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Diversidad metabólica del mundo microbiano Metabolismo microbiano vías metabólicas genes procesos moleculares reciclado de elementos Desarrollo de la diversidad de metabolismos microbianos Metabolismo, replicación y herencia son inseparables del contexto ambiental interacción de presiones selectivas habitat Microorganismos presión selectiva recursos evolución tiempo 3.8×109 años Bacterias Arqueas Diversida d fisiológica Eucariote s Clasificación metabólica según requerimientos de C y E Fuente de E química luz Quimiotrofos Fototrofos Fuente de C Comp. orgánicos CO2 Quimioheterotrofos Quimiolitotrofos Aceptor final de electrones O2 oxidativo No O2 Comp. orgánicos Fermentativo Comp. inorgánicos NO3-, SO42-, Fe(III), Mn(VI) Bacterias oxidantes de S, Fe y CO Fuente de C Comp. orgánicos Fotoheterotrofos CO2 Fotoautotrofos GNB, PNB Usa H2O para reducir CO2? Si No Fotosíntesis oxigénica Fotosíntesis anoxigénica Metabolismo: Anabolismo y catabolismo Material celular, macromoléculas, biomasa • Biosíntesis • Creación de uniones C-C • Reducción asimilatoria de CO2, NO3-, SO42- ATP Recursos • Oxidación de sustratos reducidos • Uso de fosforilación y transporte de electrones • Reducción disimilatoria de O2, NO3-, Fe(OH)3, Mn(OH)4, SO42-, CO2 Intercambio de energía bioquímica ATP La termodinámica predice que reacciones son energéticamente favorables Tipos de reacción Cambio de estado Disolución/precipitación Formación de complejos Reactivos Reacción ácido/base Adsorción/desorción Oxidación/reducción Productos Reacciones redox, equilibrio químico y energía libre Reducción A B Oxidación A oxidado B reducido Reacciones redox, equilibrio químico y energía libre Reducción H+ H+ molécula orgánica con 2H NAD+ (carrier de electrones) Oxidación molécula orgánica oxidada NADH + H+ (carrier de ereducido) Las coenzimas aumentan la diversidad de reacciones redox posibles en una célula Potencial de reducción: medida de la tendencia a donar electrones en sistemas biológicos estado oxidado estado reducido La cantidad de energía que puede ser liberada de 2 hemi-reacciones se puede calcular a partir de la diferencia en los potenciales de reducción de las 2 reacciones y el número de electrones transferidos: Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats. A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38 1. Termodinámica de la hemireacción Proceso ΔG0 (kJ/ec) Respiración aeróbica -125 Desnitrificación -119 Reducción de manganeso -98 Reducción de hierro -42 Fermentación -27 Reducción de sulfato -25 Metanogénesis -23 Acetogénesis -22 2. Presencia de constituyente geoquímico en el ambiente Proceso ΔG0 (kJ/ec) Respiración aeróbica -125 Desnitrificación -119 Reducción de manganeso -98 Reducción de hierro -42 Fermentación -27 Reducción de sulfato -25 Metanogénesis -23 Acetogénesis -22 3. Fisiología de los microorganismos Aceptor terminal de electrones Aeróbico Anaeróbico Producto Microorganismo Impacto geoquímico de la respuesta a una perturbación ambiental H2 Equivalente s Especies químicas SO4O2 O2 pE +10 Fe (II) orgánicas H2S NO3- NO3- CH4 Aceptores de electrones gas oil Fe (III) 0 SO4- CO2 -10 Proceso dominante de aceptor terminal de electrones Respiración aeróbica Desnitrificación Reducción de Fe (III) Reducción de sulfato Distancia Metanogenesis Reacciones redox, equilibrio químico y energía libre oxidación reducción −27.87 Energía libre de formación (de tablas) 0 −744.6 −39.83 Transducción de energía biológica Los denominadores comunes en el metabolismo de energía son ATP y los potentiales transmembrana Fosforilación a nivel de sustrato Mecanismos para la generación de ATP Respiración Fotofosforilacion La conservación de energía está ligada a un estado energizado de la membrana Los transportadores de electrones están orientados en la membrana de modo que a medida que los electrones son transportados, los protones son separados de los electrones Potencial de reducción + Fuerza motora de protones (pmf) - ++ + Diversidad catabólica: quimio-organotrofos Fermentación Flujo de carbono en respiración Aceptores de electrones Comp orgánicos Flujo de carbono Transporte de eGeneración de pmf aceptores orgánicos Respiración anaeróbica Biosíntesis Respiración aeróbica Diversidad catabólica: quimio-litotrofos Transporte de eGeneración de pmf Aceptores de electrones Biosíntesis Respiración aeróbica Respiración anaeróbica Diversidad catabólica: Fotótrofos luz Fotoheterótrofos Compuestos orgánicos Fotoautótrofos Dador de eTransporte de electrones generación de pmf y poder reductor Biosíntesis Biosíntesis Diversidad metabólica y economía del crecimiento Economía del crecimiento Los precursores, que son la fuente de monómeros para todos los componentes celulares, se originan en los pathways centrales: gucólisis y ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) glucólisis bacteria ciclo del TCA Todos los sustratos ingresan en los pathways centrales luego de un número limitado de reacciones, para proveer al organismo con los metabolitos precursores Glucosa 6-P piruvato Fosfoenolpiruvato Fructosa 6-P Gliceraldehido 3-P 3-P glicerato Metabolismo oxidativo consumo de O2 Contaminantes orgánicos y nutrientes (C,P,N,O,Fe,S……) Crecimiento – división celular CO2 • Qué pasa con la energía? • Qué pasa con la biomasa Respiración aeróbica 38 ATP ca lo r CO2 CH2O O2 luz CH2O O2 célula microbiana fósforo Catabolismo de hidratos de carbono 4.75g/mol ATP Cinética de crecimiento Concentración de biomasa activa Tasa de crecimiento específica tasa de utilización de sustrato Máximo coeficiente de crecimiento microbiano Efecto de la concentración de sustrato Crecimiento de biomasa activa Máxima tasa de crecimiento específica Constante de saturación Máxima tasa específica de utilización de sustrato Crecimiento neto Coeficiente de decaimiento Crecimiento en 3-Cl benzoato Bodegom, Microb Ecol 2007, Vol. 53 Significado del coeficiente de decaimiento b Por definición: cuando Smin es un parámetro cinético independiente de la configuración del reactor Que pasa cuando b = 0? La existencia de un Smin es consecuencia de decaimiento y mantenimiento microbiano La mínima concentración de sustrato que se puede lograr en un sistema aumenta con b Representación genómica: qué son, que hacen, de donde vienen? Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808. Conclusiones extraídas de los genomas bacterianos 1. Correspondencia entre el tamaño del genoma y número de ORF 2. Cepas de la misma especie pueden tener variado genotipos y fenotipos 3. Diversidad en el tamaño Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808. Cuanto conocemos de la biología de procariotas? Almacenamiento Procesos Metabolismo Funciones no y procesamiento celulares caracterizadas de información Es importante el cultivo? Importancia en biotecnología Optimización de compuestos bioactivos a lo largo de la evolución interacción de presiones selectivas habitat Microorganismos evolución tiempo 3.8×109 años Bacterias Arqueas Diversida d fisiológica Eucariote s Importancia del cultivo en laboratorio Bioprospección Metagenómica Pre-genómica Secuencia del genoma Fisiología en cultivo Post-genómica Elementos mayoritarios en células microbianas Elemento Función C Constituyentes principales de las O células en las macromoléculas y H otras moléculas orgánicas N S Proteínas, coenzimas P Acidos nucleicos, fosfolípidos, ácido tecoico, coenzimas K Principal catión inorgánico, cofactor enzimático Mg Cofactor enzimático, unido a pared celular, membrana y ésteres de fosfato, incluído ácidos nucleicos y ATP Ca Cofactor enzimático, unido a pared celular Fe Citocromos, ferredoxina, proteína Fe-S, cofactor enzimático Na Transporte y transducción de energía Cl Principal anión inorgánico Elementos minoritarios: cofactores Elemento Función Mn2+ Superóxido dismutasa, fotosistema II Co2+ Coenzima B12 Ni2+ Hidrogenasa, ureasa Cu2- Citocromo oxidasa, oxigenasa Zn2+ Alcohol deshidrogensa, aldolasa, fosfatasa alcalina, RNA y DNA polimerasa, arsenato reductasa SeO32- Formato deshidrogenasa, glicina reductasa MoO42- Nitrogenasa, nitrato reductasa, formato deshidrogenasa, arsenato reductasa WO42- Formato deshidrogenasa, aldehído oxidoreductasa Factores de crecimiento aminoácidos vitaminas purinas y pirimidinas Temperatura Temperatura Ecuación de Arrhenius Coeficiente de temperatura Q10 Relación de las velocidades de reacción a 2 temperaturas T2 y T1, con T2 =T1 +10 Oxígeno Aerobios Facultativos Catalasa Superoxido dismutasa Anaerobios - Anaerobios aerotolerantes SOD Microaerófilos Una clasificación ecológica de bacterias oligotrofos Acidobacteria Betaproteobacteria copiotrofos Bacteroidetes El concepto de estrategas r y K r K Tamaño de poblaciones (N) Estrategias de vida: 2 extremos de un continuo Crecimiento exponencial r Crecimiento logístico K Número de generaciones Triada de supervivencia Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press Respuesta a condiciones ambientales Enriquecimiento selectivo como mecanismo de adaptación en biotecnología ambiental Alta afinidad por sustrato limitante Alta tasa de crecimiento Los microorganismos “no cultivables” “The great plate count anomaly” Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346. Los microorganismos “no cultivables” The great plate count anomaly Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31–440 Por qué los microorganismos se resisten a crecer en cultivo? (i) El cultivo en el laboratorio destruye interacciones presentes en ambientes naturales (ii) Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de cultivo (iii) Infecciones por fagos (iv) La alta concentración de sustrato necesaria para obtener crecimiento detectable en el laboratorio puede ser tóxica (v) Las prácticas de laboratorio suelen ignorar los primeros ciclos de crecimiento en medio líquido que aparentemente no muestran crecimiento, debido a la falta de buenos métodos de detección de densidad celular y falta de paciencia El crecimiento microbiano puede determinarse sin el uso de técnicas moleculares Zengler, K. Central Role of the Cell in Microbial Ecology (2009) Microbiol Mol Biol Rev, 73: 826-834 Efecto del medio de cultivo y del tiempo de incubación Gellan como agente solidificante: Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 826–834 Uso de aceptor de electrones alternativos Costa del Mar de Norte Alta eficiencia de cultivo: 23% del número total de células en los 2 m superficiales Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors and Substrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830 Uso de aceptor de electrones alternativos: reductores de sulfato Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulphate as electron acceptor (2007) en Sulphate Reducing Bacteria, Barton & Hamilton, eds. Cambridge Uso de aceptor de electrones alternativos: sedimentos anóxicos Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266 Uso de compuestos que median comunicación entre bacterias OHHL: N-(oxohexanoyl)-dlhomoserine lactone Monómero/óxico Polímero/óxico BHL: N-(butyryl)-dl-homoserine lactone cAMP: AMP cíclico Monómero/anóxico Polímero/anóxico Bruns et al., 2002 Ver también Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton (2003) Appl Environ Microbiol, 69, 1980–1989 Cultivo y detección de microorganismos • Mínima cantidad de nutrientes • Incubaciones largas (30d) • Protección de peróxidos • Ácidos húmicos • QS (AHL) • aeróbico • 1-2% O2 • anóxico • 5% CO2 Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70, 4748-4755 Cultivo y detección de microorganismos Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70, 4748-4755 Cultivo y detección de microorganismos Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70, 4748-4755 Cultivo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel + Dilución de células agarosa (40°C). 2,200 rpm suspensión aceite-bacteria en hielo con a 1,100 rpm 107 microgotas de gel (GMDs) 10% ocupadas por una única célula encapsulada Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686 Cultivo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686 Separación celular por citometría de flujo Cultivo de microorganismos en microgotas encapsuladas en gel Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686 Cultivo de microorganismos GMDs problemas y soluciones Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583–594 Cultivo de microorganismos marinos en cámaras de difusión membrana sedimento aga r La mayoría es invisible a simple vista La mayoría no crece luego de 2-3 pasajes Kaeberlein et al., Isolating “Uncultivable” Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70, 1127-1129 Cultivo de microorganismos marinos en cámaras de difusión Los mútiples pasajes en cámaras de difusión permiten la adaptación al cultivo in vitro Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007) Appl Environ Microbiol, 73, 6386–6390 Cámaras de difusión en formato masivo: “Ichip” Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of “Uncultivable” Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol, 76, 2445–2450 Otros métodos con membranas Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3, 1261-1264 Microplaca de Petri: un millón de cámaras de cultivo óxido de aluminio poroso 7 x 7µm Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. PNAS 104, 18217–18222 Microplaca de Petri: un millón de cámaras de cultivo chip de 8x36 mm recubierto en Pt 180.000 cámaras 20µm x 20µm Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. PNAS 104, 18217–18222 Los chips pueden ser utilizados para recuento de UFC Imagen de microscopio invertido mostrando el crecimiento de L plantarum (círculos claros) en cámaras de 20 x 20 µm Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. PNAS 104, 18217–18222 Screening de 200.000 aislamientos basados en el metabolismo de un organofosforado 1. Incubación 6 días 2. Recuento: 200.000 c 3. Screening fluorescein 3,6-diphosphate fluoresceina 4. Identificación Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. PNAS 104, 18217–18222 “Ley de Moore” de duplicación del número de transistores en un circuito integrado Duplica cada 18 meses Ley de Moore Procesador Intel “Ley de Moore” para la miniaturización de cultivos microbianos Se aplica al volumen de cultivo pero no al número de aislamientos obtenidos! Gefen & Balaban (2010) The Moore’s Law of microbiology – towards bacterial culture miniaturization with the micro-Petri chip. Trends in Biotechnology 26 , 345-347 Cultivo de “no cultivables”: resumen de estrategias Alain, Querellou (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583 Cultivo de “no cultivables”: estrategias futuras • Descubrimiento de autoinductores en análisis metagenómicos LuxR: activador de transcripión METREX: metabolite-regulated expression Williamson et al. (2005) Intracellular Screen to Identify Metagenomic Clones that Induce or Inhibit a Quorum-Sensing Biosensor Appl Environ Microbiol 71: 6335-6344 Bibliografía adicional McMahon, K.D., Garcia Martin, K.D., Hugenholtz, P. (2007) Integrating ecology into biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 18: 287–292 Rittmann, B.E. et al. (2006) A Vista for Microbial Ecology and Environmental Biotechnology. Environmental Science and Technology, 40, 1096–1103
