsid Relativamente conservada Altamente inmunogenica Anticuerpos Conventionales contrao VP6 no poseen acrividad neutralizantes VP4 Outer Capsid Induces neutralizing Ab(35 P-types) Hemaglutinin IgA mAb neutralizacion intracelular por transcitosis Subcore (VP1, VP3 ARNpol complex Estructura de la proteína VP6 VP6 Monomero Monómero VP7 (G tipos) En contacto con VP2 Trímero Interacciones -3 Cl-3 Zn++ -12 Ca++ -Con VP7 -Con VP4 -Con VP2 Potrero para llamas que se acondicionó en el año 2005 - INTA Castelar Técnico Agropecuario Diego Franco Dra Gisela Marcoppido Manejo de la llama Producción de Anticuerpos VHH: Vacunación de la llama Si el volúmen de la dosis es elevado, la misma se puede dividir en dos aplicar en distintos puntos Sangrado de la llama Evaluación de la respuesta inmune a la vacunación ELISA ELISPOT dil 1/2 anti IgG bovina-HRP ABTS anti RV Anti-llama HRP dil 1/2 RV Suero de la llama VHH Antígeno de interés anti His Mide Anticuerpos dil 1/2 Permite medir células Secretoras de Anticuerpos Figure 4 Separacion de células mononucleares Buffy coat en Lymphopred Extraccion de sangre entera Tecnología de fago display para enriquecer y seleccionar VHH específicos M13KO7 Helper phage E coli VHH variants displayed on phage Re amplification of phages (E coli infection) Permite la expresión del VHH Fusionado a la proteína de Superficie del fago PIII Elution of VHH specific phages display cycle Binding to antigen Wash of unbound phages ELISA de FAGOS: permite evaluar cada clon de VHH ABTS Anti-fago M13 HRP Fago expresando VHH Antígeno de interés Subclonado del VHH en el vector de expresión de la plataforma elegida Expresión y purificación Levaduras E.coli Célula de mamífero Baculovirus (larvas de insecto) Plantas Inmunización de llama con proteína VP6 de Rotavirus 30 100000 25 Título de Ac 1000000 10000 20 1000 15 100 10 10 5 1 0 7 14 21 25 28 32 35 39 60 Días post inmunización 81 109 145 246 250 NºCSA anti-RV/5 x 10^5 CMN Título de Ac anti-VP6 Título de Ac anti-RV IND Título de Ac neutralizantes anti-RV IND Se construyó una biblioteca de genes VHH anti VP6 0 Nº CSA anti RV/ 5 x 10^5 CMN 27 CSA/5 x 10^5 mononucleares (CMN) Los VHH anti VP6 reconocieron todas las cepas de Rotavirus grupo A testeadas por ELISA ABTS anti IgG bovina-HRP anti RV RV VHH anti His 1,8 1,6 2KA4 1,4 2KD1 Abs 1,2 1,0 3A6 0,8 3B2 0,6 Non-related VHH 0,4 0,2 0,0 IND C486 B223 Wa H2 Fecal sample Cepas de Rotavirus MA-104 PBS Negative fecal sample Los VHH seleccionados reconocieron epitopes conformacionales en formas multiméricas de VP6 por WB A anti RV 170 120 100 70 RV Bovino En condiciones no reductoras RV Bovino En condiciones reductoras Non rel anti anti 2KA4 2KD1 3B2 3A6 VHH RV VP6 VP2 VP4 55 VP5 40 VP6 35 VP7 VP2 VP4 muestra Non rel Ac secundario anti 2KA4 2KD1 3B2 3A6 VHH VP6 Trímeros y Oligómeros de VP6 VP5 VP6 monómero VP7 25 1 2 3 4 5 6 7 8 anti RV 10 11 12 13 14 VP6 recombinante bajo condiciones no reductoras VP6 recombinante bajo condiciones reductoras B 9 anti 2KA4 2KD1 3B2 3A6 Non rel anti RV VHH VP6 anti VP6 2KA4 2KD1 3B2 3A6 muestra Non relAc VHH 170 120 100 70 secundario Trimeros y Oligómeros De VP6 55 40 VP6 monomero 35 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 VHH anti VP6 neutralizaron in vitro cepas de Rotavirus de diferentes genotipos 100 90 80 RV + VHH 70 C486 60 (Subgrupo I; P[1]G6) 50 40 30 Protección (%) 100 UFF MA-104 IF 20 10 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 250 100 90 IND 80 (Subgrupo I; P[5]G6) 70 60 50 40 30 20 10 MA-104 NEUTRALIZACION MA-104 Infección 2KA4 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 250 2KD1 [VHH] (ug/ml) 3A6 3B2 VHH no relacionado VHH anti VP6 neutralizaron in vitro cepas de Rotavirus de diferentes genotipos RV Bovino Proteccion (%) 100 90 80 H2 (Subgrupo noI; noII ; P[12]G3) 70 60 50 40 30 20 10 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 250 100 90 80 B223 (SbI; P[11]G10) 70 60 50 40 30 20 10 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 250 [VHH] (ug/ml) [VHH] (ug/ml) 2KA4 100 Proteccion (%) Proteccion (%) RV Equino 2KD1 90 80 3A6 70 Wa (SbII; P[8]G1) 60 50 3B2 40 30 RV Humano 20 10 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 [VHH] (ug/ml) 250 VHH no relacionado VHH anti VP6 de Rotavirus: NEUTRALIZATION OF HUMAN ROTAVIRUS 100 FFU ROTAVIRUS INFECTION NO INFECTION Nanoantibodies + Rotavirus Virus neutralization (%) 100 90 2KA4 80 70 2KD1 Wa (P[8]G1) 60 50 3A6 40 Human RV 30 3B2 20 Non related VHH 10 0 0.2 0.98 3.9 15.6 62.5 [VHH] (ug/ml) 250 Protección contra la diarrea en un modelo ratón lactante Ratones BALB/C de 4 días de vida Desafío viral (intragástrico) Day 0 1 2 3 4 5 VHH: 100ug (intragástrico). Evaluación de la diarrea A)Desafío con RV bovino C486 P[1]G6; 30 DD50 Diarrea en el 100% de los ratones no tratados B) Desafío con RV murino EC P[16]G16; 316 DD50 Diarrea en el 100% de los ratones no tratados VHH anti VP6 de Rotavirus: Protección frente al desafío viral en ratones lactantes Excreción viral a las 96 horas post desafío con RV murino ECw 100 1,4 90 1,2 80 Abs 405nm RATONES CON DIARREA (%) Diarrea por Rotavirus murino 70 60 # 50 40 # # 1,0 # 0,8 0,6 0,4 # 30 20 0,2 # 0,0 10 3B2 0 0 24 48 72 Hs post challenge 2KA4 2KD1 3A6 3B2 Antiserum to RV C486 Normal antiserum Non treated group Non related VHH 3A6 2KD1 2KA4 96 El tratamiento con VHH disminuye significativamente la excreción viral 2KD1 no se detectó antígeno viral en intestino por ELISA VHH sin sin no rel tratar desafiar Llama immunization with a Rotavirus highly conserved protein (VP6) Development of recombinant VHH with unexpected properties Broad neutralizing capacity: Neutralizes Broad protective capacity rotavirus infection independently of the viral genotype. against rotavirus diarrhea in a suckling mouse model 1º Price Best work in Veterinary Virology. 10th Argentinean Virology Congress, Sep, 2008 Patent TECNOLOGIA VHH AT BE BG CHCZ DE DK EE ES FIFR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PLPT RO SE SI SK TR IS CH RU USA ME BR ARA PO7010331 “Alternative Heterologous Passive Immune Strategies to Prevent Rotavirus Diarrhea: protection and impact on neonatal B-cell responses in two animal models of Rotavirus infection and disease” L.J. Saif, V. Parreño, F. Fernández, A. Wigdorovitz, C. Vega, P. Chacana, M. Bok, L. Garaicoechea, J.A. Escribano Evaluación de distintos tratamientos pasivos orales para la prevención de la diarrea por rotavirus humanos. Estudio de la actividad inmunomoduladora de los anticuerpos heterólogos versus los homólogos. MODELO CERDO GNOTOBIÓTICO PARA EL ESTUDIO DE RVA Susceptibles a la infección por cepas de RVA Humano Desarrollo de infección y diarrea por RVH Dieta láctea, fisiología gastrointestinal y desarrollo de la respuesta inmune similar a las de infantes humanos Buena correlación entre la protección en este modelo y en niños. MODELO CERDO GNOTOBIÓTICO Suplementación de la leche a partir de las 24hs de vida durante 9 días Inoculación viral 72hs de vida/RVH Wa: 106.7UFF Histerectomía Estudio de la respuesta inmune a los 21 dpi Estudio de la infección y toma de muestras Registro de diarrea y excreción Dieta libre de anticuerpos T R ATA M I EN T O PA S I VO C O N V H H A N T I V P 6 D E RVA Producción de anticuerpos monoclonales recombinantes VHH anti VP6 en larvas de insecto Generación de larvas de T. ni infectadas con baculovirus recombinantes portadores del inserto del VHH Obtención del extracto proteico total estéril conteniendo el VHH anti VP6 Diarrea y excreción viral Diarrhea b,e Virus shedding Treatment Group n VHH 5 5/5 A ND A ND IgY 4 0/4 B 1.8 B 4.0 CL 4 0/4 B 2.0 B IgG 6 4/6 AB 4.0 C NT 5 0/5 B 2.2 B p-value - <0.05 N° Protected d Animals Mean Onset (PID) 0.0214 Mean Duration (days) ND % Infected Animals Mean Onset (PID) Mean Duration (days) AUC (FFU/ml *day) A 5/5 2.6 3.0 AB 6.1 x 10 BC ABC 4.2 AB 2.3 x 10 5 BC 5.2 AB 2.1 x 10 5 BC 4.9 AB 8.3 BC 4/4 1.8 5.3 C 9.3 C 4/4 1.8 4.0 AB 4.0 B 5/6 3.0 1.6 A 1.9 x 10 C 15.6 5/5 2.2 5.6 C 1.8 x 10 - - 6.8 <0.0001 C <0.0001 0.0012 Mean Peak Titer (log FFU) 4 AB BC 4.5 0.7 A Mean Cumulative c Score a,e Mean Shed Virus (log FFU) 0.8 1.3 1.0 AB B AB 4A 3.4 A 0.5 A 6C 5.7 B 1.2 B 0.0055 0.014 0.0012 Diferentes letras en la misma columna indican diferencias significativas. Test de ANOVA seguido por análisis de Comparaciones de Bonferroni, p<0.05 / Test de proporciones de Fisher, p<0.05 Diarrea y excreción viral Duración de la diarrea Duración del tratamiento Respuesta al tratamiento VHH 3B2: Estudio de la actividad neutralizante de cepas de rotavirus grupo A representantes de las principales variantes que circulan en humanos Concentración de VHH (µg VHH/ml) Cepa de RVA 3B2 VHH VHH No relacionado Wa (G1 P[8] I1) 0.06 Neg DS1 (G2 P[4] I2) 0.24 Neg SA11 (G3 P[1] I2 ) 15.63 Neg Gottfried (G4 P[6] I1) 0.24 Neg ST3 (G4 P[6] I1) 0.98 Neg H1 (G5 P[7] I5 ) 0.98 Neg 69M (G8 P[10] I2) 0.98 Neg F45 (G9 P[8] I?) 0.06 Neg Arg720 (G12 P[9] I?) 3.91 Neg Diluciones base 4 del clon 3B2 o de un VHH no relacionado se mezcló con igual volumen conteniendo 100 (FFU) de cada cepa de RVA. Se expresan la concentración minima de VHH que reduce en un 80% o más el numero de focos fluorescentes. Neg = ausencia de antividad neutralizante eh la mayor concentración analizada (62.50 µg VHH/ml) Producción de los Nanoanticuerpos en larvas de insecto NEUTRALIZACION IN VITRO Infección Por rotavirus Nanoanticuerpos + Rotavirus Expresión de niveles óptimos de nanoanticuerpos Ausencia de infección Los nanoanticueros expresados en larvas conservan la propiedad de Neutralizar la infección por RV purificación Ensayos en el modelo cerdo gnotobióticos de infección y diarrea por ROTAVIRUS HUMANO 100 80 60 40 20 0 3B2 2KD1 2KD1+3B2 TRATAMIENTO CON NANOANTICUERPOS no neutralizante control negativo Los VHH expresados en larvas protegen de la diarrea por Rotavirus a ratones lactantes Porcentaje de lechones con DIARREA Porcentaje de ratones con DIARREA Ensayos de protección en ratones 100 80 60 40 20 0 3B2 VHH Anti VP6 de Rotavirus Neutralizante no neutralizante IgY convencional Anti VP6 de Rotavirus No neutralizante control negativo Control no tratado Los VHH expresados en larvas protegen de la diarrea por Rotavirus humano Premio INNOVAR 2011 Investigación Aplicada Proyecto 10251 Desarrollo y producción de nanonaticuerpos para profilaxis y diagnóstico Parreño, Garaicoechea, Vega, Bok, Barbieri, Asenzo, Marcoppido, Franco, Kahl, Escribano, Saif y Wigdorovitz INCUINTA – Instituto de Virologia, CICV y A, INTA Castelar Algenex, España The Ohio State University, USA Para el recuerdo… Estudio del mecanismo de neutralización y efectos en la estructura viral del VHH anti VP6 de Rotavirus Dra. Lorena Garaicoechea Instituto de Virología, INTA Castelar Baylor College of Medicine Se logró obtener una población de particulas enriquecida en TLPs Y otra poblacion de particulas enriquecida en DLPs Gradiente de Cloruro de Cesio TLPs Wa DLPs TLPs 1x109 UFF/ml DLPs 1x107 UFF/ml Observación por Microscopia Crioelectrónica TLPs Wa TLPs Wa + 3B2 DLPs DLPs + VHH 3B2 DLPs sin VHH 1h 37 C VHH 3B2 + DLP 24hs 4 C ¿Qué cantidad de anticuerpos VHH son necesarios para producir el efecto en las DLPs? No VHH Indic magn: 15000X Total magn: 131748 No VHH Indic magn: 25000X Total magn: 222082 No VHH Indic magn: 20000X Total magn: 181374 No VHH Indic magn: 40000X Total magn: 362812 No VHH Indic magn: 30000X Total magn: 262319 No VHH Indic magn: 60000X Total magn: 544218 Sin VHH Incubación ON a 4C 0.001ng/10ul Indic magn: 15000X Total magn: 131748 0,001 ng VHH/10u 0.001ng/10ul Indic magn: 25000X Total magn: 222082 0.001ng/10ul Indic magn: 25000X Total magn: 222082 0.001ng/10ul Indic magn: 50000X Total magn: 453515 0.001ng/10ul o 0.01 Indic magn: 50000X Total magn: 453515 0.01ng de VHH/10ul Indic magn: 15000X Total magn: 131748 0.05ng de VHH/10ul Indic magn: 15000X Total magn: 131748 0.05ng/10ul Indic magn: 25000X Total magn: 222082 0.1ng/10ul Indic magn: 15000X Total magn: 131748 0,1 ng de VHH/10 ul 0.1ng/10ul Indic magn: 50000X Total magn: 453515 1ng de VHH/10ul Indic magn: 15000X Total magn: 131748 Interacción y complementariedad entre las entidades del consorcio INTABIO AF para la producción de leche funcional I&D Control de calidad Nanoanticuerpos VHH Unidad experimental de camélidos sudamericanos Box de bioseguridad P2 para ensayos de eficacia en Modelos animales Desarrollo de nanoanticuerpos VHH Desarrollo Manufactura Comercialización leche funcional para prevenir la diarrea por Rotavirus Control de funcionalidad de nanoanticuerpos en las diferentes etapas de elaboración de los biofármacos y alimentos funcionales con VHH I&D Alimento funcional Control de Eficacia de producto terminado - Modelos animales para Rotavirus: I&D Bovinos trangénicos Biofarmacos Manufactura Comercialización Desarrollo de bovinos trangénicos que expresen nanoanticuerpos en leche Planes Sociales Ministerio Salud 2006 Desarrollo De biblioteca VHH anti-VP6 de RVA Personal INTA en EMBL 2006-2008 Caracterización in vitro Capacidad neutralizante de amplio espectro Estudios iniciales de estabilidad 2009-2010 Comparación de los VHH obtenidos en E coli vs larva de insecto Evaluación de protección en modelo ratón lactante *Gomez Sebastian y col. enviado BMC Biotechnology, 2012 Protección ratón lactante *Garaicoechea, Olichon y col, JV 82 (19) 9753-68,2008 Premio IX Congreso Argentino de virologia, 2008 Expresión periplasma E coli* SISTEMA DE EXPRESIÓN ACTIVIDADES - RESULTADOS Evolución del desarrollo de VHH anti VP6 de Rotavirus Evaluación de eficacia en cerdos gnotobioticos desafiados con rotavirus humano G1P[8] Vega, Bok y col, 2011, Premio X Congreso Argentivo de virologia, 2011 Expresión larvas de insecto Infectadas con baculovirus (Algenex)* 2011 Estudios iniciales de mecanismo de neutralización viral Capacitación L. Garaicoechea En lab Dr. Prasad, Baylor College, Houston Texas, USA 2012 Inicio de desarrollo de vaca trangénica *Lenzt y col, Planta, 2012 PREMIO INNOVAR 2011 a la plataforma Expresión en transplatómicas de Tabaco (INGEBI)* Expresión en leche de Bovino Trangénico Expresión en levaduras (Biomanay SRL) FINANCIACIÓN Hitos Convenio Cooperación Bilateral SecyT-BMBF 30,000€ Solicitud PATENTE INTA-Algenex 100,000 € Subsidio R03 Fogarty Foundation INTA-Algenex-FAHRP 25,000 € PICT Jóvenes 2010 8,000 € Proyecto Especifico Incuinta res. 790/09 20,000 € Subsidio FONARSEC INTA-BIO AF 2,100,000 € Tecnologia VHH Publicaciones Figure 7 Taller de capacitación desarrollo de bibliotecas VHH (6-17 de Octubre de 2014) Dr. Serge Muydermans Dr. Cecile Vincke Universidad Libre de Bruselas Bélgica Pipeline de Desarrollo de Nanoanticuerpos VHH Desarrollo - Descubrimiento Norovirus humano GI.1 / GII.4 Infuenza H1N1 H3N2 B E coli E coli E coli PATENTE E2 Virus de la diarrea viral bovina Ecoli PUBLICACIOON Prueba de Ppcio APLICACIONES Modelo Animal Inicio de Kit BioFármaco No roedor Desarrollos Diagnostico PUBLICACIOON si bovinos transgenicos TESIS DOCTORA L VIRUS VP6 Rotavirus A PATENTE PUBLICACIOON Expresión Caracterización Bioquímica Funcional Rendimiento TESIS DOCTORAL Selección VHH Prueba de Ppcio Cambio Modelo Animal Plataforma de rodedor expresión baculovirus si modelo Cerdo gnotobiotico Alimento Funcional Participantes INTA EMBL ALGENEX FAHRP bivalentes INTA bivalentes PUBLICACIOON Inmunización Desarrollo Biblioteca llamas Escalado no Arroz modelo Cerdo transgenico gnotobiotico INTA NIH VirginaTech INTA Algenex Influenza m2e HRSV Lengua azul INTA IgG dif. especies Células sistema inmune Proteinas amiloides INTA NYU Tecnologia VHH Muchas gracias por su atención!!