EMISIÓN DE GASES DESNITRIFICANTES DE EFECTO INVERNADERO POR BACTERIAS Tortosa, G.a, Correa, D.a, Mesa, S. a, Delgado, M.J.a, Bedmar, E.J.a Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín, CSIC. Apartado Postal 419, 18080-Granada 1. Introducción El ciclo biogeoquímico del nitrógeno (N) es uno de los más complejos y variables en la naturaleza, y la influencia antropogénica en el mismo produce importantes alteraciones y riesgos medioambientales. Debido a una agricultura cada vez más intensiva que consume grandes cantidades de nitrógeno inorgánico, principalmente nitratos y sales de amonio, la contaminación por nitratos y nitritos de los suelos y aguas es cada vez más frecuente e intensa. La desnitrificación es el único proceso biológico por el que el nitrato y el nitrito pueden transformarse en nitrógeno molecular (N2) vía la formación de óxido nítrico (NO) y óxido nitroso (N2O). Es, por lo tanto, el proceso principal por el que el nitrato/nitrito se puede eliminar de los suelos y aguas y así evitar su acumulación y posteriores problemas de contaminación. Cuando la desnitrificación es incompleta, la reducción del nitrato/nitrito resulta en la producción de NO y/o N2O, gases que se liberan a la atmósfera donde ejercen un potente efecto invernadero (GEIs). Es, por tanto, una paradoja que siendo la desnitrificación el único mecanismo que poseen los seres vivos para eliminar el exceso de nitratos que contaminan los ecosistemas terrestres y acuáticos, sea también un proceso cuyos productos intermediarios tienen un enorme impacto sobre la contaminación atmosférica. En este trabajo se exponen las líneas de investigación que nuestro Grupo de Investigación lleva a cabo actualmente en relación con la desnitrificación y la producción de gases de efecto invernadero. Esta investigación se ha subvencionado con los proyectos de investigación CGL2006-06870, P07-CVI-3177, RNM-4746 y AGL2010-18607 y se centran en tres grandes objetivos: 1) el estudio medioambiental de ecosistemas afectados por la contaminación por nitratos; 2) el análisis de la biodiversidad de las poblaciones de bacterias desnitrificantes en muestras medioambientales y, 3) la emisión de N2O por bacterias endosimbióticas en cultivos de leguminosas de interés agrícola. 2. Técnicas, Resultados y Discusión Las técnicas que se emplean en nuestro laboratorio incluyen las relacionadas con la caracterización fisicoquímica de muestras medioambientales (aguas, suelos y sedimentos), entre ellas, determinación de pH, conductividad eléctrica, carbono orgánico y nitrógeno total, amonio, nitrato y nitrito, así como el contenido en macro y microelementos. Desde un punto de vista bioquímico se analizan las actividades enzimáticas que caracterizan los principales ciclos biogeoquímicos, como el carbono, nitrógeno, fósforo y azufre respectivamente. También se lleva a cabo la determinación de los GEIs CO2, CH4 y N2O que pueden liberarse durante la incubación de suelos, aguas y sedimentos, la actividad desnitrificante y el potencial de desnitrificación (Tortosa y col., 2011). Se dispone también de las técnicas necesarias para el aislamiento de ADN a partir de muestras medioambientales y para amplificar (qPCR) y clonar (metagenómica) los genes desnitrificantes narG, napA, nirK, nirS y nosZ que puedan estar presentes en tales muestras. La determinación de la actividad desnitrificante, basada en la detección de N2O mediante cromatografía gaseosa, permite analizar las relaciones entre gen y función en tales muestras medioambientales. La asociación de estos datos con técnicas geoestadísticas hace posible obtener la distribución espacial de comunidades funcionales en muestras medioambientales (mapa de Krige). La amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA permite, por otra parte, estudiar la biodiversidad de las poblaciones desnitrificantes y entender los factores que puedan modificar la biodiversidad (Correa-Galeote y col., 2012). La nueva técnica de pirosecuenciación, que permite el análisis masivo de miles de secuencias amplificadas de un gen determinado, permitirá profundizar en el estudio de las poblaciones desnitrificantes que puedan desarrollarse en un ecosistema determinado. Nuestro grupo de investigación ha sido pionero en caracterizar los genes y enzimas de la desnitrificación de la bacteria endosimbiótica Bradyrhizobium japonicum, que forma nódulos en las raíces de soja (Bedmar y col., 2005). Durante estos estudios se ha demostrado que los genes de la desnitrificación se expresan en los nódulos y que la mutación en los genes correspondientes resulta en la producción de NO y N2O (Mesa y col., 2004). El primero forma complejos nitrosilleghemoglobina, lo que disminuye la capacidad respiratoria de los bacteroides de los nódulos y el segundo se libera a la atmósfera, contribuyendo a su contaminación (Meakin y col., 2007; Sánchez y col., 2011). Si se considera la cantidad de GEIs que emiten las bacterias en vida libre y se piensa en la que pueden liberar a la atmósfera las bacterias que establecen asociaciones simbióticas con plantas leguminosas y actinorrícicas, se puede concluir que los miles de millones de hectáreas que se cultivan con tales plantas constituyen una fuente importante de emisión de GEIs a la atmósfera. En este sentido, el Grupo de Investigación utiliza la simbiosis Bradyrhizobium japonicum-Glycine max y Ensifer meliloti-Medicago sativa como modelos para analizar la producción de NO y N2O por los nódulos e identificar los factores medioambientales que puedan alterar tales emisiones, entre ellos, la presencia de metales, con especial interés en el Cu ya que forma parte de algunas enzimas desnitrificantes, así como el pH y el O2, ello sin contar el efecto de las fuentes de C y N. El desarrollo efectivo de sistemas de manejo para preservar la contaminación por nitratos de suelos, agua y atmósfera, así como para establecer planes de actuación en zonas contaminadas, no sólo requiere el estudio de la ecología funcional de las poblaciones de microorganismos desnitrificantes, sino que también es necesaria la identificación de las fuentes de contaminación por nitratos. Esta tarea se aborda en el Grupo mediante el análisis isotópico del oxígeno y del nitrógeno de los nitratos contaminantes, lo que, a su vez, nos permitirá analizar el origen, bien agrícola, ganadero o industrial, de los nitratos contaminantes. Gran parte de nuestros estudios se llevan a cabo en el Parque Nacional del Doñana. Junto con la especial protección a la que está sometido, las características extraordinarias del Parque hacen de sus marismas un ecosistema excepcional para estudiar la biodiversidad, la estructura y la dinámica de la comunidad de microorganismos desnitrificantes (Tortosa y col., 2011; Correa-Galeote y col., 2012). Referencias Bedmar, E.J., Robles, E.F., Delgado, M.J. 2005. The complete denitrification pathway of the symbiotic, nitrogen-fixing bacterium Bradyrhizobium japonicum. Biochem Soc Trans 33: 141-144. Correa-Galeote, D., Marco, D.E., Tortosa, G., Bru, D., Philippot, L., and Bedmar, E.J. 2012. Spatial distribution of N-cycling microbial communities and their functional activities showed complex patterns in constructed wetland sediments. En preparación. Meakin, G.E., Bueno, E., Jepson, B., Bedmar, E.J., Richardson, D.J., Delgado, M.J. 2007. The contribution of bacteroidal nitrate and nitrite reduction to the formation of nitrosylleghaemoglobin complexes in soybean root nodules. Microbiology 153: 411-419 Mesa, S., De Dios Alché, J., Bedmar, E.J., Delgado, M.J. 2004. Expression of nir, nor and nos denitrification genes from Bradyrhizobium japonicum in soybean root nodules. Physiol Plant 120: 205-211 Sánchez, C., Tortosa, G., Granados, A., Delgado, A., Bedmar, E.J. and Delgado, M.J. 2011. Involvement of Bradyrhizobium japonicum denitrification in symbiotic nitrogen fixation by soybean plants subjected to flooding. Soil Biol Biochem 43: 212-217 Tortosa, G., Correa, D., Sánchez-Raya, A.J., Delgado, A., Sánchez-Monedero, M.A., Bedmar, E.J. 2011. Effects of nitrate contamination and seasonal variation on the denitrification and greenhouse gas production in La Rocina Stream (Doñana National Park, SW Spain). Ecol Eng 37: 539-548.