Clase Silenciamiento génico 2010.pdf
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Introducción al Silenciamiento Génico Gabriela Conti, Cecilia Rodriguez, Carlos Manacorda, Vanesa Mongelli y Sebastian Asurmendi Instituto de Biotecnología INTA Castelar Silenciamiento de RNA Es un mecanismo de degradación específico de RNA en eucariotas, en animales se denomina “RNA Interferencia” (RNAi) y en plantas “Silenciamiento Génico Post Transcripcional” (PTGS) (Baulcombe, 2004). En plantas, es un mecanismo importante de regulación génica y también del sistema inmune (Aravin et al. 2001; Hamilton et al. 2002). Silenciamiento de RNA • El proceso se activa a partir de la presencia de RNA de doble cadena (dsRNA) o también de RNAs aberrantes. • Estos dsRNAs son clivados por endonucleasas Dicer y Dicer-like (DCL) para generar varios tipos de pequeños RNAs interferentes (siRNAs) de 21-25 nt. • Los siRNAs se incorporan a un complejo de inducción de silenciamiento (RISC) que incluye proteinas Argonaute (AGO). •El complejo RISC/siRNA se une y degrada secuencias de RNA complementarias. El PTGS es un mecanismo de defensa inmune en plantas • Sistema inmune ancestral contra patógenos virales, viroides y transposones. • La replicación viral puede ser suprimida si se induce el silenciamiento experimentalmente. • Los virus de plantas codifican para una gran variedad de supresores de silenciamiento. • Las mutaciones en genes que codifican componentes que participan del silenciamiento inducen mayor susceptibilidad a las infecciones virales. Expresión aberrante de transgenes Expresión de transposones Expresión de genes Expresión de genes superpuestas en MIR antisentido RDR Virus Replicación viral RNA dc viral RNAdc RDR y RpRd virales P38 RNAsa de tipo III ( DCL) HcPro Estructura secundaria del RNA viral P19 Complejo RISC Endoribonucleasa Ribonucleasa H (AGO) AAAAAA Degradación de mRNA AAAAAA Inhibición de la traducción Regulación transcripcional El PTGS es uno de los mecanismos de defensa antiviral en plantas. Las proteínas virales supresoras del silenciamiento actúan a distintos niveles • P1/HC-Pro de TEV ó PVY (potyvirus, ARNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de patogenicidad, en el sinergismo y en el movimiento a larga distancia. Previene la degradación del ARN pero no elimina la señal móvil que propaga el silenciamiento. • 2b de CMV (cucumovirus, ARNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de patogenicidad y como responsable del movimiento viral a distancia. Solo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y cuando se localiza en el núcleo. • p25 de PVX (potexvirus, ARNsc) Es la proteína responsable del movimiento viral en las plantas infectadas. Interfiere con la señal de propagación sistémica. • p19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de síntomas y de especificidad de huésped. Solo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y sólo en y alrededor de las venas. • Ac2 de ACMV (geminivirus, ADNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de síntomas. Suprime el mantenimiento del PTGS. PTGS local PTGS sistémico PTGS local PTGS sistémico RNAs pequeños endógenos, regulación génica en plantas • Respuesta a stress biótico y abiótico •Regulación de genes de desarrollo y morfogénesis Modo De acción de los miRNAs Vectores utilizados para estudiar el proceso de silenciamiento de transgenes y genes endógenos dsRNA o hpRNA Vector-VIGS LB p 35S GFP intron PFG LB RB GFP p 35S RB Transcription Transcription Poly A GFP intron CAP Poly A PFG CAP DICER GFP gene silencing mRNA degradation Translation GFP CAP RISC PFG Poly A CAP Poly A GFP Poly A CAP No Fluorescence Fluorescence Silenciamiento de transgenes expresados transitoriamente UV Nb LB p 35S GFP LB RB LB p 35S p 35S GFP GFP intron RB PFG RB Supresión del silenciamiento de secuencias expresadas transitoriamente LB LB p 35S p 35S LB GFP p 35S GFP intron HcPro RB PFG RB RB UV Nb LB p 35S GFP LB RB LB p 35S p 35S GFP GFP intron RB PFG RB Activación del silenciamiento de transgenes estables por expresión transitoria UV GFP LB p 35S GFP intron PFG RB El silenciamiento de transgenes no puede ser establecida ante la presencia de un supresor del silenciamiento UV GFP LB p 35S GFP intron PFG RB LB p 35S LB GFP p 35S intron HcPro PFG RB RB GFP + P19 dsGFP + P19 GFP dsGFP Nb 16C GFP + dsGFP GFP + P19 Nb Silenciamiento sistémico UV GFP GFP Agroinfiltration LB p 35S GFP intron PFG PTGS GFP RB GFP Sistemic PTGS Virus-induced gene silencing (VIGS) Nt Nt Nt Agroinfiltration PTGS PDS Sistemic PTGS pTRV1 LB p 35S MP RpRd 16K pTRV2 LB p 35S CP PDS RZ RB RZ RB Ejemplo del sistema VIGS N. benthamiana N. tabacum A. thaliana S. lycopersicum Foto blanqueo de tejido de plantas en las cuales se silenció el gen PDS mediante el sistema de VIGS. Placas LB agar c/antibióticos 1er repique LB líquido c/ab 2do repique LB c/acetosiringona
