Introducción a la Biología Celular y Molecular IBCM: turno tarde Repaso de Soluciones Químicas (Cortesía del turno mañana) INTRODUCCIÓN Cuando una solución es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una solución madre o stock, que se encuentra en una concentración mayor de la que se utiliza. A partir de ésta, se realiza una dilución para preparar la solución a la concentración de uso. * Se dice que una solución es “N X” (N por) cuando esta concentrada N veces respecto de la de uso corriente. Ej.: “PBS 5X” es una solución stock de PBS 5 veces más concentrada que el PBS de uso normal (ó “1X”). Puede prepararse PBS 1X haciendo una dilución 1/5 de la solución stock (para 500 ml: 100 ml PBS stock + 400 ml H2O bidestilada.) * A veces es necesario diluir “mucho” una solución concentrada (Ej.: 1/104 , 1/106). En estos casos se suelen hacer diluciones sucesivas o “diluciones seriadas” para disminuir los errores de medición al pipetear volúmenes muy pequeños. Ej.: Preparar 1 ml de una solución de un anticuerpo que contenga 0.1 µg/ml, a partir de una solución stock de 1 mg/ml. Debería realizarse una dilución 1/10000 (1/104) es decir pipetear 0.1 µl stock + 999.9 µl buffer de dilución. Conviene entonces hacer diluciones sucesivas que, con menor error de pipeteo, permitan alcanzar la concentración buscada. Ej. 4 diluciones sucesivas: 1/10 . 1/10 . 1/10 . 1/10 = 1/10000. Tener en cuenta: Las soluciones diluidas se expresan a menudo en "mili...", "micro...", "nano...", "pico...", "fento..." . Ej: 10 µM, 1 pg/ml, etc. Recordar: 1 mmol = 10-3 moles (aplicable a otras unidades: gramo, etc.) 1 µmol = 10-6 moles 1 nmol = 10-9 moles 1 pmol = 10-12 moles 1 fmol = 10-15 moles Formas de expresar concentraciones La masa de sustancia que corresponde a un mol de moléculas de esa sustancia es lo que conocemos como masa molar o peso molecular PM y se expresa en gramos. Ej.: la masa molar del oxígeno O2 es de 32 g/mol y del agua 18 g/mol. Pero OJO! no confundir con la masa molecular relativa Mr, que aunque coincide numéricamente con M no lleva unidades de masa, sino que, justamente es relativa y nos dice cuantas veces más pesada es una molécula de una sustancia respecto de la unidad de masa atómica (u.m.a.), ó de 1 Dalton (Da), que corresponde al átomo hidrógeno. Así, la Mr del agua es 18 u.m.a. o 18 Da, o bien, 18 veces más pesada que un átomo de hidrógeno. Unidades de concentración • % m/m: Por ciento masa en masa, g de soluto por cada 100 g de solución (SN) (soluto + solvente). -1- Introducción a la Biología Celular y Molecular • • • • • % m/v: Porciento masa en volumen, g de soluto por cada 100 cm3 o 100 ml de SN. % v/v: Porciento volumen en volumen, ml de soluto por cada 100 ml de SN. M: Molaridad, Nº de moles de soluto por cada 1 litro o 1000 cm3 de SN. m: Molalidad, Nº de moles de soluto por cada 1 Kg de solvente. N: Normalidad, Nº de equivalentes de un ácido o de una base por cada 1 litro de SN. De acuerdo a lo que vimos antes: Una solución 2 M de HCl es lo mismo que una solución 2 N, mientras que una solución 4 M de ácido sulfúrico será lo mismo que una solución 8 N para este ácido. OBJETIVOS Familiarizarse con las unidades mas utilizadas en biología molecular y ser capaces de intercambiar ágilmente las distintas unidades. Familiarizarse con el material de uso corriente en el laboratorio, la preparación de soluciones y el empleo de diluciones a partir de soluciones concentradas. DESARROLLO DEL TP Se partirá de una solución stock de colorante (por ejemplo: azul de toluidina o azul de metileno) de concentración conocida. a) Desaparición del color: Cada grupo recibirá 1 ml de solución stock y, realizando diluciones seriadas, deberá determinar la dilución a la cual desaparece el color y la concentración del colorante (en mg/ml) en dicha dilución. b) Dilución incógnita: A cada grupo se le entregará 1 ml de una dilución incógnita. Deberá averiguar a qué dilución corresponde, por comparación con una curva de diluciones conocidas preparadas a partir de la solución stock. Importante: Repasar las diferentes formas de expresar la concentración de una solución y cómo interconvertirlas (molaridad, normalidad, % p/v, % p/p). Problemas de Diluciones 1) a. b. c. d. Cuantos µl representan los siguientes volúmenes? 0,05 l 0,234 ml 2,5 x10 –4ml 98,5000 l 2) Exprese cada uno de los siguientes valores de concentración en μg/ml, ng/ml, ng/ul, ug/ul: a. 234,20 mg/ml b. 48,56 mg/l c. 6,243 x106 g/ml -2- Introducción a la Biología Celular y Molecular d. 8,2 x10-8 pg/ml 3) Si se toman 50 ml de una solución NaCl 0,4M y se llevan a un volumen final de 1l ¿Cuál es la concentración final? 4) ¿Qué volumen de HCl 6M debe usarse para preparar 500 ml de una solución de HCl 5 mM? 5) ¿Cuál sería la concentración final de una solución preparada al diluir 45,0 ml de KOH 4,2 M en un volumen final de 300 ml? 6) Si se cuenta con una solución 2,2 M de NaCl, ¿Cuántas diluciones seriadas 1/10 deben realizarse para llegar a una solución de concentración 22 μM? Indique que volúmenes utilizaría si las diluciones se realizan en eppendorfs con Vfinal=1,5ml. 7) Su jefe le entrega 10ml de un cultivo de E. coli (bacterias) con 8.4 x 107 células/ml y le pide que prepare una 100 ml de una suspensión que contenga menos de 100 células/ml, ¿qué diluciones debe realizar para llegar al resultado deseado si en cada tubo el Vfinal=100ml? 8) Usted posee un eppendorf con 1 ml de una solución 4.3 x 104 células y debe producir una solución que contenga 43 cel/ml. ¿Qué diluciones seriadas haría si en los tubos sólo puede llegar a un Vfinal=1ml y tuviese que pasar de cada solución a la siguiente no menos de 5 µl? 9) Usted posee una sustancia coloreada y desea realizar una curva de calibración con al menos 4 puntos para el rango de concentraciones 0,1 mM a 0,2 M. Si ud. posee una solución 2,5 M y sabe que la ε490 = 50 M-1cm-1 a. Indique qué diluciones seriadas haría para obtener esos puntos. b. ¿Cuál será la Absorbancia a 490nm de cada uno de los puntos que ud. eligió? 10) Las β-lactamasas son una familia de proteínas generadas por algunos microorganismos, que les confieren resistencia a los antibióticos β-lactámicos. Una de ellas en particular tiene un peso molecular (MW) de 29374 g/mol y ε280=24750 M-1cm-1. Al medir absorbancia en una cubeta estándar (1 cm de camino óptico) a 280nm se obtiene un valor de 0,500. a. Calcule la concentración en μg/ml de la solución de proteínas. Ayuda: Para resolver este problema deben recordarse los conceptos de ecuación de la ecuación de Lambert-Beer y que la longitud de onda a la que se miden las proteínas es 280 nm b. Si cuenta con 1 ml de esta solución, ¿Cómo prepararía 500 μl de una solución 400 μg/ml? c. ¿Qué valor de absorbancia presentará dicha solución? -3-