Holoenzima = Apoenzima + Cofactor

ENZIMAS
1. Introducción
2. Las enzimas como catalizadores
3. Nomenclatura y clasificación de enzimas
4. Cofactores enzimáticos
5. Modelos de actuación de las enzimas
6. Cinética enzimática
7. Inhibición enzimática
8. Reacciones multisustrato
9. Regulación enzimática
1. Introducción
La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente
específicos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los
procesos metabólicos están catalizados por enzimas y la capacidad catalítica se
considera, junto con la capacidad de autorreplicación, una de las características
fundamentales de la vida. Con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de
RNA catalítico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son proteínas.
El nombre de enzima ("en la levadura") no se empleó hasta 1877, pero mucho antes
ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en muchos
procesos. Así en 1850, Louis Pasteur concluyó que la fermentación de azúcar en
alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llamó “fermentos”, que él
consideraba inseparable de las células de levadura vivas. En 1897, Büchner,
consiguió extraer las enzimas que catalizaban la fermentación alcohólica de las
células de levadura, terminando así con la teoría vitalista. No obstante hubo que
esperar hasta 1926, cuando Sumner consiguió purificar y cristalizar por primera vez
una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se
conocen más de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en
forma pura. Se utilizan potentes técnicas de purificación y secuenciación, técnicas
de difracción de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y técnicas de
mutagénesis dirigida para conocer más sobre su funcionalidad y sus mecanismos de
actuación.
1
2. Las enzimas como catalizadores
La función principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones
de los seres vivos; como tales catalizadores tienen ciertas características que vamos
a estudiar a continuación. Todas las reacciones químicas tienen lugar porque cierta
fracción de la población de moléculas reactantes poseen la suficiente energía como
para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy
elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los
productos. Este estado de transición reside en la cima de la barrera energética que
separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se
observa el diagrama de energía para una reacción química, no catalizada y
catalizada, donde la energía libre de activación es la cantidad de energía necesaria
para llevar todas las moléculas de un mol de sustancia, a una temperatura
determinada, al estado de transición.
Figura 1.
Evolución energética de una reacción química. Se observa
la diferencia energética entre los estados de transición de las
reacciones catalizada y no catalizada.
Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad
de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que
provoca un incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar
un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio
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activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la
reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y
puede ser de nuevo utilizado.
La Tabla 1 muestra una comparación de las energías de activación para la
descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un
catalizador. En ella se puede apreciar cómo el catalizador enzimático baja aún más
la barrera energética que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar
el estado de transición. Esta es una característica común de las enzimas. Su alto
poder catalítico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cuál
puede ser absoluta para un único sustrato o relativa, cuando permite la reacción de
compuestos diferentes pero con una estructura similar.
Tabla 1
Descomposición enzimática del agua oxigenada. comparación de
las energías de activación para la descomposición del peróxido de
hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador
Reacción
Catalizador
Descomposición
de H2O2
Ninguno
20
18
Fe2+
22
10
Catalasa
22
1,7
Temperatura
(ºC)
Energía
(Kcal/mol)
La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada célula
contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas
combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos compuestos
pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera
específica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la
célula viva.
Además de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos características que
diferencian a las enzimas de los catalizadores químicos, son que las enzimas
pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad.
3
3. Nomenclatura y clasificación de las enzimas
Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del
sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por
ejemplo la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrólisis
de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en función
del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa cataliza
la oxidación del la Gliceraldehído-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho
tiempo y mantienen su nombre, sin dar información alguna del sustrato o la reacción
que catalizan (tripsina).
No obstante existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en
6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases:
1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción)
2: Transferasas (transfieren grupos funcionales)
3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis),
4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces)
5: Isomerasas (reacciones de isomerización)
6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).
A cada enzima se le asigna un número con cuatro componentes. Los tres primeros
indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el último es un número
de orden. Así, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la
oxidación de etanol a acetaldehído, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa
como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificación internacional de las enzimas
en los seis grupos antes citados.
Tabla 2
Clasificación internacional de enzimas.
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4. Cofactores enzimáticos
La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como
proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no
proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una
molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de
ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión
metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre
de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un
sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica,
coenzima). La Tabla 3 muestra una relación de iones metálicos que actúan como
cofactores
de enzimas.
Tabla 3
Iones metálicos como cofactores.
La Tabla 4 muestra algunos de los coenzimas más habituales en la catálisis
enzimática. Tabla 4
Algunos coenzimas mayoritarios en catálisis enzimática.
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El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima.
Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva
catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima.
HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR
Centro activo
Apoenzima
Holoenzima
Cofactor
En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo
puente para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad
enzimática (conformación).
Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su
estructura, alguna vitamina (sustancias orgánicas que, en cantidades mínimas, son
vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la dieta de
algunas especies) o molécula derivada de ella. Los coenzimas actúan por lo general
como transportadores intermedios de átomos específicos o de electrones.
5. Modelos de actuación de las enzimas
Para explicar la actividad catalítica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo
general, en dos etapas:
S + E
ES
P + E
En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S), para formar
el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta
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dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para
reaccionar con otra molécula de sustrato. Por lo general, la molécula de enzima es
mucho mayor que la del sustrato por lo que sólo una pequeña parte de la enzima
está implicada en la formación del complejo; esta región que interacciona con el
sustrato y en la que tiene lugar la reacción, se denomina sitio activo de la enzima.
El sitio activo es una región tridimensional de la enzima con una distribución de los
grupos única para posibilitar la unión a su sustrato específico. Dichos grupos del
enzima no tienen por qué ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la
proteína y reciben el nombre de centros catalíticos.
El modelo más conocido sobre el mecanismo de reacción de las enzimas es el de
Fischer, quien propuso que la molécula de sustrato se adapta al centro activo de la
enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir,
que tienen una relación estructural complementaria (Figura 2). No obstante, esta
hipótesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura
prediseñada para el sustrato, en caso de que sea reversible el proceso dicho
debería estar perfectamente diseñado para que también encaje el producto de la
reacción. De la misma forma, la teoría de la llave-cerradura tampoco explica bien el
fenómeno de la inhibición enzimática.
Figura 2.
Modelos de acción enzimática. Modelo llave-cerradura de
Fischer.
Otra hipótesis más aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste
inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una
cavidad geométricamente rígida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe
tener una disposición espacial, precisa y específica, de ciertos grupos de la enzima
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que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con
él (Figura 3).
Figura 3.
Modelos de acción enzimática. Modelo de ajuste inducido de
Koshland.
Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato,
mediante un mecanismo de distorsión, se activan los enlaces que hay que romper y
se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del
producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para
comenzar de nuevo el proceso catalítico. La Figura 4 muestra el caso de una
enzima (carboxipeptidasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella
se puede ver como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalíticos
(Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformación inicial que se
modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES.
Figura 4.
Modelo de ajuste inducido de Koshland. Carboxipeptidasa.
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6. Cinética enzimática.
Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a
las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas
muestran (además del fenómeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo
característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la
saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros
activos de todas las moléculas de enzima.
Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima
no es sencillo si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye
según avanza la reacción. Una simplificación en los experimentos cinéticos consiste
en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la
disminución de sustrato será mínima y ésta podrá considerarse, por tanto, casi
constante. La Figura 5 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato
sobre la velocidad inicial de la reacción catalizada por un enzima.
Figura 5.
Cinética enzimática. Modelo de Michaelis-Menten.
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En la cinética enzimática de la Figura 5 se distinguen tres fases:

Para una concentración baja de sustrato, la velocidad de la reacción es
directamente proporcional a la concentración del sustrato (relación lineal), la
cinética es de primer orden.

Para una concentración alta de sustrato, la velocidad de la reacción se hace
prácticamente constante e independiente de la concentración de sustrato, la
cinética se considera de orden cero.

Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja
de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cinética mixta.
Este comportamiento es característico de la mayoría de las enzimas y fue estudiado
por Michaelis y Menten en 1913. La velocidad de una reacción catalizada nos indica
la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el
Sistema Internacional se designa por “U” (unidad de actividad enzimática) y
corresponde a los µmoles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los µmoles de
producto formado en 1 min.
1 U  µmol S/min  µmol P/min
La curva que expresa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad
inicial tiene la misma forma para la mayoría de las enzimas; se trata de una
hipérbola rectangular, cuya expresión algebraica viene dada por la Ec. MichaelisMenten.
Los términos Vmax
(velocidad máxima) y Km
(constante
de
Michaelis)
son
dos
parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse
experimentalmente. La velocidad máxima se obtiene cuando la velocidad de
reacción se hace independiente de la concentración de sustrato. Este valor depende
10
de la cantidad de enzima que tengamos. La K m nos indica la concentración de
sustrato a la cuál la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, este
parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de
cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La K m también indica la
afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la
Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para
alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del
enzima hacia ese sustrato.
La ecuación de Michaelis-Menten puede deducirse matemáticamente haciendo la
aproximación del estado estacionario, según esta aproximación la concentración del
complejo ES es constante en el estado estacionario y por lo tanto las velocidades de
formación y destrucción del complejo ES son iguales. Además, asumimos que el
paso limitante de la reacción es el segundo y por lo tanto la velocidad de la reacción
es: Vo=K2 ES.
Velocidad formación del complejo ES = Velocidad destrucción del complejo ES
K1ES= K-1 ES + K2ES
K1ES= (K-1 + K2 ) ES
La concentración de enzima libre será igual a la concentración total de enzima
menos lo que está unido al sustrato. E= Et -ES, así que:
K1 Et S- K1 ES S = (K-1 + K2 ) ES
K1 Et S= (K-1 + K2 + K1S) ES
Despejando ES se obtiene un término constante formado por las tres constantes e
igual a la constante de Michaelis (Km). El término K1 Et  será precisamente la V
(velocidad máxima) cuando todo el enzima esté unido al sustrato formado un
complejo ES, o sea, cuando la enzima esté saturada por el sustrato, es decir:
K1 Et =Vmax.
De modo que la forma final de la ecuación de Michaelis-Menten es:
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A partir de esta ecuación podemos explicar matemáticamente las tres fases de la
curva de Michaelis.

A baja [S (es decir, si Km >>> [S) el término Km+[S podemos aproximarlo a
la Km, quedando un expresión del tipo:
V = k’ [S
Esta es una cinética de primer orden, que se caracteriza por una variación lineal de
la V respecto al tiempo.

A altas [S (es decir, Km<<<<[S) despreciaríamos Km frente a [S, con lo que
V = Vmax (que sería constante); la cinética es de orden cero y se habría
alcanzado la saturación por sustrato.

El tramo intermedio, en el que la [S  Km correspondiente a una cinética de
orden mixto y se ajusta a la ecuación de Michaelis.
En muchos casos es de vital importancia conocer estos parámetros cinéticos. En
principio, podrían obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis
Menten, pero existen métodos gráficos más fiables que facilitan el cálculo preciso de
la Km y la Vmax. Los cálculos se hacen en base a transformaciones matemáticas de
la ecuación de Michaelis; una de las expresiones más utilizadas es la representación
de Lineweaver-Burk, también conocida como de dobles inversos (Figura 6). En esta
forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/S, obteniéndose una recta cuya
intersección con el eje X es –1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente
Km/Vmax.
Figura 6.
Cinética enzimática. Representación de Lineweaver-Burk.
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7. Inhibición enzimática
Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad
catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática. A estas sustancias se
las denomina inhibidores enzimáticos. Teniendo en cuenta que las reacciones
químicas en la célula están catalizadas por enzimas, es fácil intuir el papel de
muchos inhibidores enzimáticos que actúan como fármacos, antibióticos o
conservantes; otros pueden ser tóxicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina
(acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de
prostaglandinas, implicadas en la producción del dolor.
Se conocen dos tipos principales de inhibición: la reversible y a la irreversible. La
primera implica una unión “no covalente” del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede
revertirse. En la inhibición irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma
“covalente” y permanente.
Inhibición reversible: los distintos modelos de inhibición reversible implican todos
la unión no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos
por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que
afectan a la cinética de la reacción. Entre ellos están la inhibición competitiva, la
acompetitiva y la no competitiva.

El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato,
con quien compite por el sitio activo de la enzima.
E+S
K1
ES
K2
E+P
K-1
ES+I
Ki
EIS
Como consecuencia, aunque la velocidad máxima no se altera, para
alcanzarla sería necesario poner más cantidad de sustrato en el medio de
reacción, lo que se refleja en la correspondiente curva de Michaelis como un
aparente aumento de la Km (la enzima en presencia del inhibidor perdería
afinidad por el sustrato). La representación de dobles inversos (Figura 7)
permite observar la variación de la Km.
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Figura 7.
Inhibición competitiva. Cálculo de parámetros cinéticos
mediante la representación de dobles inversos.
La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentración respecto
a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor éste bloqueará los centros
activos de las moléculas de enzima, resultando una inhibición total. No
obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que
desplazaría totalmente al inhibidor.

El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al
centro activo, pero sólo en el caso de que ésta esté unida al sustrato
formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su
actividad catalítica.
E+S
K1
ES
K-1
ES+I
14
Ki
EIS
K2
E+P
Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporción, lo que se
manifiesta en la representación de dobles inversos como rectas paralelas y
por lo tanto con la misma pendiente (Figura 8).
Figura 8.
Inhibición acompetitiva. Cálculo de parámetros
cinéticos mediante la representación de dobles inversos.
Se observa cómo se produce, aparentemente, una disminución de la V max y
un incremento de la Km.

El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre como
con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima.
E+S
K1
ES
K-1
E+I
ES+I
15
Ki
Ki2
EI
EIS
K2
E+P
Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima
por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como
puede observarse en la representación de dobles inversos (Figura 9).
Inhibición no competitiva
1/V
Con I
Sin I
1/V ’max
Figura 9.
Inhibición no competitiva. Cálculo de
parámetros
cinéticos
mediante
la
representación de dobles inversos.
1/Vmax
- 1/Km
0
1/[S]
En la inhibición irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la
inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son
sustancias tóxicas naturales o sintéticas. Se trata de sustancias que reaccionan con
algún grupo funcional importante para la catálisis, bloqueándolo e impidiendo que la
enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interacción se produce a través
del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal
es el caso del gas Sarín, que inhibe irreversiblemente enzimas implicadas en la
transmisión del impulso nervioso y su inhalación causa parálisis rápida de las
funciones vitales.
E+S
K1
ES
K2
E+P
K-1
E+I
EI
En la inhibición irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observaría
una situación similar a la inhibición competitiva, una disminución de la V max y un
aumento aparente de la Km, si bien el proceso sería completamente irreversible por
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sustrato, incapaz éste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibición
enzimática por modificación covalente constituye además una importante forma de
regulación metabólica, como veremos en próximos apartados.
8. Reacciones multisustrato
En este capítulo hemos estudiado reacciones del tipo S-P, un mecanismo
relativamente simple con un solo sustrato que podría ajustarse a reacciones
catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es
importante tener en cuenta que la gran mayoría de las reacciones son multisustrato
y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o más sustratos y libera
múltiples productos, el orden de los pasos para a ser una característica importante
del mecanismo de reacción. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de
reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se
obtengan dos productos P1 y P2.
a) Unión ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes
de que el segundo sustrato pueda unirse.
b) Unión aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos
puede ser el primero en unirse a la enzima.
c) Mecanismo “ping-pong”: en este caso primero se une un sustrato, se libera el
primer producto, y a continuación se une el segundo sustrato para así liberar
el segundo producto.
9. Regulación enzimática
Una característica que diferencia las enzimas de los catalizadores químicos
convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede
ser más o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulación:

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Nivel de síntesis: que haya más o menos moléculas de la enzima (ya lo
veremos).

Nivel de actividad: que las moléculas de enzima existentes estén más o
menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrínsecos a la enzima,
pH, Tª, [S, [I, o por factores intrínsecos a la propia enzima; en este caso
hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza
tienen mecanismos especiales de regulación. Están especializadas en
regularse respondiendo de forma muy sensible a señales externas.
En la célula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos
enzimáticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la
velocidad de toda la ruta. La modulación de las enzimas reguladoras ocurre
mediante diferentes mecanismos:




18
Enzimas alostéricas. Funcionan mediante la unión reversible no covalente
de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede
ser una activador (modulación positiva) o un inhibidor (modulador
negativo) y ser el propio sustrato de la reacción (alosterismo homotrópico)
o ser otra sustancia (alsoterismos heterotrópico). Normalmente se trata de
enzimas multiméricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se
encuentran en distintas subunidades.
Enzimas interconvertibles Por modificación covalente reversible, como por
ejemplo por fosforilación/defosforilación o modificación redox.
Mediante proteínas reguladoras que se unen a la enzima.
Mediante la eliminación proteolítica de pequeños segmentos peptídicos
(esto es irreversible).