2_Diversidad.pdf
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Diversidad y metabolismo
Conceptos y Técnicas de Biotecnología
2do cuatrimestre 2012
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
FCEN-UBA
Metabolismo microbiano
vías metabólicas
genes
procesos moleculares
reciclado de elementos
Desarrollo de la diversidad de
metabolismos microbianos
Metabolismo, replicación y herencia son inseparables del contexto ambiental
interacción de
presiones selectivas
habitat
Microorganismos
presión selectiva
recursos
evolución
tiempo
3.8×109
años
Bacterias
Arqueas
Diversidad
fisiológica
Eucariotes
Clasificación metabólica según
requerimientos de C y E
Fuente de E
química
luz
Quimiotrofos
Fototrofos
Fuente de C
Comp. orgánicos
CO2
Quimioheterotrofos
Quimiolitotrofos
Aceptor final de electrones
O2
oxidativo
No O2
Comp.
orgánicos
Fermentativo
Comp.
inorgánicos
-,
2-,
NO3 SO4
Fe(III), Mn(VI)
Bacterias
oxidantes de
S, Fe y CO
Fuente de C
Comp. orgánicos
Fotoheterotrofos
CO2
Fotoautotrofos
GNB, PNB
Usa H2O para reducir CO2?
Si
No
Fotosíntesis
oxigénica
Fotosíntesis
anoxigénica
La termodinámica predice que reacciones
son energéticamente favorables
Tipos de reacción
Cambio de estado
Disolución/precipitación
Formación de complejos
Reactivos
Reacción ácido/base
Adsorción/desorción
Oxidación/reducción
Productos
!G = "!G productos # "!G reactivos
!G = !G 0 + RT
[C][D]
[A][B]
Reacciones redox, equilibrio químico
y energía libre
Reducción
A
B
A oxidado
B reducido
Oxidación
Reacciones clave para generar ATP
Reacciones redox, equilibrio químico
y energía libre
Reducción
H+
H+
molécula
orgánica
con 2H
NAD+ (carrier
de electrones)
Oxidación
molécula
orgánica
oxidada
NADH + H+
(carrier de ereducido)
Potencial de reducción: medida de la tendencia
a donar electrones en sistemas biológicos
estado
oxidado
estado
reducido
La cantidad de energía que puede ser
liberada de 2 hemi-reacciones se puede
calcular a partir de la diferencia en los
potenciales de reducción de las 2
reacciones y el número de electrones
transferidos:
!G = "nF!E
0'
'
0
Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats.
A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38
1. Termodinámica de la hemireacción
Proceso
ΔG0 (kJ/ec)
Respiración aeróbica
-125
Desnitrificación
-119
Reducción de manganeso -98
Reducción de hierro
-42
Fermentación
-27
Reducción de sulfato
-25
Metanogénesis
-23
Acetogénesis
-22
2. Presencia de constituyente
geoquímico en el ambiente
Proceso
ΔG0 (kJ/ec)
CH 2O + O2 ! CO2 + H 2O
Respiración aeróbica
-125
5CH 2O + 4NO3! + 4H + " 5CO2 + 2N 2 + 7H 2O
Desnitrificación
-119
CH 2O + 2MnO2 + 4H + ! CO2 + 2Mn 2+ + 3H 2O
Reducción de manganeso -98
CH 2O + 4FeOOH + 8H + ! CO2 + 4Fe2+ + 7H 2O Reducción de hierro
-42
3CH 2O ! CO2 + CH 3CH 2OH
Fermentación
-27
2CH 2O + SO42! + 2H + " 2CO2 + H 2 S + 2H 2O
Reducción de sulfato
-25
2CH 2O ! CO2 + CH 4
Metanogénesis
-23
2CH 2O ! CO3COOH
Acetogénesis
-22
3. Fisiología de los microorganismos
Aceptor terminal
de electrones
Aeróbico
Anaeróbico
Producto
Microorganismo
Diversidad catabólica:
quimio-organotrofos
Fermentación
Flujo de carbono
en respiración
Aceptores de
electrones
Comp orgánicos
Flujo de carbono
Transporte de eGeneración de pmf
aceptores
orgánicos
Respiración anaeróbica
Biosíntesis
Respiración aeróbica
Diversidad catabólica:
quimio-litotrofos
Transporte de eGeneración de pmf
Aceptores de
electrones
Biosíntesis
Respiración aeróbica
Respiración anaeróbica
Diversidad catabólica:
Fotótrofos
luz
Fotoheterótrofos
Compuestos
orgánicos
Fotoautótrofos
Dador
de eTransporte de
electrones
generación de pmf
y poder reductor
Biosíntesis
Biosíntesis
Diversidad metabólica y
economía del crecimiento
Los precursores, que son la fuente de
monómeros para todos los componentes
celulares, se originan en los pathways
centrales: gucólisis y ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA)
glucólisis
bacteria
ciclo del
TCA
Todos los sustratos ingresan en los pathways
centrales luego de un número limitado de
reacciones, para proveer al organismo con los
metabolitos precursores
El concepto de estrategas r y K
r
K
Respuesta a condiciones ambientales
Una clasificación ecológica de
bacterias
Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press
Una clasificación ecológica de
bacterias
oligotrofos
Acidobacteria
Betaproteobacteria
copiotrofos
Bacteroidetes
Enriquecimiento selectivo como mecanismo
de adaptación en biotecnología ambiental
Alta afinidad por sustrato limitante
Alta tasa de crecimiento
Importancia en biotecnología
Optimización de compuestos bioactivos
a lo largo de la evolución
interacción de
presiones selectivas
habitat
Microorganismos
evolución
tiempo
3.8×109
años
Bacterias
Arqueas
Diversidad
fisiológica
Eucariotes
Es importante el cultivo?
Importancia del cultivo en laboratorio
Bioprospección
Metagenómica
Pre-genómica
Secuencia
del genoma
Fisiología
en cultivo
Post-genómica
Los microorganismos no cultivables
The great plate count anomaly
Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31–440
Elementos mayoritarios en
células microbianas
Elemento
Función
C
Constituyentes principales de las
O
células en las macromoléculas y
H
otras moléculas orgánicas
N
S
Proteínas, coenzimas
P
Acidos nucleicos, fosfolípidos, ácido tecoico, coenzimas
K
Principal catión inorgánico, cofactor enzimático
Mg
Cofactor enzimático, unido a pared celular, membrana y ésteres
de fosfato, incluído ácidos nucleicos y ATP
Ca
Cofactor enzimático, unido a pared celular
Fe
Citocromos, ferredoxina, proteína Fe-S, cofactor enzimático
Na
Transporte y transducción de energía
Cl
Principal anión inorgánico
Elementos minoritarios:
cofactores
Elemento
Función
Mn2+
Superóxido dismutasa, fotosistema II
Co2+
Coenzima B12
Ni2+
Hidrogenasa, ureasa
Cu2-
Citocromo oxidasa, oxigenasa
Zn2+
Alcohol deshidrogensa, aldolasa, fosfatasa alcalina,
RNA y DNA polimerasa, arsenato reductasa
SeO32-
Formato deshidrogenasa, glicina reductasa
MoO42-
Nitrogenasa, nitrato reductasa, formato
deshidrogenasa, arsenato reductasa
WO42-
Formato deshidrogenasa, aldehído oxidoreductasa
Factores de crecimiento
aminoácidos
vitaminas
purinas y pirimidinas
Temperatura
Temperatura
Ecuación de Arrhenius
" !Ea %
k = A exp $
# RT '&
Coeficiente de temperatura Q10
Relación de las velocidades de reacción a 2 temperaturas
T2 y T1, con T2 =T1 +10
" Ea (T2 ! T1 ) %
Q10 = exp $
# RT T '&
2 1
Oxígeno
Aerobios
Facultativos
Catalasa
Superoxido dismutasa
Anaerobios
-
Anaerobios
aerotolerantes
SOD
Microaerófilos
Los microorganismos no cultivables
The great plate count anomaly
Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial
habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346.
Por qué los microorganismos se
resisten a crecer en cultivo?
(i) El cultivo en el laboratorio destruye interacciones presentes
en ambientes naturales
(ii) Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de cultivo
(iii) Infecciones por fagos
(iv) La alta concentración de sustrato necesaria para obtener
crecimiento detectable en el laboratorio puede ser tóxica
(v) Las prácticas de laboratorio suelen ignorar los primeros
ciclos de crecimiento en medio líquido que aparentemente no
muestran crecimiento, debido a la falta de buenos métodos
de detección de densidad celular y falta de paciencia
Efecto del medio de cultivo y del
tiempo de incubación
Gellan como agente solidificante:
Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005)
Appl Environ Microbiol, 71, 826–834
Uso de aceptor de electrones
alternativos
Costa del Mar de Norte
Alta eficiencia de cultivo: 23% del número total de células
en los 2 m superficiales
Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors and
Substrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830
Uso de aceptor de electrones
alternativos: reductores de sulfato
Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulfate as electron acceptor (2007) en Sulfate Reducing Bacteria, Barton
& Hamilton, eds. Cambridge
Uso de aceptor de electrones
alternativos: sedimentos anóxicos
Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266
Uso de compuestos que median
comunicación entre bacterias
OHHL: N-(oxohexanoyl)-dlhomoserine lactone
Monómero/óxico
Polímero/óxico
BHL: N-(butyryl)-dl-homoserine
lactone
cAMP: AMP cíclico
Monómero/anóxico
Polímero/anóxico
Bruns et al., 2002
Ver también Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton
(2003) Appl Environ Microbiol, 69, 1980–1989
Cultivo y detección de
microorganismos
• Mínima cantidad de nutrientes
• Incubaciones largas (30d)
• Protección de peróxidos
• Ácidos húmicos
• QS (AHL)
• aeróbico
• 1-2% O2
• anóxico
• 5% CO2
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
Cultivo y detección de
microorganismos
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
Cultivo y detección de
microorganismos
Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,
4748-4755
Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel
+
Dilución de células
agarosa (40°C).
2,200 rpm
suspensión aceite-bacteria en hielo con a 1,100 rpm
107 microgotas de gel (GMDs)
10% ocupadas por una única célula encapsulada
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
Separación celular por citometría
de flujo
Cultivo de microorganismos en
microgotas encapsuladas en gel
Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686
Cultivo de microorganismos GMDs
problemas y soluciones
Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583–594
Cultivo de microorganismos marinos
en cámaras de difusión
membrana
sedimento
agar
La mayoría es invisible a simple vista
La mayoría no crece luego de 2-3 pasajes
Kaeberlein et al., Isolating Uncultivable Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,
1127-1129
Cultivo de microorganismos marinos
en cámaras de difusión
Los mútiples pasajes en cámaras de difusión permiten la adaptación al cultivo in vitro
Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007)
Appl Environ Microbiol, 73, 6386–6390
Cámaras de difusión en formato
masivo: Ichip
Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of Uncultivable Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol,
76, 2445–2450
Otros métodos
con membranas
Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3,
1261-1264
Microplaca de Petri: un millón de
cámaras de cultivo
óxido de
aluminio poroso
7 x 7µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Microplaca de Petri: un millón de
cámaras de cultivo
chip de 8x36 mm
recubierto en Pt
180.000 cámaras
20µm x 20µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Los chips pueden ser utilizados para
recuento de UFC
Imagen de microscopio invertido mostrando el
crecimiento de L plantarum (círculos claros) en
cámaras de 20 x 20 µm
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Screening de 200.000 aislamientos
basados en el metabolismo de un
organofosforado
1. Incubación 6 días
2. Recuento: 200.000 c
3. Screening
fluorescein 3,6-diphosphate
fluoresceina
4. Identificación
Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.
PNAS 104, 18217–18222
Ley de Moore de duplicación del número
de transistores en un circuito integrado
Duplica cada 18 meses
Ley de Moore
Procesador Intel
Ley de Moore para la miniaturización de
cultivos microbianos
Se aplica al volumen de cultivo pero no
al número de aislamientos obtenidos!
Gefen & Balaban (2010) The Moore s Law of microbiology – towards bacterial culture miniaturization with the micro-Petri chip.
Trends in Biotechnology 26 , 345-347
El crecimiento microbiano puede determinarse
sin el uso de técnicas moleculares
Zengler, K. Central Role of the Cell in Microbial Ecology (2009) Microbiol Mol Biol Rev, 73: 826-834
Cultivo de no cultivables : resumen
de estrategias
Alain, Querellou (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583
Cuanto conocemos de la
biología de procariotas?
35
30
25
20
15
10
5
0
Almacenamiento
información
y procesamiento
de información
Procesos Metabolismo Funciones no
Procesos
No
celulares Metabolismo
caracterizadas
celulares
caracterizadas
Estimaciones de la diversidad
microbiana
La diversidad genética en 1 g de suelo coresponde
aproximadamente 4,000 genomas diferentes
61
Torsvik et al. 1990 Appl. Environ. Microbiol. 56: 782-787
Niveles de organización biológica
Comunidad
Población
Organismo
Comunidad
microbiana
Población
microbiana
Microcolonia
Organo
Tejido
Colonia
Célula
Célula procariota
Macromolécula
Macromolécula
62
Panikov, N.S. 2010 Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (Wang, Ivanov, Tay, Hung eds.) pp 121-192. Humana Press
Un continuo de especies a lo largo
de gradientes ambientales
Abundancia de especies
Factores
ambientales
bajo
gradiente de factor ambiental
alto
pH
Intensidad lumínica
Salinidad
Oxígeno disuelto
Potencial redox
Nutrientes
Temperatura
Mínimo ecológico
63
Qué es una especie bacteriana?
Otros términos:
Ecotipo: definido por el ambiente
Filotipo: definido por el grupo filogenético
Ribotipo: definido por la secuencia del ARN ribosomal
Unidad Taxonómica Operacional (OTU)
Science (2009) 323, 741-746
64
Cuanta diversidad?
Es improbable que el muestreo sea 100% efectivo
Estimamos el total basado en el subset muestreado
65
Cuanta diversidad?
Muestrear
Reconocer (diferenciar)
Identificar
66
Indices de diversidad
Index
Discriminant
ability
Sample
Size
Sensititivy
Richness,
Evenness,
Widely
Dominance
Calculation
used?
Sensitivity
to abund
models
Log a
Good
Low
Richness
Simple
Yes
N (?)
Log Normal l
Good
Moderate
Richness
Complex
N
Yes
Q
Good
Low
Richness
Complex
N
N
S
Good
High
Richness
Simple
Yes
N
Margalef
Good
High
Richness
Simple
N
N
Shannon
Moderate
Moderate
Richness
Intermediate
Yes
N
Brillouin
Moderate
Moderate
Richness
Complex
N
N
McIntosh U
Good
Moderate
Richness
Intermediate
N
N
Simpson
Moderate
Low
Dominance
Intermediate
Yes
Yes
Berger-Parker
Poor
Low
Dominance
Simple
N
N
Shannon E
Poor
Moderate
Evenness
Simple
N
N
Brillouin E
Poor
Moderate
Evenness
Complex
N
N
McIntosh D
Poor
Moderate
Dominance
Simple
N
N
= Desirable Traits in an Index!
67
Magurran, A.Ecological diversity and its measurements
1988 Princeton University Press
Análisis pre-genómico:
basado en 16S rRNA
Universal
Regiones conservadas y variables
Útil sobre un amplio rango de distancias filogenéticas
Cambio sobre inserciones o deleciones
Tamaño adecuado
68
Análisis pre-genómico:
el ciclo completo del 16S rRNA
1995
{
DGGE/TGGE
t-TFLP
SSCP
ARISA
ARDRA
Bibliotecas de clones
69
Biblioteca de clones
Extracción
de DNA
Generación
de árboles
filogenéticos
Amplificación
por PCR
Alineamiento con
secuencias de
bases de datos
Purificación
de amplicón
Secuenciación
de insertos
Clonado
Extracción de
plasmidos
Tranformación
en E coli
Preparación
de libraries
70
decano
petróleo
crudo
pristano
mezcla de
alcanos
hexadecano
naftaleno
71
72
McKew et al., Environmental Microbiology (2007) 7, 165–176
Electroforesis en geles con gradientes
desnaturalizante (DGGE)
73
Electroforesis
consludge
gradientes
Dynamic natureen
of geles
activated
was
demonstrated
with DGGE(DGGE)
desnaturalizante
74
Dynamic nature of activated sludge was
demonstrated de with DGGE
fibras
Water Research (2010) 44 1785-1796
75
Dynamic nature of activated sludge was
demonstrated de with DGGE
Water Research (2010) 44 1785-1796
benceno
MTBE
76
Fingerprinting:
t-RFLP
77
78
Reactor I, pH 2.2
Reactor II, pH 4.0-4.5
79
Limitaciones del análisis
basado en 16S rRNA
T a b l e1 . Examples of the unique and disparate phenotypiccharacteristics of closely related organisms in the Proteobacteria
Organism
Aerobicity
I d e n t i f y i nm
ge t a b o l i s m
Fermentation
Electron
acceptors
utilized
Ferribacterium
limneticum
Strict anaerobe
Fe(III) reduction
Non-fermentive
Ferric iron, nitrate,
fumarate
Rhodocyclustenuis
Facultative anaerobe
Phototrophy
Ferments storage
polysaccharides
Oxygen
Strain SIUL
Facultative anaerobe
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, chlorate,
perchlorate
Strain RCB
Facultative anaerobe
Chlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate
Strain WD
Microaerophile
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate,
chlorate
Magnetospirillum
gryphiswaldense
Microaerophile
Magnetosome production
Not determined
Not determined
80
Achenbach and Coates., 2000 ASM News 65: 3697-3704
Asociar identidad a función:
Stable Isotope Probing
• Marcar DNA
• Extraer DNA
• Separar fracciones livianas y pesadas por ultracentrifugación
• Amplificar DNA (PCR)
• Analizar usando tecnicas como DGGE, T-RFLP, clonado y sequenciación
Muestra
ambiental
Extracción de DNA
Fraccionamiento
(Ultracentrifugacion)
Microorganismos responsables de la
degradación de un contaminante
81
Radajewski et al. Nature 2000 403:646-9
RNA Stable Isotope Probing
Cultivo en MM + fenol-13C6
24 h
P. putida
P. chlororaphis
48 h
Crecimiento en fenol
P. putida
P. chlororaphis
+
-
82
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Polaromonas naphthalonivorans
PNAS November 11, 2003 100: 13591–13596 "
RNA vs DNA
• más abundante
• mayor turnover
• no depende de la
replicación
84
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Análisis de diversidad funcional
utilizando RNA-SIP
A
B
B
A
Pseudomonas
Acidovorax
Acidovorax
El reactor
más inestable tiene mayor diversidad
B
de grupos degradadores de fenol?
A
85
Manefield et al., 2005 Environ. Microbiol. 7: 715-722
Limitaciones de SIP
•
Necesita altas concentraciones de sustrato (bias de
cultivo)
•
Largos tiempos de incubación
- Enriquecimiento de poblaciones minoritarias
- Condiciones ex-situ no refleja necesariamente los
ambientes in situ
86
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Fluorescence in situ hybridization
FISH
87
FISH revela alta diversidad en
barros activados
88
Amann et al., 1996 In Situ Visualization of High Genetic Diversity in a Natural Microbial Community J. Bacteriol. 178: 3496–3500
Práctica de FISH:
problemas y soluciones
89
Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol
2003, 6:302–309
Práctica de FISH:
problemas y soluciones
90
Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol
2003, 6:302–309
Microautoradiografía (MAR)
• Se expone la emulsión a la
radioactividad y se revela
• Las células que degradan el
sustrato aparecen como
puntos negros, que pueden
ser contados
• El número de células totales
se determina con DAPI o NA
91
Ito et al., Appl. Environ. Microbiol., 68, 356-364, 2002
Microautoradiograpía- FISH
MAR-FISH
92
Combinación de técnicas
93
Limitaciones de MAR-FISH
• No se pueden detectar varios elementos simultáneamente
• No ofrece buena resolución celular en agregados densos
• Requiere el uso de isótopos radioactivos
• Algunos elementos no posees isótopos con vidas medias
apropiadas (e.g. O y N)
• La cuantificación de incorporación es complicada
• Las células fijadas y cubiertas por emulsión no se pueden
manipular para hacer genómica de células individuales
94
Espectroscopía Raman
Diagrama de Jablonski
A mayor masa mayor energía
del desplazamiento de
Stokes
fenilalanina
95
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Microscopía Raman confocal
Imagen 100X
Espectro típico de
una célula individual
96
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
El corrimiento al rojo provocado por
el uso de 13C se puede calibrar
97
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Las diferencias espectrales se deben al
% de 13C-glucosa en el medio
13C
98
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Degradación de naftaleno en
un acuífero
Control estéril
13C-naftaleno
Formación de
salicilato
12C-naftaleno
99
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Degradación de naftaleno en un
acuífero analizado por SIP-DGGE
Acidovorax : alta afinidad
revelado en SIP-DGGE
P. fluorescence: baja afinidad
obtenida por cultivo
100
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Degradación de naftaleno en un
acuífero analizado por SIP-Raman
bacteria total
Pseudomonas sp
Acidovorax sp
FISH
101
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Secondary Ion Mass Spectrometry
(SIMS)
102
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Secondary Ion Mass Spectrometry
(SIMS)
Comunidad microbiana degradadora de fenol en suelo
103
DeRito,C. M. Appl. Environ. Microbiol 2005, 71, 7858-7865
SIMSISH usando NanoSIMS
El reactivo fluorescente usado en FISH es reemplazado por una
molécula conteniendo isótopos estables o elementos raramente
presentes en la biomasa, e.g. halógenos
E. coli cultivadas en un medio con 99% de 13C mezcladas
con B. subtilis con abundancia isotópica natural.
E. coli se pre-hibridó con la sonda I6-Eub338-Cy3
Imagen secundaria 12C Imagen secundaria 13C
Imagen secundaria 127I Imagen secundaria 32S
Biomasa cont proteína
Li et al., Environ. Microbiol 2008, 10, 580-588
A great challenge now lies in integrating this new knowledge into conceptual frameworks that
enable us to predict the consequences of manipulating environments in specific ways for
ecosystem function. Integrating the knowledge acquired through the methods reviewed here should
guide us in resolving issues such as how to manipulate activated sludge, contaminated soil or
decentralised composting systems to improve ecological services and minimise the negative
impacts of human activity. Other issues to resolve include how to increase the activity of phosphate
accumulating bacteria, reduce bulking by filamentous bacteria, achieve more efficient denitrification
and fatty acid and protein removal in wastewater treatment plants. Likewise, important questions to
explore are for example: can we enhance in situ biodegradation of pollutants by facilitating or
inhibiting specific microbial taxa? Can we favour specific methanogens over sulphate or nitrate
reducing clades in anaerobic digestors? The vast amount of information gained from applying these
sophisticated methods will most certainly result in addressing these issues and questions in an
effective way.
Gutierrez Zamora + Manefield, 2010 An appraisal of methods for linking environmental processes to specific
microbial taxa Rev Environ Sci Biotechnol 9:153–185
105
Bibliografía adicional
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