2016000001407.pdf

INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA
VERTICILOSIS DEL OLIVO
MARIO PÉREZ RODRÍGUEZ
Febrero 2016
Departamento de Agronomía. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de
Montes. Universidad de Córdoba
TITULO: Influencia del riesgo sobre la Verticilosis del olivo.
AUTOR: Mario Pérez Rodríguez
© Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2016
Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396 A
14071 Córdoba
www.uco.es/publicaciones
publicaciones@uco.es
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Y MONTES
DEPARTAMENTO DE AGRONOMÍA
INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA VERTICILOSIS DEL OLIVO
Memoria de Tesis para optar al grado de Doctor con Mención Internacional por la
Universidad de Córdoba por el Ingeniero Agrónomo Mario Pérez Rodríguez
Director: Dr. Fco. Javier López Escudero
Córdoba, Febrero 2016
TÍTULO DE LA TESIS: INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA VERTICILOSIS
DEL OLIVO
DOCTORANDO/A: Mario Pérez Rodríguez
INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS
El doctorando Mario Pérez Rodríguez ha realizado la tesis doctoral titulada:
“Influencia del riego sobre la verticilosis del olivo”. Este trabajo se considera
finalizado y reúne los requisitos necesarios para su exposición y defensa.
A lo largo de su investigación el Doctorando ha contribuido con diversas
aportaciones de interés para la comunidad científica. Este trabajo supone un avance
importante en el estudio de la influencia del riego sobre la enfermedad más grave del
olivar en la actualidad. Los resultados obtenidos en esta tesis pueden ayudar al
agricultor a establecer una estrategia de riego adecuada en aquellos olivares afectados
por Verticilosis o en aquellas zonas donde en un futuro la enfermedad pueda estar
presente.
El trabajo ha sido realizado en el Departamento de Agronomía de la universidad
de Córdoba y gran parte ha sido difundido en las siguientes publicaciones: Tres
artículos en revistas de prestigio científico indexadas en la base de datos JCR, dos de
ellos publicados y el tercero aceptado y en prensa. Tres comunicaciones a congresos
internacionales, siendo dos de ellas comunicaciones orales. Tres comunicaciones
nacionales siendo una de ellas una comunicación oral.
Además de su línea de investigación, durante su tesis, el doctorando ha
participado en otras investigaciones del departamento que le ha permitido una
formación muy amplia en fitopatología, trabajando en otros patosistemas en los que
estaban involucrados diversos patógenos que afectan foliarmente a varios cultivos
leñosos de interés. Como resultado ha participado como autor principal o coautor en
varias comunicaciones en congresos nacionales e internacionales y en otras revistas
indexadas del área reconocidas en el Science Citation Index, o de carácter divulgativo.
Por último, el doctorando ha sido codirector durante este periodo de varios
proyectos de fin de carrera y una tesis de máster. Esta codirección le ha permitido
transmitir sus conocimientos a otros estudiantes en formación.
Por todo ello, se autoriza la presentación de la tesis doctoral.
Córdoba,_12__ de ____Febrero___ de _2016_______
Firma del/de los director/es
MENCIÓN DE DOCTORADO INTERNACIONAL
La presente tesis cumple los requisitos establecidos por la universidad de Córdoba
para la obtención del título de Doctor con Mención Internacional:

Estancia internacional predoctoral de 3 meses (del 5 de Agosto del 2014 al 5 de
Noviembre del 2014) en el Institute of Applied Plant Research of WageningenUR. El supervisor de la estancia fue el Dr. Jelle A. Hiemstra, Senior scientist of
Wageningen UR/Applied Plant Research.

La tesis cuenta con el informe previo de dos doctores externos con experiencia
acreditada pertenecientes a alguna institución de educación superior o instituto de
investigación diferente a España:


Dr. Giovanni N. Bubici, Istituto per la Protezione Sostenible delle Piante
(IPSP), U.O.S. Bari. Consiglio Nacionale delle Ricerche (CNR), Italy.

Dr. George Karaoglanidis, Assistant Professor. Aristotles University of
Thessaloniki. Faculty of Agriculture, Forestry and Natural Resources
Thessaloniki, Greece.
Como miembro del tribunal, un doctor perteneciente a alguna institución de
educación superior o centro de investigación no español forma parte del tribunal
evaluador de la tesis:
Dr. Paula Baptista, Profesora de la escuela superior agraria. Instituto politécnico
de Bragança, Portugal.

Parte de la Tesis doctoral, de acuerdo a la normativa, se ha redactado y se
presentará en dos idiomas, castellano e inglés.
El Doctorando
Fdo: Mario Pérez Rodríguez
TESIS POR COMPENDIO DE ARTÍCULOS
Esta tesis cumple el requisito establecido por la Universidad de Córdoba para su
presentación como compendio de artículos. Consiste en un mínimo de 3 artículos
publicados o aceptados en revistas incluidas en los tres primeros cuartiles de la relación
de revistas del ámbito de la especialidad y referenciadas en la última relación publicada
por Journal Citation Report (SCI):
1. Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J.,
Arquero O., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015. Influence of irrigation
frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive. Plant
Disease 99:488-495. Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 3.020, posición
40/204 y 1er cuartil en el área temática de Plant Sciencies.
2. Pérez-Rodríguez, M., Lorite I. J., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015.
Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive. Scientia Horticulturae
197: 564-567. Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 1.365, posición 9/33 y 2º
cuartil en el área temática de Horticultura.
3. Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J. , and LópezEscudero F.J. 2015. The effect of short irrigation frequencies on the development
of Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions.
Plant Disease (En prensa). Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 3.020,
posición 40/204 y 1 er cuartil en el área temática de Plant Sciencies.
El Doctorando
Fdo: Mario Pérez Rodríguez
Los trabajos incluidos en esta tesis doctoral han sido parcialmente subvencionados
por el Proyecto AGL2011–30137 del Ministerio de Ciencia e Innovación, co-financiado
por fondos FEDER de la Unión Europea, y por el contrato (UG 400544) entre la
Universidad de Córdoba y la Interprofesional del Aceite de Oliva Español.
La portada de la tesis y las ilustraciones han sido realizadas por Luís Pérez
González.
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a mi familia todo el apoyo recibido,
especialmente a mis padres, que siempre han estado allí para apoyarme y darme
fuerzas para seguir a delante.
A ti Espe, principalmente por tu paciencia y por ser algo más que mi mejor amiga.
En pocas palabras, Por todo.
A Fco. Javier López Escudero que aparte de ser un muy buen director de tesis,
está siendo un muy buen compañero de trabajo. ¡Gracias!
A Juan Moral Moral, por ayudarme siempre, por darme buenos consejos, por ser
un buen amigo.
A Paco González, sin su ayuda y apoyo con los trabajos de campo hubiera sido
muy difícil sacar esto adelante.
A Paco Orgaz, todas las conversaciones que he tenido contigo siempre me han
aportado mucho. He tenido mucha suerte de que formaras parte de este proyecto.
A Antonio Trapero por ofrecerme este trabajo, por ayudarme siempre con mis
dudas. Si he llegado hasta este punto de mi vida profesional, es en parte gracias a
ti.
A Paqui Luque, todo lo que he aprendido en el laboratorio te lo debo a ti. Para mi
eres más que una buena técnico laboratorio.
A Diego Cabello, por los momentos pasados y por los que vendrán.
A Beatriz Muñoz, espero que algún día volvamos a coincidir.
A Conchi, por ser una buena amiga y además una excelente compañera de trabajo.
A la interprofesional del aceite de oliva español por quererse involucrar en este
proyecto.
A todos las personas de la comunidad de Regantes de Santaella, especialmente a
Sensi.
A la Oficina Comarcal Agraria “Sierra Morena/Campiña de Jaén (Andujar, Jaén).
A la Comunidad de Regantes “Ntra. Sra. De los Dolores” (Arjona. Jaén) y
especialmente a Rafael Jiménez del Río por su ayuda.
A Angela, está siendo duro y seguramente lo seguirá siendo, pero estoy
convencido que acabarás la Tesis porque eres una buena investigadora y lo más
importante, eres buena persona.
A Mario, está siendo un placer compartir despacho contigo, se que llegarás lejos.
A Mª Ángeles (La peliroja) por hacerme reír.
A Esperanza, Luís, Mari Carmen, Francisco, Joaquín, Mª Ángeles, Eduardo,
Antonio, María, Ana, Carlos Trapero, Carlos Agustí, y las otras muchas personas
que conviven o que durante estos años han convivido conmigo en el
departamento.
A mis amigos de Córdoba, Alejandro, Ana, Pablo y Meli por hacerme disfrutar
cada vez que he estado con vosotros.
A mis amigos de Girona, Pau, Alex, Xevi etc…. Por vuestra amistad.
A Luís Pérez por los dibujos y por tantas cosas más.
A Mª Carmen Rodríguez, Belén Pérez, Beatriz Pérez, Rosa Rodríguez e Israel
Araque. ¡Sois mi familia, gracias por todo!
A Marçel, Blanca, Violeta, Carlota y a mis otros sobrinos.
RESUMEN
La Verticilosis del olivo (VO) causada por el hongo hifomiceto V. dahliae Kleb
está considerada actualmente la enfermedad de suelo más grave de este cultivo. Durante
las últimas décadas la expansión de VO en las zonas olivareras ha sido paralela a la
reconversión de olivares de secano a regadío en plantaciones en las que antes la
enfermedad no ocasionaba una incidencia elevada. Además, numerosas observaciones
apuntan a que el desarrollo de esta enfermedad está siendo mucho más importante en
los olivares de regadío que en los olivares de secano. El objetivo general de la presente
Tesis Doctoral ha sido estudiar el efecto del manejo del riego en el desarrollo de la VO.
En un primer experimento realizado en condiciones semicontroladas
(microparcelas con suelo naturalmente infestado por el patógeno) se demostró que un
riego diario favorece el inicio y desarrollo de la enfermedad en el cultivar susceptible
Picual. Sin embargo, el progreso de VO en el cultivar Arbequina no se vio influenciado
por las diferentes frecuencias de riego establecidas. Los bajos niveles de enfermedad
obtenidos en el cultivar Frantoio para cualquiera de los tratamientos de riego estudiados
claramente sugieren que el uso de cultivares resistentes pueden tener más impacto en el
control de la enfermedad que la aplicación de determinadas frecuencias de riego. Los
resultados obtenidos en estas condiciones experimentales sugieren que una reducción de
la frecuencia del riego cuando se usan cultivares susceptibles en suelos naturalmente
infestados por V. dahliae puede ser una estrategia eficaz para ralentizar el desarrollo de
esta enfermedad.
En las 70 fincas prospectadas en un zona del Valle del Guadalquivir afectada por
VO se observó que la incidencia de la enfermedad era significativamente más
importante (21.42%) en las plantaciones regadas con una dosis alta, valor medio: 2059
m3/ha (2012) y 1793.4 m3/ha (2013). Las plantaciones regadas con una dosis de riego
menor, valor medio: 712.5 m3/ha (2012) y 741.5 m3/ha (2013), mostraron una
incidencia de la enfermedad significativamente más baja (13.3%). Finalmente, las fincas
en secano fueron las que mostraron el valor más bajo de incidencia (4%). Por
consiguiente, de este estudio se deduce que una disminución de la dosis de riego puede
ser una práctica cultural adecuada para controlar el desarrollo de VO.
En los trabajos en condiciones de campo, el efecto de una frecuencia de riego
diaria sobre la Verticilosis en el cultivar susceptible Picual, en general no fue
significativamente diferente al efecto causado por una frecuencia de riego quincenal. El
incremento de la incidencia y de la severidad durante la primavera y el otoño estuvo
significativamente relacionado con el contenido de agua en el suelo de la misma y/o
previa estación favorable. Además, en estos trabajos de campo se demostró que existe
un porcentaje de contenido de agua en el suelo por encima del punto de marchitez
permanente para el que los incrementos de severidad e incidencia de la enfermedad en
las estaciones favorables (primavera y otoño) se mantienen en cero. Estos resultados
sugieren que bajo las condiciones del Valle del Guadalquivir, dependiendo de la
pluviometría de la zona, espaciar el riego o incluso no regar durante un periodo de
tiempo puede ser un método factible para mantener el contenido de agua en el suelo por
debajo del nivel que favorece la enfermedad.
SUMMARY
Verticillium wilt of olive (VWO) caused by the fungus Verticillium dahliae Kleb
is considered the most severe disease of this crop. During the last decades the expansion
of VWO has been parallel to the reconversion of dry-land into irrigated systems.
Moreover, a number of observations suggest that disease development of VWO is more
important in irrigated olive orchards than in orchards located in dry-land zones. In
consequence, the general objective of this work has been to study the effect of irrigation
on the VWO development.
In a first experiment conducted in microplots filled with naturally infested soil,
the daily irrigation frequency strongly encouraged the onset and development of VWO
in the susceptible ‘Picual’ olive. However, disease progress in ‘Arbequina’ was not
influenced by the irrigation frequency. Finally, the low disease rates recorded for
‘Frantoio’ clearly suggest that the use of resistant cultivars might have more impact on
disease control than the application of certain irrigation frequencies that may be
unfavorable for disease development in susceptible cultivars. Therefore, the results from
this study strongly encourage a reduction in irrigation frequency when growing very
susceptible cultivars in soils containing V. dahliae.
In the 70 prospected olive orchards in a cultivated zone of Guadalquivir valley
affected by VWO, disease incidence was significantly more severe (21.42%) in olive
plantations irrigated with high irrigation doses; mean value of 2059 m3/ha (in 2012) and
1793.4 m3/ha (in 2013). Plantations watered with lesser doses, with average values of
712.5 (in 2012) and 741.5 (in 2013) m3/ha, showed a disease incidence significantly
lower, which accounted for 13.3%. Finally, dry-land olive orchards showed the lowest
disease incidence (4.0%). Consequently, data shows that the reduction in watering dosage
could be an advisable cultural practice for controlling VWO in affected olive orchards.
In field experiments, the effect of daily irrigation frequency on the disease
development was not significantly different to the effect of biweekly irrigation
frequency in general. In these field trials, and during the observation period, a
significant correlation between disease incidence and severity increments during spring
and fall with the soil water content of the same and/or previous favorable seasons was
observed. Moreover, in these experiments, a percentage of soil water content above
permanent wilting point which disease incidence and severity remained at zero was
observed. Therefore, under the climatic conditions of the Guadalquivir valley,
depending on rainfall of the zone, spacing out irrigation or even leaving the affected
orchard on dry-land for a certain period of time may be a feasible method for keeping
the soil water content below detrimental values for disease development.
ABREVIATURAS
ANOVA = análisis de varianza
ABCPE = área bajo la curva de progreso de la enfermedad
AUDPC = area under disease progress curve
D = defoliante / defoliating
DI = disease incidence
DI50 = time in weeks from planting until 50% of the plants were affected
FS = time from tree transplantation to the onset of disease symptoms
M = mortality
M50 = time in weeks from planting until 50% of the plants had died
MDPR = maximum disease progress rate
MM = time from symptom onset to plant death
MS = mean severity
MS50 = time in weeks from planting until the severity of the affected plants was equal to
2
MS/g = microsclerotia per gram
MSPA = modified sodium polypectate agar
MSWC = minimum soil water content in percentage
ND = no defoliante / non-defoliating
PCR= polymerase chain reaction
PDA = potato dextrose agar
TDR = time domain reflectometry
qPCR = quantitative polymerase chain reaction
VO = verticilosis del olivo
WVO = verticillium wilt of olive
ÍNDICE
Página
CAPÍTULO 1 (Introducción general y Objetivos)
1
INTRODUCCIÓN GENERAL…….……………………………..................
1. El olivo: historia, importancia y distribución. ………..…………….
2. El riego en el olivar……………………………………………………
2.1. Programación riegos……………………..…………………….…
2.2. Métodos de programación de riego basados en medidas en el
suelo…………………………………………………………………...
3. La Verticilosis del Olivo………..…………………………………...
3.1. Historia, distribución e importancia.………………...……………
3.2. Etiología y diagnóstico……………………………………………
3.2.1. Etiología y gama de huéspedes……..………...……………
3.2.2. Síntomas de la enfermedad…………………..……………
3.3. Variabilidad patogénica……………………………….………….
3.4. Ciclo biológico……………………………………....……………
3.5. Fuente de inóculo y supervivencia……….………………….……
3.6. Germinación de las estructuras de supervivencia.………….…….
3.7. Penetración del patógeno…….……………………………….…..
3.8. Conolización de la planta………………………………….……...
3.9. Desarrollo de síntomas…………………………………………....
3.10. Factores que contribuyen a la importancia y distribución de la
Verticilosis del olivo…………………………………………………..
3.10.1. Factores que favorecen la persistencia, incremento y
dispersión del patógeno…………………………………………...
3.10.2. Dispersión de Verticillium dahliae…………….………….
3.10.3. El riego como factor agronómico que favorece el inicio y
desarrollo de la enfermedad………………………………………
3.10.4. Otros factores agronómicos que favorecen la enfermedad.
3.10.5. Factores ambientales: Temperatura, características
edáficas y interaciones bióticas………………….……………….
3.11. Control integrado de la Verticilosis……………………………..
3.11.1. Medidas antes de la plantación…………………………...
3.11.1.1. Uso de cultivares resistentes.……..…….…….....
3.11.2. Medidas después de la plantación………………….……..
3.11.2.1. Métodos excluyentes……………………………
3.11.2.2. Métodos erradicativos…….…………………….
3.11.2.2.1 Erradicación de agentes fitopatógenos
en el agua de riego……………………………….
3.11.2.3. Métodos de escape………………………………
3.11.2.3. Terápia…………………………………………..
4. Justificación de la Tesis doctoral………….…………………………
3
3
3
4
OBJETIVOS………………………………………………………………….
5
5
5
6
6
9
10
11
12
12
13
14
14
14
14
15
16
19
20
21
21
22
23
24
24
25
26
26
27
27
Página
CHAPTER 2 (Irrigation frequency in microplots)
The influence of Irrigation frequency on the onset and disease development
of Verticillium wilt of olive…...…..………...………………………..……….
Abstract…………………………………………………………………..
Introduction……………………………………………………………...
Material and Methods………....………………………………………..
Experimental plot……………………………………………….
Collecting and characterizing the soil naturally infested with
V. dahliae…………………………………………………….......
Soil properties…………………………………………………...
Plant material……………………………………………………
Irrigation treatments……………………………………………
Microplot establishment and experimental design……………
Soil water content measurement in the microplots....................
ID of V. dahliae in microplot soil………………………………
Disease progression and tree development................................
Pathogen isolation……………………………………………….
Data analysis.................................................................................
Results.......................................................................................................
ID of V. dahliae in the soil………………………………………
Disease symptoms………………………………………………..
Pathogen isolation from affected tissues……………………….
Disease progression………………………………………….…..
Discussion…………………………………………………………..……
Acknowledgments……………………………………………………….
References..........…………………………………………………………
Supplementary Figures............................................................................
29
31
31
32
32
32
33
33
34
34
34
35
35
35
36
36
37
37
37
37
37
39
42
42
52
CHAPTER 3 (Irrigation dose)
55
Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive…………………….
Abstract…………………………………………………………………..
Introduction……………………………………………………………...
Material and Methods………....………………………………………..
Disease surveys………………………………..…………………
Data analysis……………………………………………………..
Results and Discussion…………………………………………………..
Acknowledgments……………………………………………………….
References…………………………………………….…………………
Supplementary Figures............................................................................
57
57
58
58
58
59
59
60
61
66
Página
CHAPTER 4 (Irrigation frequency at field conditions)
The effect of short irrigation frequencies on the development of Verticillium
wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions ……………..
Abstract…………………………………………………………………..
Introduction……………………………………………………………...
Material and Methods………....………………………………………..
Field experimental plots………………………………………...
Experiment I.….………………………………………….….......
Soil properties and Verticillium dahliae inoculum density........
Plant material……………………………………………………
Orchard establishment, experimental design and irrigation
treatments………………………………………………………..
Experiment II……………………………………………………
Inoculating the experimental site and collecting and
characterizing a naturally infested soil………………………...
Plot infestation, orchard establishment, experimental design
and irrigation treatments………………………………………..
Assessment of disease progression……………………………...
Relationship between increase in disease parameters
(incidence and severity) and soil water content in
Experiments I and II.....................................................................
Rainfall data……….…………………………………………….
Data analysis..................................................................................
Results........................................................................................................
Inoculum density of Verticillium dahliae in the soil…………...
Disease symptoms and pathogen isolation from affected
tissues…………………………………………………….……….
Disease progression…………………………………….………..
Rainfall at experimental plots…………………………….…….
Relationship between the increase in disease parameters
(incidence and severity) and soil water content……….……….
Discussion……………………………………………………...…………
Acknowledgments……………………………………………………….
References..........…………………………………………………………
Supplementary Figures............................................................................
71
73
73
74
75
75
75
75
76
76
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80
80
80
80
82
82
83
87
87
96
DISCUSIÓN GENERAL
101
CONCLUSIONS
109
Página
BIBLIOGRAFIA (Introducción general y Discusión general)
113
ANEJO 1 (Estancia en el extranjero)
139
Estancia en el centro “Wageningen UR/Applied Plant Research Sector
Flower Bulbs, Nursery Stock & Fruits” en Holanda..…….…………..………
Objetivo de la estancia…………………..………………………………
Experimento I: Inoculación de variedades de olivo………….………..
Material y Métodos...................................................................................
Material Vegetal…………………………………………………
Inoculación e incubación……………………………………….
Diseño experimental………………………………………...…...
Evaluación del progreso de la enfermedad.................................
Visualización del patógeno……………………………………...
Análisis de datos............................................................................
Resultados preliminares…………..…………………………………….
Síntomas de la enfermedad…………………..…………………
Progreso de la enfermedad……………………………………...
Visualización del patógeno………………………………….…..
141
141
141
141
141
141
141
142
142
142
142
142
142
143
Experimento II: Distribución de Verticillium dahliae en plantones de
Fresno y Arce…………………………………………………………………
Material y Métodos……………………………………………………...
Material Vegetal…………………………………………………
Inoculación……………………………………………………….
Recogida y procesado de muestras……………………………..
Resultados preliminares………………………………………………...
Bibliografía………….…………………………………………………...
Figuras suplementarias………………………………………………………
144
144
144
144
144
145
145
146
ANEJO 2 (Producción científica)
149
Introducción General y
Objetivos
1
2
Introducción y Objetivos
INTRODUCCIÓN GENERAL
1.
El olivo: historia, importancia y distribución.
El olivo es la única especie que produce frutos comestibles dentro de la familia
botánica Oleaceae y es una de las plantas cultivadas más antiguas (Zohary y Spiegel-Roy,
1975; Green, 2002). Probablemente fue domesticado del acebuche y originario de la región
geográfica rodeada por el sur del Cáucaso, la Meseta Persa y la costa de Siria. Se extendió
por Chipre hacia Anatolia, y a través de Creta hacia Egipto, hasta poblar todos los países
del Mediterráneo. Más tarde, en la época de los largos viajes transoceánicos en los siglos
XV y XVI, se extendió a las Américas, y más recientemente fue introducido y cultivado en
Sudáfrica, China, Japón y Australia (Civantos, 2008).
El cultivo del olivo se concentra entre las latitudes 30º-45º tanto en el hemisferio norte
como en el hemisferio sur, en regiones con clima mediterráneo (López-Escudero y
Mercado-Blanco, 2011). De este modo, el 97% del área de cultivo global
(aproximadamente 10.5 millones de ha) se localiza en la Cuenca Mediterránea, el 1.5% en
Asia, el 0.8% en América y el 0.01% en Asia. España es el principal productor con un 25%
de la superficie mundial y cerca del 44% de la producción, seguido de Italia, Grecia,
Túnez, Turquía, Siria y Marruecos (FAO, 2015). Andalucía es la comunidad autónoma con
mayor superficie (65%) y mayor producción (85%) en España, donde el olivo constituye
un cultivo con una gran importancia económica, ecológica y social (Barranco et al., 2008).
Tradicionalmente, los olivares de la Cuenca Mediterránea tenían densidades de
plantación variables, dependiendo de la topografía y la disponibilidad de agua, tendiéndose
en la mayoría de los casos a marcos amplios y en secano. Sin embargo, en las últimas
décadas y con el fin de aumentar la productividad, se ha producido una modernización del
cultivo, principalmente en los siguientes aspectos: uso de plantas de vivero, altas
densidades de plantación, laboreo reducido o no laboreo, uso de fertilizantes de síntesis
química y riego por goteo (Barranco et al., 2008).
2. El riego en el olivar
Tradicionalmente el olivar se ha cultivado en condiciones de secano ya que es
capaz de sobrevivir a periodos importantes de sequía. Sin embargo, desde hace un tiempo,
se ha comprobado que experimentalmente la práctica del riego aumenta considerablemente
el rendimiento del olivar, incluso si las aportaciones de agua son reducidas (Orgaz y
Fereres, 2008). A pesar de la resistencia a sequía, la productividad del olivo, responde
negativamente a la falta de agua (tabla 1).
3
Capítulo 1
Tabla 1: Efectos del déficit hídrico en los procesos de crecimiento y producción del olivo.
Proceso
Período
Efecto del deficit hídrico
Reducción del número de flores al
Crecimiento vegetativo
Todo el año
año siguiente
Reducción número de flores. Aborto
Desarrollo de yemas florales
Febrero-Abril
ovárico
Floración
Mayo
Reduce fecundación
Cuajado de frutos
Mayo-Junio
Aumenta la alternancia
Disminuye el tamaño del fruto
Crecimiento inicial del fruto
Junio-Junio
(menor número de células/fruto)
Disminuye el tamaño del fruto
Crecimiento posterior del fruto
Agosto-Cosecha
(menor tamaño de las células del
fruto)
Disminuye el contenido de
Acumulación de aceite
Julio-Noviembre
aceite/fruto
Fuente: Orgaz y Fereres, 2008
En Andalucía, independientemente del marco de plantación, las zonas olivareras
acostumbran a consumir cantidades de agua inferiores a 2500 m3/ha y año, aunque los años
de pluviometría raramente rebasan los 1500 m3/ha y año, cifra asignada por la Comunidad
Hidrográfica del Guadalquivir en las concesiones administrativas (Pastor, 2005).
Gracias a su mayor eficiencia potencial, el riego por goteo es el sistema de riego
más utilizado en las zonas regables del olivar. Este tipo de sistema lleva al agricultor
muchas veces, a aplicar elevadas frecuencia de riegos (normalmente diarias) durante un
calendario fijo, ignorando el papel del suelo como almacén de agua (Orgaz y Fereres,
2008).
2.1. Programación de riegos.
A efectos de la programación del riego, el suelo se considera como un depósito de
agua con un nivel superior denominado Límite superior (LS) o Capacidad de campo. El
concepto de LS hace referencia al contenido de agua en el que se estabiliza un suelo
cuando cesa el drenaje libre tras ser saturado. Cuando un suelo está a LS se considera que
está lleno de agua. El Límite inferior (LI) o punto de marchitez permanente corresponde al
contenido de agua en el suelo para el que se produce una marchitez irreversible en el
cultivo y por debajo de éste no puede extraer más agua. Dependiendo de la textura a
efectos operativos, cada tipo de suelo tiene un valor de LS y LI determinado, expresado
generalmente en porcentaje o en m3 de agua / m3 de suelo.
A partir de estos dos puntos característicos se puede definir el intervalo de humedad
disponible (IHD) como la diferencia entre los dos límites inferior y superior. IHD por
tanto, es una medida de la capacidad de retención de agua en el suelo.
4
Introducción y Objetivos
Aunque las plantas pueden extraer agua hasta LI, existe un punto intermedio a LS y
LI a partir del cual se produce una reducción de la transpiración y por tanto de la
fotosíntesis. Este valor expresado como fracción del IHD se denomina Nivel de
Agotamiento Permisible (NAP). El NAP indica qué fracción del agua retenida por el suelo
está disponible para el cultivo sin que afecte a su desarrollo. Esta fracción varía en función
del cultivo, de su estado de desarrollo y de la demanda evaporativa. Para el caso del olivo
no se dispone aún de información experimental precisa. Sin embargo, su naturaleza
perenne, el buen desarrollo de su sistema radicular y su evapotranspiración relativamente
baja, permiten deducir que un olivar adulto puede agotar hasta un 75% del agua disponible
en el suelo sin que su producción se vea afectada. En cualquier caso, un olivar joven, cuyo
crecimiento es más sensible, se estima que puede agotar solo hasta un 50% del agua
disponible en el suelo (Orgaz y Fereres, 2008; Studeto et al., 2012).
2.2. Métodos de programación de riego basados en medidas en el suelo
El contenido de agua en el suelo es un indicador de la disponibilidad de agua para
la planta. Así, si disponemos del estado hídrico del suelo y conocemos los valores
umbrales para los que hay que regar, podremos establecer una programación de riego.
Existen diferentes métodos de medida del contenido de agua en el suelo. El método
más sencillo y que toma una medida más directa y fiable es el método gravimétrico,
aunque existen otros métodos de medida como el tensiómetro, los bloques de yeso, la
sonda de neutrones o las medidas de la constante dieléctrica (Villalobos et al., 2002).
Las técnicas para medir el contenido de agua en el suelo se basan en medir la
constante dieléctrica del suelo que depende sobre todo de su contenido de agua. Dentro de
estas técnicas tenemos el sistema TDR (Time Domain Reflectometry, 6050X1 Trase
System I; Soil Moisture equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA). Este sistema consiste
en un osciloscopio conectado a dos varillas metálicas que se insertan en paralelo en el
suelo. Si se aplica una diferencia de potencial a un extremo de las varillas, la energía se
transmite a lo largo de las varillas hasta su extremo, donde son reflejadas hacia el
osciloscopio. En el mismo se mide la evolución del potencial a lo largo del tiempo. La
velocidad de transmisión de la onda en el viaje de ida y vuelta depende de una constante
dieléctrica del medio (suelo que rodea las varillas) por lo que es posible deducir la
constante dieléctrica a partir del tiempo de la onda a través de las varillas. A su vez, la
constante dieléctrica del suelo depende sobre todo de su contenido de agua. Por ello el
análisis de la onda nos permite estimar el contenido de agua (Villalobos et al., 2002).
3. La Verticilosis del olivo
3.1. Historia, distribución e importancia
La Verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo hifomiceto Verticillium
dahliae Kleb, es hoy en día la enfermedad más preocupante y devastadora de este cultivo
5
Capítulo 1
en España y presumiblemente en todos los países de la Cuenca Mediterránea (Bubici y
Cirulli, 2011; Jiménez-Díaz et al., 2012, López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Tsror
2011). Fue diagnosticada por primera vez en Italia (Ruggieri, 1946), y desde entonces ha
sido descrita en California (Snyder et al. 1950), Grecia (Sarejanni et al., 1952; Zachos,
1963), Turquía (Saydam y Copcu, 1972) y diversos países del área Mediterránea. En
España fue observada por primera vez en el año 1975 (Caballero et al., 1980), aunque
existen descripciones anteriores de síntomas similares a la VO a los que se denominó
“alagartado” del olivo (Benlloch, 1943).
No hay disponibles valoraciones económicas exhaustivas de la importancia de la
enfermedad, aunque se han realizado prospecciones en diferentes países. Por ejemplo,
Thanassoulopoulos et al. (1979) estimaron una incidencia de la enfermedad del 2-3% y
pérdidas de cosecha del 1% de la producción nacional griega. En Andalucía, prospecciones
realizadas entre 1980 y 1983 en 122 plantaciones adultas en las provincias de Córdoba,
Sevilla y Jaén, mostraron que la enfermedad estaba presente en el 38.5% de los casos, con
una incidencia de hasta el 90% en algunas plantaciones (Blanco-López et al. 1984). En
encuestas realizadas entre 1994 y 1996 se observó la presencia de la enfermedad en el
39.5% de las 122 plantaciones jóvenes consultadas. Dichas plantaciones se situaban lejos
de las zonas donde la VO fue detectada por primera vez (Sánchez-Hernández et al., 1998).
Desde entonces, en España esta enfermedad se ha extendido considerablemente, asociada
principalmente al establecimiento de plantaciones intensivas jóvenes con cultivares de
olivo susceptibles en suelos infestados por el patógeno (León-Gallego, M. 2000; LópezEscudero et al., 2010; Roca et al., 2015; Rodríguez et al., 2008, 2009, 2011). Asimismo, la
incidencia registrada en muchas de las plantaciones afectadas se ha incrementado en los
últimos años. En este sentido, López-Escudero et al. (2010) observaron una incidencia
media del 20% en plantaciones afectadas por la VO en las principales provincias
olivicultoras del Valle del Guadalquivir, Jaén, Córdoba y Sevilla.
3.2. Etiología y diagnóstico.
3.2.1. Etiología y gama de huéspedes.
El agente causal de la VO es el hongo Hifomiceto Verticillium dahliae Kleb, un hongo
hemibiótrofo haploide de suelo de reproducción sexual desconocida. Aunque diversos
autores aseguran que una recombinación sexual podría haber ocurrido en el pasado
(Milgroom et al., 2014; Short et al., 2015), Verticillium dahliae se reproduce asexualmente
por medio de conidios, produciendo microesclerocios (ME) adaptados a soportar
condiciones ambientales adversas (Trapero y Blanco-López, 2008; Klosterman et al.,
2009). El género Verticillium se ha incluido tradicionalmente dentro de la clase
Hyphomycetes, orden Moniliales, familia Moniliaceae. Sin embargo, en la clasificación
actual de los hongos (Hibbett et al., 2007) se engloba dentro de los hongos mitospóricos,
sin clasificación de taxa supragenéricos y se incluyen en la división Ascomycota,
subdivisión Pezizomycotina, clase Sordariomycetes y familia Plectosphaerellaceae
(Inderbitzin et al., 2011, Inderbitzin and Subbarao, 2014).
6
Introducción y Objetivos
Verticillium dahliae se caracteriza por la formación de micelio y conidios hialinos,
agrupados sobre el extremo de fialidas uninucleadas dispuestas en verticilos sobre
conidióforos hialinos no ramificados (Figura 1).
Figura 1. Conidióforos de Verticillium dahliae
Las especies que comprenden el género Verticillium son las causantes de multitud
enfermedades importantes que afectan a numerosos cultivos en todo el mundo, tanto a
plantas herbáceas como leñosas. Asimismo, existen varias especies dentro de este género
que son parásitas de algunos hongos basidiomicetos y de insectos (Isaac, 1949). Son
típicos habitantes del suelo con un comportamiento necrotrofo obligado.
Verticillium tiene un amplio rango de grupos taxonómicos, conteniendo unas 51
especies, entre las que se encuentran, aunque sin limitarnos, V. albo-atrum, V. dahliae, V.
nigrescens, V. nubilium, V. longisporum o V. tricorpus.
V. nigrescens, V. nubilum y V. longisporum se distinguen del resto debido a su
capacidad de formar clamidosporas, teniendo además una fase saprofítica de importancia
en el suelo. Por otra parte, V. tricorpus se caracteriza por la producción de un micelio
oscuro, producir clamidosporas, ME y por tener una pigmentación amarillo-anaranjada
(Qin et al., 2006). Verticillium tricorpus se caracteriza también por ser una especie
saprófita y ser un agente causal de infecciones oportunistas (Inderbitzin and Subbarao,
2014; Seidl et al., 2015).
Verticillium dahliae se diferencia morfológicamente del resto de especies del género,
y particularmente de V. albo-atrum, por la formación ME, formados por septación
7
Capítulo 1
multilateral irregular y proliferación de células de una o varias hifas contiguas y que
constituyen la estructura de resistencia de la especie (Isaac, 1967; Goud et al., 2003).
Los ME, que constituyen las estructuras de supervivencia, infección y dispersión del
hongo, le permiten sobrevivir en el suelo en ausencia de huéspedes durante varios años
(Figura 2). Se producen en los tejidos senescentes de plantas infectadas al final de la fase
parasítica del ciclo de vida del patógeno. Son de color negro o marrón y se originan por la
hinchazón de las hifas y la posterior brotación lateral que da lugar a la formación de grupos
de células (Hall y Ly, 1972; Perry y Evert, 1984).
Figura 2. Colonia de microesclerocios de Verticillium dahliae
sobre el medio de cultivo Agar Polipectato Sódico
Verticillium dahliae presenta una amplia gama de plantas susceptibles, pudiendo
causar enfermedad en más de 400 especies vegetales herbáceas y leñosas (Pegg y Brady,
2002). Entre los huéspedes más destacados de V. dahliae se encuentran cultivos herbáceos
hortícolas (p.e., alcachofa, berenjena, coliflor, fresa, lechuga, melón, patata, pimiento,
sandía y tomate), industriales (p.e., algodón, colza, lino, girasol, remolacha y tabaco),
leguminosas (p.e., garbanzo, guisante, haba y lenteja) y ornamentales (p.e., clavel y
crisantemo). Además del olivo, también afecta a otros cultivos leñosos frutales (p.e.,
aguacate, albaricoquero, almendro, cacao, manzano, melocotonero, nectarina, pistacho y
vid), ornamentales (p.e., catalpa y rosal) y forestales (p.e. arce, castaño, fresno y olmo)
(Bhat y Subbarao, 1999; Evans y Gleeson, 1973; Hiemstra y Harris, 1998; Pegg y Brady,
2002; Smith y Neely, 1979).
Además de las plantas cultivadas, se han descrito numerosas plantas adventicias de
hoja ancha que son huéspedes alternativos de V. dahliae. Algunos géneros de malas
hierbas que pueden encontrarse en el olivar son susceptibles al patógeno (p.e., Anagallis,
Lamium, Malva, Matricaria, Medicago, Senecio, Solanum, Veronica, etc.) lo que
8
Introducción y Objetivos
contribuye a la multiplicación y dispersión del hongo en el suelo (Heale, 1988;
Thanassoulopoulos et al., 1981; Vargas-Machuca et al., 1987; Yildiz et al., 2009).
Por otra parte, aunque las especies monocotiledóneas, tanto cultivadas como
adventicias, no se consideran huéspedes de V. dahliae, se conoce que el hongo tiene la
capacidad de colonizar superficialmente las raíces de plantas resistentes a la infección
sistémica, como es el caso de la avena, cebada, maíz o trigo (Benson y Ashworth, 1976;
Levy e Isaac, 1976).
3.2.2. Síntomas de la enfermedad.
En las condiciones climáticas del Valle del Guadalquivir se han descrito dos tipos de
síndromes inducidos por infecciones de V. dahliae, “Apoplejía” (o forma aguda de la
enfermedad) y “Decaimiento lento” (o forma crónica).
La “apoplejía”, que se desarrolla normalmente entre final de invierno y principio de
primavera, consiste en la necrosis regresiva rápida de brotes, ramas principales y ramas
secundarias. Las hojas se vuelven de un color pajizo progresivamente y sufren un
abarquillamiento hacia el envés, permaneciendo generalmente adheridas a las ramas
(Figura 3A). La precocidad en la aparición y la severidad de este síndrome parece estar
asociada a lluvias intensas en otoño y a temperaturas moderadas en otoño e invierno.
Cuando la apoplejía ocurre en plantas jóvenes la muerte del árbol completo es muy común
(Blanco-López et al., 1984; Jiménez Díaz et al., 2012; López Escudero y Blanco-López,
2001; López-Escudero y Mercado-Blanco 2011; Rodríguez Jurado et al., 1993).
Por su parte, el “decaimiento lento”, que se desarrolla en primavera y progresa
lentamente hasta el comienzo del verano, se caracteriza por la necrosis de inflorescencias
(Figura 3B), por la defoliación en verde, que en ocasiones es muy intensa (Figura 3C) y
por el momificado de frutos en crecimiento o ya maduros, que suelen permanecer
adheridos a las ramas (Figura 3D).
Ocasionalmente, ambos síndromes pueden aparecer en el mismo árbol, y afectar
parcial o totalmente a la planta, siendo este último más frecuente en árboles jóvenes,
mientras que los de más edad suelen mostrar unas ramas afectadas y otras asintomáticas.
Por otra parte, en ocasiones aparece asociada a cualquiera de los dos síndromes una
coloración violácea-purpúrea en la corteza de las ramas afectadas, y ocasionalmente una
coloración marrón oscura en los tejidos vasculares.
9
Capítulo 1
Figura 3. Síntomas de la Verticilosis del olivo. A. Necrosis sectorial de brotes y ramas;
B. Necrosis de inflorescencias; C. Síntomas de decaimiento lento: defoliación de hojas
verdes o verde mate; D. Aceitunas momificadas y hojas cloróticas, enrolladas y
necróticas en un olivo con decaimiento lento después del verano
Los árboles infectados que no mueren debido a la enfermedad se pueden recuperar.
Dichos árboles tienen la capacidad de producir tejido vascular nuevo que puede cubrir
completamente los vasos de xilema necrosados, lo que permite el crecimiento de tejido
vascular nuevo en tallos y ramas infectadas (López-Escudero y Blanco-López, 2001; 2005;
Tjamos et al., 1991).
3.3.Variabilidad patogénica
Verticillium dahliae muestra una amplia variabilidad fisiológica, genética, molecular y
patogénica (López-Escudero et al., 2012; Papaioannou et al., 2013; Papaioannou y Typas,
2015; Pegg y Brady, 2002). Por ejemplo, dependiendo del medio donde crezca el hongo,
sus colonias pueden mostrar capas y colores diferentes. Así también, este hongo puede
mostrar una amplia diversidad de conidióforos y MS (Pegg y Brady, 2002; LópezEscudero et al., 2012). Por su parte, este patógeno no muestra patogenicidad huéspedespecífica, lo cual quiere decir que se muestra más virulento sobre el huésped del que
procede (Bhat y Subbarao, 1999; Qin et al., 2006).
10
Introducción y Objetivos
Los aislados de V. dahliae que infectan al olivo se pueden clasificar en dos patotipos
diferentes: el defoliante (D), altamente virulento y el no defoliante (ND), menos virulento
(Rodríguez Jurado et al., 1993; Dervis et al., 2007). Aunque ocasionalmente, los aislados D
y ND pueden mostrar un grado similar de virulencia en inoculaciones artificiales (Dervis et
al., 2010)
Este patrón de virulencia también ocurre entre aislados de V. dahliae de algodón
(Gossypium hirsutum), de manera que los aislados D y ND de algodón y olivo muestran
virulencia cruzada (Schnathorst y Sibbett, 1971). Recientemente se ha reportado que los
aislados de algodón ND y D corresponden con las razas 1 y 2 basadas en la respuesta
diferencial de cultivares de tomate y lechuga (Hu et al., 2015).
Actualmente, el uso de marcadores moleculares ha demostrado que la población de
este patógeno es altamente clonal (Dobinson et al., 1998; Collado-Romero et al., 2006,
2008; Dung et al., 2013). Sin embargo, existen algunas excepciones al respecto (JiménezDíaz et al., 2006; Jiménez-Gasco et al., 2014). De hecho, estudios recientes sugieren que
estas relaciones son más complejas y que es posible, como se ha comentado anteriormente,
que la recombinación sexual pudiera haber sucedido en el pasado (Milgroom et al., 2014;
Short et al., 2015).
3.4. Ciclo biológico.
El ciclo biológico de V. dahliae se muestra de forma esquemática en la Figura 4.
Figura 4. Ciclo de patogénesis de Verticillium dahliae en huéspedes
leñosos (adaptado de Hiemstra y Harris, 1998).
11
Capítulo 1
Este ciclo está compuesto por las siguientes etapas: supervivencia y dispersión del
inóculo, germinación de las estructuras de supervivencia (microesclerocios), penetración
del patógeno en la planta, colonización del sistema vascular, desarrollo de síntomas y
producción de nuevo inóculo. Al igual que sucede con la mayoría de hongos de suelo, V.
dahliae sólo produce una generación de inóculo en una estación de crecimiento del
huésped, es decir, es un patógeno monocíclico (Hiemstra y Harris, 1998).
3.5. Fuente de inóculo y supervivencia
Verticillium dahliae sobrevive en el suelo mediante la producción de ME. Éstos
representan el principal medio de dispersión del patógeno y su primera fuente de inóculo
(Wilhelm, 1955; Schnathorst, 1981). Los ME se forman en los tejidos necrosados
(especialmente hojas, ramas y tallos herbáceos) de la planta enferma durante las últimas
etapas de la fase parasítica del ciclo de vida del patógeno, y son incorporados al suelo tras
la degradación de los restos vegetales (Navas-Cortes et al., 2008; Tsror, 2011; Wilhelm y
Taylor, 1965). Estas estructuras de resistencia pueden soportar las condiciones físicas,
químicas y biológicas adversas que usualmente se dan en el suelo, permaneciendo viables
en ausencia de plantas huéspedes hasta 14 años (Wilhelm, 1955). En contraste, las hifas y
conidios de V. dahliae pierden la viabilidad en el suelo en un corto periodo de tiempo
(Green, 1969; Schreiber y Green, 1962).
La supervivencia del hongo se complementa por su carácter polífago sobre una amplia
gama de huéspedes principales y alternativos, lo que le permite aumentar su población y
persistencia en el suelo (Benson y Ashworth, 1976; Heale, 1988; Martinson y Horner,
1962; Vargas-Machuca et al., 1987).
3.6. Germinación de las estructuras de supervivencia
Los ME en el suelo permanecen inactivos hasta que se produce su germinación en
respuesta a los estímulos proporcionados por los exudados de las raíces de plantas
huéspedes y no huéspedes (Butterfield y DeVay, 1977; Lacy y Horner, 1966; Levy e Isaac,
1976; Mol, 1995; Schreiber y Green, 1963). Schreiber y Green, (1963) sugirieron que los
aminoácidos y otros elementos nitrogenados son los principales componentes que ayudan a
los ME a superar la fungistasis del suelo. La germinación de los ME es mayor con
exudados de especies huéspedes que con los de no huéspedes, probablemente por
diferencias en la concentración de sustancias inductoras (Schreiber y Green, 1963).
Lacy y Horner (1966) demostraron también que este patógeno era capaz de aumentar
su población en la rizosfera de plantas inmunes. Los ME tienen incluso la capacidad de
germinar y esporular repetidamente en un suelo secado y humedecido de forma periódica
(Farley et al., 1971). La germinación repetida de los ME se interpreta como una estrategia
de supervivencia de V. dahliae en el suelo (Farley et al., 1971; Menzies y Griebel, 1967).
12
Introducción y Objetivos
La tasa de germinación también se ve influenciada por el estado de agua en el suelo.
Egamov (1979) afirmó que los riegos periódicos estimulan la germinación de estas
estructuras. Además, López-Escudero y Blanco López (2005) demostraron que el riego por
goteo aumentaba el nivel de inóculo en el suelo. Estos autores encontraron una densidad
significativamente mayor en la zona húmeda debajo de los goteros que en la zona seca más
alejada de éstos. Igualmente, los incrementos de inóculo en las zonas bajo la influencia del
bulbo húmedo eran mayores que en las zonas fuera de éste. Baard and Pauer (1981) sin
embargo, no identificaron un aumento de ME en diferentes procesos de secado y
humedecimiento del suelo. Xiao et al. (1998) durante su estudio, tampoco observó que un
aumento de la frecuencia de riego aumentara la población del patógeno. En estudios más
recientes (Valle, 2014) realizados por el grupo de patología agroforestal de la Universidad
de Córdoba, se demostró que después de 2 años y medio de observaciones, un riego
deficitario favorecía la disminución ME en el suelo. Igualmente, cabe especificar, que la
germinación de los ME decrece linealmente con el potencial matricial de 0 a -1,5 MPa
(Pegg y Braddy, 2002; Saadatmand et al., 2006). Sin embargo, un suelo en condiciones de
saturación puede ser perjudicial para el patógeno. Así, Menzies (1962) y Nadakavukaren,
(1960) observaron que un suelo inundado durante 6 semanas mataba todos los ME de V.
dahliae. Pullman y Devay (1981) demostraron que mantener campos de algodón inundados
o hacer una rotación con arroz eran métodos igualmente efectivos contra la erradicación de
los ME de V. dahliae.
En cualquier caso, y como ocurre en la mayoría de los hongos (Griffin, 1978), la
germinación está más influenciada por la disminución del potencial matricial que del
potencial osmótico. El resultado de la disminución del contenido de agua es la reducción
del potencial matricial, lo que ocasiona también una reducción de la germinación. De este
modo, el manejo del agua a medio o largo plazo puede ser un factor de extrema
importancia en el control de la enfermedad (Saadatmand et al., 2006).
3.7. Penetración del patógeno
El ciclo de infección comienza cuando las hifas desarrolladas por el patógeno entran
en contacto con las raíces de las plantas (Jiménez-Díaz et al., 2012; Schnathorst, 1981). La
penetración de las hifas infectivas en las raíces puede producirse por los puntos de
emergencia de raíces laterales, por raicillas intactas, o bien a través de heridas provocadas
naturalmente (por ejemplo, las causadas por nematodos), o por la acción del hombre
(producidas por prácticas culturales) (Prieto et al., 2009; Rodríguez-Jurado et al., 1993;
Schnathorst, 1981). Las hifas penetran en la raíz colonizando las células epidérmicas y el
córtex, con un crecimiento tanto intercelular como intracelular. Una vez que ha tenido
lugar la penetración, las hifas permanecen localizadas en las células corticales formando
colonias (Evans y Gleeson, 1973; Prieto et al., 2009).
13
Capítulo 1
3.8.Colonización de la planta
Verticillium dahliae coloniza los vasos xilemáticos mediante el crecimiento micelial.
Durante ese proceso, la planta desarrolla dos tipos de defensas, las constitutivas,
consistentes en barreras físicas y químicas y las inducidas por la propia planta, una vez ha
penetrado el patógeno (Yadeta y Thomma, 2013). El éxito de la colonización también
depende de otros parámetros como la densidad de inóculo (DI) del patógeno en el suelo y
el grado de suberificación de las células del endodermo (Prieto et al., 2009). Cuando el
patógeno se establece en el sistema vascular produce conidios, los cuales son transportados
en sentido ascendente hasta los brotes superiores de la planta (Beckman, 1987). Los
conidios germinan y producen hifas, que atraviesan los poros de las paredes laterales que
comunican los vasos adyacentes o los poros de las placas de perforación, quedando el
xilema colonizado transversal y longitudinalmente (Bishop y Cooper, 1983; RodríguezJurado, 1993).
3.9. Desarrollo de síntomas
Al igual que ocurre en otras traqueomicosis, el desequilibrio en el balance hídrico es el
principal responsable del síndrome que aparece en las plantas afectadas por V. dahliae
(Fradin y Thomma, 2006; Hall y MacHardy, 1981). Este desequilibrio es debido a una
reducción en el suministro de agua que se produce por la obstrucción mecánica de los
vasos xilemáticos (Beckman, 1987).
La invasión de los vasos xilemáticos por el patógeno va unida a la formación en éstos
de tílides producidas por las células parenquimáticas adyacentes, junto con el desarrollo de
geles de naturaleza polisacárida (Baídez et al., 2007; Rodríguez-Jurado et al., 1993).
Además, en los vasos de xilema se depositan compuestos fenólicos pre-formados que
muestran un efecto tóxico contra V. dahliae (Baídez et al., 2007). Los compuestos
fenólicos tras su oxidación por enzimas polifenoloxidasas, dan lugar a la coloración
castaño-oscura del tejido vascular. La presencia principalmente de los geles, tílides y
estructuras del hongo en el xilema de la planta infectada contribuyen a la oclusión y
reducción del flujo de savia bruta en el mismo, particularmente en el tallo y peciolos
foliares, que junto con enzimas líticas fúngicas, fitohormonas vegetales y fitotoxinas
contribuyen al desarrollo de los síntomas de Verticilosis (Beckman, 1987; Mace et al.,
1981).
3.10. Factores que contribuyen a la importancia y distribución de la
Verticilosis del olivo: epidemiología.
Hay un elevado número de factores que contribuyen a la distribución e importancia de
la VO, que pueden influir ya sea en el patógeno, en el huésped y/o en el ambiente: uso de
material de propagación infectado, la eficacia en la dispersión del patógeno, el uso
predominante de cultivares susceptibles, el mal uso del riego y la fertilización, el
inadecuado manejo del suelo y las técnicas de cultivo, factores climáticos y edáficos, etc.
14
Introducción y Objetivos
(López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). Sin embargo, el establecimiento de nuevas
plantaciones en suelos infestados como consecuencia del cultivo previo con huéspedes de
V. dahliae es la causa que se considera más importante de la actual distribución y
dispersión de VO (Blanco-López et al., 1984, Bejarano-Alcázar et al., 1996; LópezEscudero y Blanco-López, 2001; Wilhelm y Taylor, 1965). En cualquier caso, la influencia
de algunos de estos factores no ha sido contrastada científicamente hasta el momento,
como ocurre con el riego o la fertilización.
3.10.1. Factores que favorecen la persistencia, incremento y dispersión del
patógeno.
El desarrollo epidémico de VO se ve favorecido por la prolongada supervivencia de
los ME de V. dahliae en el suelo, donde son incorporados al final de la fase parasítica junto
con los restos vegetales infectados (Wilhelm, 1955). Del mismo modo, el patógeno puede
persistir, e incluso aumentar su DI en el suelo mediante la colonización de una amplia
gama de cultivos herbáceos y leñosos, así como especies de flora silvestre. Por tanto, se
debe prestar especial atención al uso de especies susceptibles como cubiertas vegetales ya
que pueden contribuir a aumentar el número de propágulos infectivos del patógeno en la
plantación. Además tal como se ha dicho en el epígrafe 3.2.1, este hongo tiene la capacidad
de sobrevivir en algunas especies de gramineas (Benson y Ashworth, 1976; Martinson y
Horner, 1962; Levy e Isaac, 1976).
3.10.2. Dispersión de Verticillium dahliae.
El uso de material de propagación infectado o procedente de viveros donde se haya
empleado suelo infestado se ha descrito como uno de los principales medios para la
dispersión de V. dahliae (Hiemstra, 2015; Thanassoulopoulos, 1993). Obviamente, un paso
inicial obligatorio para un control efectivo de la VO es la implementación de un programa
de certificación orientado a producir plantones de olivo libres del patógeno (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011).
En olivo, además de los brotes y ramas infectadas, se ha demostrado la presencia de
ME del patógeno en hojas infectadas (Estrada et al., 2008; Jiménez-Díaz et al., 2008;
Tjamos y Botseas, 1987), en las inflorescencias (Trapero et al., 2011a) y en las propias
semillas de las aceitunas (Karajeh 2006). En este contexto, la utilización como cubierta de
restos de poda triturados procedentes de árboles afectados por la enfermedad, o la
utilización de enmiendas vegetales con tejidos infectados por el patógeno puede contribuir
a incrementar la DI de V. dahliae en el suelo (López-Escudero et al., 2008; Jiménez-Díaz
et al., 2012).
Los ME presentes en el suelo o en los restos de plantas infectadas pueden dispersarse
por el viento (Easton et al., 1969; Klosterman et al., 2009; Tsror, 2011), la escorrentía
(López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011), el riego (García-Cabello et al., 2012; MorañoMoreno et al., 2008; Rodríguez-Jurado y Bejarano-Alcázar, 2007), el uso de estiércol
15
Capítulo 1
procedente de ganado alimentado con restos de plantas infectadas (López-Escudero y
Blanco-López, 1999), por la utilización de aperos en el laboreo dentro de la parcela y entre
parcelas (Wilhelm y Taylor, 1965; López-Escudero et al., 2008), y/o por el transporte
humano de residuos de plantas infectadas (Navas-Cortés et al., 2008; Tjamos y Botseas,
1987; Tjamos y Tsougriani, 1990; Wilhelm and Taylor, 1965).
3.10.3. El riego como factor agronómico que favorece el inicio y el desarrollo de
la enfermedad.
La influencia del riego en el desarrollo de las Verticilosis ha sido estudiada
principalmente en plantas herbáceas, sín embargo también hay algunos estudios referentes
a cultivos leñosos, en los que está incluido el olivo.
Talboys y Wilson (1970) no encontraron ningún efecto en la Verticilosis del lúpulo
después de una época prolongada de lluvias. En un estudio pionero sobre la producción de
látex en Guayule, Schneider (1948) demostró que la Verticilosis en este cultivo aumentaba
a la vez que se incrementaba la frecuencia en el riego. El grupo de plantas regadas cada 4
semanas presentó un 42 % de incidencia final, el que se regaba cada 2 semanas un 62%, el
grupo que se regaba semanalmente, un 77% de incidencia y en aquellas que no se habían
regado, la incidencia fue de un 8%. Leyendecker (1950) obtuvo resultados similares en
algodón. Por su parte, Schnathorst (1981) afirmó en sus experimentos en condiciones de
secano, que las plantas resistentes a sequía, generalmente no se encontraban afectadas por
la enfermedad. Sin embargo, los problemas aparecieron cuando el riego fue introducido de
manera artificial. Karaca et al. (1971), también en cultivo de algodón, demostraron que la
temperatura del suelo a una profundidad de 5 y 15 cm en Julio se reducía en 4 ó 5 grados
después del riego, permitiendo al patógeno causar infecciones. En berenjena un aumento
del riego acentuó el efecto negativo de V. dahliae reduciendo significativamente la
producción y la calidad del fruto (Blestos et al., 1999). También, en alfalfa, en la que la
Verticilosis está causada por V. albo-atrum, Palatinus (1983) demostró que la severidad de
síntomas era mayor en condiciones de regadío que en condiciones de secano. Gossen y
Jesperson (1990) observaron en este mismo cultivo, que un aumento de la frecuencia en el
corte junto a un aumento del riego por aspersión también acentuaba el desarrollo de la
enfermedad. Otros autores, como Xiao y Subbarao (1997), conjeturaron que la alta
densidad de raíces en coliflor causada por un régimen elevado de riego podía explicar la
alta incidencia y severidad de esta enfermedad en este cultivo, hecho que fue demostrado
en sus estudios posteriores (Xiao y Subbarao, 2000). Cappaert et al. (1992; 1994) en sus
trabajos realizados con patata llegaron a la misma conclusión. Además, Grimes y Yamada
(1982) observaron en algodón que al reducir el riego disminuía la enfermedad, pero
también la producción del cultivo, concluyendo que el control de la Verticilosis basado en
estrategias de riego era un delicado balance entre el agua aportada, el progreso de la
enfermedad y la productividad. Cappaert et al. (1994) también observaron en el cultivo de
patata que, en condiciones de alta humedad (-0.01 MPa), V. dahliae causaba una reducción
16
Introducción y Objetivos
de la biomasa en la parte aérea de las plantas. Todos estos estudios contrastan con los
resultados obtenidos por Baard and Pauer (1981) que no identificaron un aumento de la
enfermedad en los cultivos de algodón y estramonio cuando se les aplicó diferentes
procesos de secado y humedecimiento del suelo.
Otro efecto que puede causar un riego abundante es el incremento del movimiento de
los conidios de Verticillium spp en el tejido vascular, aumentando la colonización y el
desarrollo de la enfermedad (Cappaert et al., 1994; Powelson y Rowe, 1993; Xiao y
Subbarao 1998).
Asimismo, un aspecto a tener en cuenta, es que el efecto de la resistencia a la
enfermedad parece prevalecer al efecto del riego. Este hecho se ha observado
particularmente en cultivos herbáceos, aunque hay también algunas evidencias en cultivos
leñosos, incluido el olivo. Por una parte, Pennypacker et al. (1991) afirmó que la
resistencia a V. albo-atrum en alfalfa permanecía estable bajo condiciones de estrés
hídrico; y Jefferson y Gossen (2002) concluyeron también en este cultivo que el efecto de
la Verticilosis era mayor en variedades susceptibles sometidas a una alta frecuencia de
riego en comparación con variedades resistentes. Wheeler et al. (2012) llegó a la misma
conclusión en algodón, ya que en sus estudios los cultivares más resistentes sometidos a un
riego óptimo actuaron mejor contra la enfermedad que los cultivares susceptibles. De
hecho, algunos autores como Arbogast et al. (1999) han observado en patata que el estudio
de la respuesta de diferentes cultivares a tratamientos de estrés hídrico podía ser una
herramienta eficaz para evaluar la resistencia a esta enfermedad.
El efecto de la salinidad en los cultivos herbaceos no está tampoco claramente
separado del efecto del agua, de los ciclos de frecuencia de riego y de la resistencia del
cultivar. Bershi (1981) y Kaufman et al. (1990) observaron que regar con agua salina
aumentaba las infecciones de V. dahliae en algodón y patata. Otro de los parámetros que
puede interaccionar es la densidad de plantación. Así Huisman y Grimes (1989) vieron en
campos infestados de algodón que frecuencias bajas de riego y altas densidades de
plantación (200.000 plantas/ha) la severidad de los síntomas (defoliación) disminuía. Sin
embargo, cuando se aumentaba el número de riegos las plantas presentaban más
defoliación. El riego también puede interaccionar con la fertilización realizada en este tipo
de cultivo. Una alta dosis de riego acompañada con un aporte alto de nitrógeno incrementa
el desarrollo de la enfermedad (Bell, 1992). Por norma general, el riego y el nitrógeno
aumentan la producción de algodón, excepto si el cultivo se encuentra afectado por V.
dahliae (Pegg y Brady, 2002).
En cultivos leñosos la información científica es escasa (Hiemstra y Harris, 1998)
aunque el efecto del riego ha sido estudiado en algunos huéspedes leñosos como el
albaricoque (Vigouroux, 1984), Cacao (Emechebe, 1980), Arce (Shulfelt y Linderman,
1986) o el árbol de las tulipas (Morehart y Melchior, 1982). Shufelt y Liderman (1986)
observaron en plantaciones de arce (Acer spp.) que el periodo de incubación de la
enfermedad disminuía al aumentar el riego. Vigouroux (1984) en sus estudios con
albaricoque (Prunus armeniaca) determinó que un riego abundante con altos niveles de
17
Capítulo 1
nitrógeno hacía que la enfermedad aumentara. En Moldavia, la Verticilosis en ciruela en
los años 70, solo fue problemática en zonas de regadío (Gavrilenko et al., 1977). Caroselli
(1957) sin embargo, vio que la Verticilosis en arce era mucho más severa en condiciones
de estrés hídrico que en condiciones de humedad excesiva.
En olivo, las pérdidas provocadas por esta enfermedad están aparentemente
relacionadas con el regadío o elevadas dosis de riego (Al-Ahmad y Mosli, 1993; BlancoLópez y DeVay, 1987; Cirulli et al., 1988; Jiménez-Diaz et al. 2012; López-Escudero y
Blanco-López, 2005; López-Escudero et al., 2010; López-Escudero y Mercado-Blanco
2011; Ruggieri 1948; Serrhini y Zeroual 1995). Existen estudios científicos que aseguran
que la incidencia de la enfermedad y la prevalencia se incrementan significativamente
cuando los olivares son reconvertidos de secano a regadío (López-Escudero et al., 2010;
Rodríguez et al., 2008; 2011). Asimismo, se ha demostrado que el agua recogida de los
pozos o la distribuida por las estaciones de bombeo utilizadas para regar los campos
olivareros, es un medio importante de dispersión e infección del patógeno (García-Cabello
et al. 2012; Rodríguez Jurado y Bejarano Alcázar, 2007). Además, López-Escudero et al.,
2010 encontraron que el patotipo D de V. dahliae se encontraba con mayor frecuencia en
los olivares en riego (79%) que en los olivares de secano (43%), mientras la presencia de
aislados ND es la misma tanto en regadío como en secano. También, un inadecuado
manejo del riego puede ser un factor predisponente a la enfermedad en las zonas de
regadío. Por ejemplo, en Israel la Verticilosis del olivo aumentó considerablemente en los
cultivares Barnea, Picual y Souri cuando estos fueron regados con agua salina con una
concentración de sales de 4.2 ds/m (Levin et al. 2003a,b, 2007).
También en olivo, se ha percibido en observaciones a largo plazo, empleando
fotografías aéreas de los vuelos cartográficos de los diez últimos años sobre zonas de
plantaciones afectadas plantadas con diferentes cultivares de olivo en la zona de Menjibar
(Término municipal de Jaen, Valle del Guadalquivir) que la resistencia del cultivar
Frantoio, no se vio alterada por la introducción del riego como sí ocurrió con el cultivar
susceptible Picual (Ostos et al., 2015).
El riego puede además intensificar la VO al incrementar la densidad de finas raíces
aumentado la probabilidad de contacto entre las estructuras de resistencia del patógeno y el
huésped, así como la translocación de conidios dentro de los vasos del xilema como
resultado de un aumento de la transpiración (Fernández et al., 1991; Jiménez-Díaz et al.,
2012; López-Escudero y Blanco-López 2005; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011).
En este sentido, Rodríguez et al. (2008) afirmaron que el riego en combinación con
plantaciones en alta densidad favorecía la incidencia de esta enfermedad. Estos resultados
contrastan, sin embargo, con los obtenidos por Roca et al. (2015), los cuales observaron
que las plantaciones de olivar en alta densidad parecían no tener un mayor desarrollo de la
enfermedad que aquellas plantaciones de densidad de plantación más baja.
Por otra parte, el efecto del riego sobre VO podría estar influenciado por la fisiología
del árbol. El olivo está bien adaptado al clima mediterráneo, por lo que la conductancia
18
Introducción y Objetivos
estomática es alta por la mañana, coincidiendo con una baja transpiración y reducida al
mediodía, cuando la transpiración es alta (Orgaz y Fereres, 2008). Estas variaciones
diurnas ocurren superpuestas a la variación estacional en evapotranspiración la cual es alta
en primavera y verano y baja en otoño e invierno (Orgaz et al., 2006). A pesar del aparente
efecto del riego en la VO, aún no existe ningún estudio científico con los objetivos
expresos de abordar la influencia del agua de riego en el desarrollo de la enfermedad.
3.10.4. Otros factores agronómicos que favorecen el desarrollo de la
enfermedad.
La influencia de la fertilización en las enfermedades vasculares ha
un amplio rango de cultivos (Datnoff et al., 2007; Huber y Tompson
2012; Pegg y Brady 2002). Sin embargo, la mayoría los estudios se
cultivos herbáceos y en cualquier caso existe poca información en
incluyendo al olivo.
sido estudiada en
2007; Mcmahon,
han realizado en
especies leñosas,
Numerosos estudios documentan que bajos niveles de nitrógeno ocasionan una
disminución de la susceptibilidad a las Verticilosis (Isaac, 1957; Sivaparakasam y
Rajagopalan, 1974; Sewell y Wilson, 1967; Talboys, 1987). Un alto contenido de
nitrógeno en situaciones de deficiencia de potasio provoca sin embargo un incremento de
la severidad de la enfermedad (Pegg y Brady, 2002; Presley, 1950; Presley y Dick, 1951;
Young et al., 1959). El uso de diferentes fuentes de nitrógeno también puede influir en el
grado de susceptibilidad de la planta. Algunos autores aseguran que el radical NH4-N causa
una disminución del número de estructuras de resistencia del patógeno (Alitane, 2015;
Pegg y Brady 2002). Esta disminución puede ser causada por las toxinas que genera este
radical sobre el patógeno (Carns et al., 1964) o por el estímulo que ejerce este elemento en
el crecimiento de la fauna antagonista (Chernyayeva et al., 1984). En cambio, según otros
autores, el radical NO3-N aumenta el contenido de estructuras infectivas del patógeno
(Muromtsev y Chernyaeva, 1979; Chernyayeva et al., 1984). Cabe remarcar también, que
una aplicación inadecuada de estos dos elementos puede causar una alteración del pH que
podría ser nociva para el patógeno y para la planta.
La influencia de altas densidades de plantación sobre VO ha sido poco investigada.
Roca et al. 2015 estudiaron, como ha sido comentado en los epígrafes anteriores, el efecto
de densidades de plantación intensiva (>200 árboles/ha) o superintensiva (2000 árboles/ha,
dispuesta en seto) sobre el desarrollo de VO. Estos autores, concluyeron que la densidad de
plantación no alteraba la incidencia de VO en condiciones de campo. El laboreo de las
plantaciones olivareras podría constituir un importante mecanismo de dispersión del
patógeno (Hiemstra y Harris, 1988; Pegg y Braddy, 2002). Esta práctica cultural además,
podría causar daños en las raicillas más superficiales de los olivos facilitando la infección
por el patógeno (López-Escudero y Blanco-López 2011; Tjamos, 1993). Asimismo, la
incorporación al suelo de restos de poda de material infectado o tener cerca de la
plantación cultivos susceptibles a la enfermedad, constituye un aporte importante de
19
Capítulo 1
inóculo (López-Escudero et al., 2008). Obviamente, todas estas prácticas tendrían que
evitarse en las áreas donde la VO esta presente.
3.10.5. Factores ambientales: Temperatura, características edáficas y
interaciones bióticas.
La temperatura óptima para V. dahliae oscila entre 22 y 25 ºC (López-Escudero y
Mercado-Blanco, 2011). Éste es un rango de temperatura favorable para el desarrollo de
muchas marchiteces provocadas por Verticillium spp. (Garber y Presley, 1971). En el caso
de la VO, algunos datos indican que la severidad de los ataques se ve favorecida por
temperaturas del aire comprendidas entre 20 y 25 ºC durante los días de primavera,
seguidas de veranos con picos no superiores a 30-35ºC (López-Escudero y Blanco-López,
2001; Wilhelm y Taylor, 1965).
La textura también parece tener un efecto variable en el patógeno y en la enfermedad
como consecuencia de las complejas interacciones que tienen lugar en el suelo. En este
sentido, prospecciones realizadas por López-Escudero et al. (2010) en el Valle del
Guadalquivir demostraron que la incidencia de la enfermedad era significativamente más
baja en olivares establecidos en suelos del tipo Alfisol (porcentaje medio del 12.9%) que
en olivares establecidos en suelos del tipo Entisol, Inceptisol o Vertisol (USDA Soil
Taxonomy).
El grado de acidez de los suelos también puede afectar a V. dahliae. Normalmente este
patógeno sobrevive en suelos neutros o alcalinos, pH 6-9. A pH de 5.5 o inferiores la
producción de ME y la supervivencia del patógeno disminuye notablemente (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011). Bell (1992) conjeturó que este hecho podía deberse a
que en suelos ácidos los iones Mn y Al se acumulan en mayor proporción en las plantas en
comparación con los suelos neutros. Orellana et al. (1975) también comprobaron que el
aluminio se acumulaba en las plantas cuando el pH del suelo era bajo, lo que generaba una
disminución del crecimiento del patógeno y una inhibición casi total de la germinación de
ME. Otros autores también verificaron con sus estudios que la acidificación del suelo
causada por Al2(SO4)3 reducía notablemente la formación de propágulos viables (Pegg y
Brady, 2002).
Por último, un aspecto relevante que puede tener importantes consecuencias
epidemiológicas es la interacción entre V. dahliae y otros patógenos de suelo. Por ejemplo,
Phytophthora megasperma o Phytophthora inundata, causantes de la podredumbre radical
en olivo (Sánchez-Hernández et al., 1998) y V. dahliae pueden infectar de forma
simultánea la planta (Sánchez-Hernández et al., 1998; Sánchez-Alcalá, 2005). Las
infecciones provocadas por Phytophthora spp. podrían causar una modificación en el nivel
de resistencia de cultivares resistentes a V. dahliae, incrementando su susceptibilidad o
incluso ocasionando una ruptura de su resistencia al patógeno.
20
Introducción y Objetivos
3.11. Control integrado de la Verticilosis del olivo.
La VO es una enfermedad muy difícil de controlar debido principalmente a: 1) una
elevada supervivencia de las estructuras infectivas del patógeno; 2) el amplio rango de
huéspedes que puede infectar, en muchos casos sin expresión de síntomas, y que actúan
como reservorios del hongo y 3) la falta de efectividad de los fungicidas, debido a la
localización de éste en el interior del xilema o en el suelo (López-Escudero y MercadoBlanco, 2011). De esta forma, el control no suele ser efectivo cuando se aplican medidas
de forma individual, por lo que se aconseja la aplicación de una estrategia de control
integrado antes y después de la plantación (Figura 5).
Figura 5: Estrategia de Lucha integrada contra la Verticilosis del olivo (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011).
3.11.1. Medidas antes de la plantación
Este tipo de medidas de lucha son las más eficaces y económicas en el cultivo del
olivo. Las dos más importantes son plantar en suelos no infestados y utilizar material
vegetal libre de patógeno (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011).
En relación al empleo de material libre de patógeno, actualmente existe un programa
de certificación de material vegetal para la producción de plantas de olivo libres de V.
dahliae, así como de otras enfermedades, regulado por el Real Decreto 1678/1999 del
21
Capítulo 1
Ministerio de Agricultura (Anónimo, 1999). Esta medida está justificada por la existencia
de infecciones asintomáticas en olivo, cuya detección es primordial.
Para la elección de suelos no infectados es esencial tener una información sobre los
cultivos previos que se han sembrado con anterioridad en la parcela (Blanco-López y
Jimenez-Díaz, 1995; Blanco-López et al., 2002; López-Escudero et al., 2003) y en el caso
de que se hayan empleado cultivos susceptibles a V. dahliae se deberá estimar la existencia
de ME en el suelo. El método de detección y cuantificación más manejado y más
convencional es el que utiliza placas con medio de cultivo semi-selectivo APSM (Agar
Polipectato Sódico Modificado) (Butterflied y Debay, 1997; Harris et al., 1993;
Termorshuizen, 2000). En la actualidad han surgido diferentes técnicas derivadas de la
metodología PCR que muestran resultados satisfactorios en la detección y cuantificación
de Verticillium spp. donde se incluye V. dahliae, en suelos naturalmente infestados
(Debode et al., 2011; Moradi et al., 2014). Si el resultado es positivo, se debe proceder a la
desinfestación del suelo para reducir la población del patógeno. La solarización es uno de
los métodos de control físico más efectivo (Katan, 1987, 2000; López-Escudero y BlancoLópez, 2001; Tjamos et al., 1991). La solarización suele emplearse para tratamientos
puntuales, y consiste en cubrir el suelo con film de polietileno transparente y aplicar
abundante agua, produciéndose el calentamiento húmedo progresivo del suelo con el calor
procedente de la radiación solar hasta llegar a alcanzar temperaturas entre 35 y 60ºC,
suficientemente altas como para matar a los ME del patógeno (Katan, 1987).
3.11.1.1. Uso de cultivares resistentes
La opción más eficiente en la lucha contra la VO es el empleo de genotipos resistentes,
ya sea por la evaluación de los cultivares de olivo existentes o por la obtención de nuevos
genotipos de olivo resistentes al patógeno mediante la mejora genética.
La resistencia de genotipos de olivo a la VO en inoculaciones controladas o en campos
naturalmente infestados por el patógeno ha sido investigada por diferentes autores. (Abo
Shkeer, 2010; Blanco-López 1984; Birem, 2010; Bubici y Cirulli, 2012; Caballero et al.,
1980; García-Ruiz, 2014; García-Ruíz et al., 2014a; 2014b; 2014c; 2015: López-Escudero
et al., 2004; 2007b; Martos-Moreno, 2003; Martos-Moreno et al, 2006; Trapero et al.,
2013; 2015).
Martos-Moreno et al. (2006) observaron que ‘Cornicabra’, ‘Picual’ y ‘Picudo’ eran
cultivares extremadamente susceptibles a VO mientras que ‘Arbequina’ mostraba mayor
resistencia, a pesar que anteriormente en inoculaciones artificiales se había incluido en el
grupo de cultivares altamente susceptible al patotipo D de V. dahliae (López-Escudero et
al., 2004). Estos resultados coinciden con las observaciones realizadas por Trapero et al.
(2013) y Roca et al. (2015) en los que ‘Arbequina’ se mostró como un cultivar
moderadamente resistente a la enfermedad. Trapero et al. (2013) en sus estudios
observaron que los cultivares Bodoquera, Picual y Manzanilla de Sevilla eran altamente
susceptibles a VO. Estos resultados a excepción de ‘Bodoquera’, coinciden con los
22
Introducción y Objetivos
obtenidos en condiciones controladas por otros autores (García-Ruíz, et al., 2014a, 2014b,
2014c; López-Escudero et al., 2004, 2007b; Martos-Moreno et al. 2006).
‘Picual’, tal como se ha dicho en los párrafos anteriores, es altamente susceptible a
VO. De hecho se suele usar rutinariamente en los experimentos como control susceptible y
este puede ser severamente dañado incluso por muy bajas cantidades de inóculo en el suelo
(López-Escudero y Blanco-López, 2007a).
El cultivar Hojiblanca en campos altamente infestados por aislados altamente
virulentos (patotipo D) se muestra altamente susceptible a esta enfermedad (Trapero et al.,
2013). Este hecho coincide con los resultados obtenidos en condiciones controladas por
otros autores (López-Escudero et al., 2004) y de campo (López-Escudero y Blanco-López,
2001). Sin embargo, se ha podido comprobar que este cultivar, en algunos campos
comerciales donde los suelos están moderadamente infestados por V. dahliae, no es tan
sensible a VO (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011).
De forma similar a ‘Arbequina’, el cultivar griego Koroneiqui y el cultivar español
Sevillenca muestran un nivel de resistencia mayor que los cultivares susceptibles en
condiciones de campo (Trapero et al., 2011b, 2013)
Por otra parte, los cultivares Changlot Real, Empeltre y Frantoio según diversos
estudios muestran, en condiciones de campo, una reacción de resistencia a V. dahliae
(López-Escudero et al., 2004; Martos-Moreno 2003; Trapero et al., 2013). El cultivar
italiano Frantoio seguramente sea en España, el más conocido de los tres (Barranco et al.,
2008). La respuesta de ‘Frantoio’ a VO ha sido bien documentada bajo condiciones
controladas y de campo (Bubici y Cirulli, 2012; García-Ruíz et al. 2014a; 2014b, 2014c,
2015; López-Escudero et al., 2004, 2007b, Trapero et al., 2013, 2015). Sin embargo, este
cultivar al igual que ‘Empeltre’ y ‘Changlot Real’, no exhiben una resistencia completa
cuando éstos son plantados en suelos altamente infestados por V. dahliae (Trapero et al.,
2013).
En este sentido, se ha de comentar que hasta el momento el Departamento de
Agronomía de la Universidad de Córdoba llevan realizando numerosos experimentos de
evaluación de resistencia a VO en ambiente controlado y en condiciones de campo donde
se ha estudiado el nivel de resistencia relativo alrededor de 250 cultivares nacionales y
extranjeros y de más de 11000 genotipos (Abo Shkeer, 2010; Birem, 2010; García-Ruiz et
al. 2014a, 2014b, 2014c; López-Escudero et al., 2004; 2007b; Martos-Moreno et al., 2006;
Trapero et al. 2013, 2015; Valverde-Caballero, 2014).
3.11.2. Medidas después de la plantación
Una vez establecida la plantación, las medidas de lucha deben de ir dirigidas a evitar la
llegada del patógeno y disminuir la incidencia y severidad de la enfermedad. Las
23
Capítulo 1
estrategias deben consistir en la aplicación de métodos excluyentes, erradicativos y de
escape (Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011).
3.11.2.1. Métodos excluyentes
Estos métodos tienen como objetivo limitar o impedir el acceso del patógeno al campo
y su posterior distribución, pudiendo aplicarse antes o después de la plantación. El hongo
puede acceder a la plantación asociado a partículas de suelo, o bien, dispersarse mediante
restos de tejidos de plantas infectadas a través del agua de escorrentía, del agua de riego o
del viento. Por ello, las plantaciones de olivar deben situarse lejos de las zonas de
influencia, por la pendiente o vientos dominantes, de cultivos huéspedes del patógeno. Los
huertos dentro o en las proximidades de la plantación también deben ser evitados, así como
el laboreo en la medida de lo posible (Trapero y Blanco-López, 2008).
3.11.2.2. Métodos erradicativos
El objetivo es reducir la densidad de inóculo existente ya sea en el suelo o en el agua
de riego (Ver epígrafe 3.11.2.2.1) y limitar su crecimiento mediante la aplicación de
métodos culturales, físicos (solarización), biológicos o químicos (fungicidas). Tras la
plantación, la acción de estos métodos suele estar dirigida a zonas localizadas de la
plantación, evitando así problemas en la replantación de plantas muertas debido a la VO.
En cuanto a los métodos culturales se encuentra la eliminación de los tejidos
infectados por V. dahliae, que contribuyen a incrementar la población del patógeno en el
suelo y a su dispersión (Tjamos y Botseas, 1987; Navas-Cortés et al., 2008).
En olivares, la solarización como método físico erradicativo después de la plantación,
puede llegar a ser una técnica muy efectiva, siempre que se utilice de manera localizada y
dentro de una estrategia de control integrado (Jimenez-Diaz et al., 2012; López-Escudero y
Mercado-Blanco, 2011; López-Escudero et al., 2001).
La aplicación del control químico contra VO tiene severas limitaciones,
principalmente debido a la inaccesibilidad de muchos productos activos al sistema vascular
del olivo y a la persistencia y distribución de los ME en el suelo. Muchas sustancias han
sido evaluadas, particularmente fungicidas sistémicos durante estos últimos años. A pesar
de su eficacia en condiciones in vitro, no han mostrado ser efectivas en condiciones de
campo (Jimenez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011).
Sin embargo, en estos últimos años se han evaluado numerosas enmiendas orgánicas
en el control de patógenos de suelo (Bhat y Subbarao, 2001; Huang et al., 2006;
Kirkegaard y Sarwar, 1998; Lazarovits et al., 2000; Tsror et al., 2007). Recientemente se
han realizado experimentos en condiciones controladas de laboratorio y campo, para
comprobar la efectividad de determinadas enmiendas orgánicas en el control de la VO. En
estos estudios se ha comprobado que el compost de vid y el compost de alperujos mejorado
24
Introducción y Objetivos
con microorganismos, fueron, entre las evaluadas, las enmiendas orgánicas más eficaces en
el control de esta enfermedad (Varo-Suarez et al., 2015a).
El control biológico de enfermedades mediante hongos o bacterias se ha considerado
un método alternativo al empleo del control químico (Cook, 1993; Heydari y Pessarakli,
2010). Las interacciones que se dan entre planta/microorganismos son muy variadas, e
incluyen mutualismo, comensalismo, neutralismo, competición, parasitismo, etc. (Bull et
al., 2002; Bankhead et al., 2004; Chisholm et al., 2006 Fitter y Garbaye, 1994; Hoitink y
Boehm, 1999). En el caso del olivo el control biológico mediante el empleo de
microorganismos antagonistas a V. dahliae es una medida que puede ser aplicada de forma
preventiva, o de manera paliativa una vez se haya producido la infección (López-Escudero
y Mercado-Blanco, 2011). En este sentido Mercado-Blanco et al. (2004) observaron que
Pseudomonas fluorescens, en plantones del cultivar Picual inoculados con V. dahliae,
disminuía la severidad final de la enfermedad entre un 31% y un 82%. En ensayos
posteriores, además se comprobó el carácter endófito de P. fluorescens PICF7 en olivo
(Prieto y Mercado-Blanco, 2008). Varo-Suarez et al., (2015b) también observaron que la
cepa de Fusarium oxysporum FO12 controlaba eficazmente la enfermedad en plantones de
olivo del cultivar Picual bajo condiciones de invernadero.
En olivo también se han desarrollado algunos estudios para evaluar la resistencia
inducida en la que un organismo similar o estrechamente relacionado con el patógeno
activa los mecanismos de defensa de la planta. Particularmente, Martos-Moreno (2003)
evaluó la reducción de la VO ocasionada por aislados muy virulentos (defoliantes) cuando
las plantas eran previamente inoculadas con aislados de baja virulencia (no defoliante).
3.11.2.2.1 Erradicación de agentes fitopatógenos en el agua de riego.
El agua de riego, tal como se ha especificado en el epígrafe anterior, es una fuente de
inóculo importante para la dispersión e infección del patógeno. Por esta razón existen
múltiples técnicas disponibles para eliminar las distintas estructuras de V. dahliae, que se
pueden agrupar en físicas o químicas.
Entre las medidas físicas destaca la pasteurización. En el caso de V. dahliae, Bollen
(1985) llegó a la conclusión que las estructuras de este patógeno pueden ser eliminadas con
una exposición del agua a 90ºC durante 10 segundos. La pasteurización es un método muy
efectivo pero tiene como desventaja su alto coste ya que requiere una alta inversión inicial
(Hong et al., 2014). La luz ultravioleta es otro método erradicación utilizado. Este tipo de
luz provoca daños letales en el ADN de los patógenos (Harm, 1984). Esta técnica se suele
combinar con algún tipo de filtración que permite una mejor transmisión de la luz al medio
y así mejorar su eficacia (Fynn et al., 2011). La tecnología de ultrasonidos para la
eliminación de patógenos en el agua de riego se basa en cambios de presión en el interior
del líquido que dan lugar a burbujas de cavitación. Heis (2015) estudió el efecto de esta
técnica con diferentes tiempos de actuación sobre conidios de V. dahliae y en ninguno de
los tiempos encontró diferencias significativas entre los conidios tratados y no tratados. Sin
25
Capítulo 1
embargo, otros autores obtuvieron resultados satisfactorios cuando utilizaron esta técnica
contra bacterias (Ordoñez, 1984 y Scherba et al., 1991). La filtración también se presenta
como medida física de interés. El filtrado con arena se ha mostrado en algunos casos
efectivo para eliminar hongos fitopatogenos como Fusarium spp. (Minuto et al., 2008;
Postman et al., 2000; Ruina et al., 1996; Van Os et al., 2000). La instalación de un humedal
artificial formado por distintas capas de arena y grava ha sido eficaz contra algunas
bacterias y algunos oomicetos (Headley et al., 2002; Ufer et al., 2008). También con el uso
de membranas se han obtenido buenos resultados para erradicar multitud de patógenos
(Ruina, 1988). En cualquier caso la aplicación de esta técnica requiere una alta inversión
económica, por lo que este método de control es poco utilizado.
Las medidas químicas tienen también como finalidad reducir los propágulos de los
patógenos. La utilización de una sustancia clorada básica como el hipoclorito a diferentes
dosis y tiempos de actuación ha mostrado eficacia en conidios pero no en ME de V.
dahliae (Gómez-Galvez et al., 2013; Heis, 2015; Santos-Rufo y Rodríguez-Jurado, 2015).
El dióxido de cloro se ha mostrado efectivo contra numerosos patógenos como
Phytophthora spp., Colletotrichum spp., Penicillium spp., etc.. (Armitage, 1993;
Chastagner y Riley, 2002; Copes et al., 2004; Krauthausen et al., 2011; Mebalds et al.,
1996; Roberts y Reymond, 1994). El peróxido de hidrogeno y la combinación de este
compuesto con distintos ácidos (en el que destaca el ácido peracético) ha mostrado
resultados esperanzadores contra Fusarium y V. dahliae (Elmer, 2008; Gómez-Galvez et
al. 2013; Heis, 2015). Por su parte, el uso de cobre y plata ha mostrado resultados dispares.
Así, algunos investigadores obtuvieron resultados positivos en el control de algunos
patógenos (Hallsall et al., 1997; Slade y Pegg, 1993). Sin embargo, Heis (2015) observó
que se necesitaban dosis superiores a 600 ppm de cobre para disminuir la germinación de
los ME de V. dahliae. Los surfactantes o biosurfactantes han resultado ser buenos
compuestos contra algunos organismos oomicetos (Van West et al., 2003) pero no hay
información disponible de su efecto sobre las estructuras infectivas de V. dahliae.
3.11.2.3. Métodos de escape
Estos métodos reducen la eficacia para causar enfermedad y pueden actuar sobre
diversas fases del ciclo de patogénesis: reduciendo la actividad del hongo, disminuyendo la
probabilidad de contacto con la planta, limitando la infección y la colonización del huésped
o atenuando los efectos de la enfermedad. Los métodos de escape más importantes són la
reducción de laboreo (López-Escudero et al., 2008, 2010); el manejo del riego (LópezEscudero y Blanco-López, 2005; García-Cabello et al. 2012); y realizar una fertilización
equilibrada (López-Escudero y Blanco-López, 2011; Tur, 2015).
3.11.2.4. Terapia
Tal se ha comentado anteriormente, en estas últimas décadas se han utilizado
productos fungicidas sistémicos (benomilo, carbendazim, fosetil-al y las mezclas de los
anteriores con quinosol o prochloraz), algunos de ellos ya retirados del mercado, para el
26
Introducción y Objetivos
control de esta enfermedad en olivos afectados. Ninguno de estos fungicidas mostraron
resultados satisfactorios cuando se aplicaron via foliar y/o al suelo (Foldade et al., 2002;
López-Escudero y Blanco-López, 1996; Mule et al., 2002; Petsikos-Panayotarou, 1980;
Sánchez-Alcalá, 2005; Trapero y Blanco-López, 2008). De hecho, actualmente no se
dispone de ningún fungicida efectivo contra V. dahliae en condiciones de campo (Tjamos,
1993; Trapero y Blanco-López, 2008). Sin embargo, algunas técnicas basadas en
termoterapia efectivas en plantones de olivo para el control de esta enfermedad sí han
resultado efectivas (Morello et al., 2015).
4.
Justificación de la Tesis doctoral.
La posible influencia del riego en el desarrollo de la VO ha generado en el agricultor
ciertas dudas sobre el adecuado manejo del riego. Por esta razón en este trabajo se propone
abordar este aspecto y clarificar científicamente la influencia del agua de riego, de su
manejo y aplicación, sobre una de las enfermedades más importantes de este cultivo.
OBJETIVOS
El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido estudiar el efecto del manejo del
riego en el desarrollo de la Verticilosis del olivo.
Los objetivos específicos han sido:
1. Determinación de la influencia de la frecuencia de riego sobre el inicio y desarrollo
de la Verticilosis del olivo en condiciones semicontroladas (Pérez-Rodríguez et al.,
2015a; Capítulo 2).
2. Determinación de la influencia de la dosis de riego sobre el desarrollo de la
Verticilosis del olivo en condiciones de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015b;
Capítulo 3).
3. Determinación de la influencia de la frecuencia de riego en el inicio y desarrollo de
la Verticilosis del olivo en condiciones de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015c;
Capítulo 4).
27
28
Irrigation frequency in
microplots
29
30
Irrigation Frequency in microplots
THE INFLUENCE OF IRRIGATION FREQUENCY ON
THE ONSET AND DEVELOPMENT OF VERTICILLIUM
WILT OF OLIVE.
Abstract
The influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium Wilt
of Olive (VWO) was studied. A split-plot design in microplots with naturally infested soil
was established for studying four irrigation frequencies for three olive cultivars with
differing levels of disease resistance. Final disease incidence (DI) and mortality in
‘Picual’ plants subjected to daily irrigation treatment (T1) reached values of 100% and
63%, respectively. For ‘Picual’-T1 samples, the area under the disease progress curve
values were significantly different between 15 December 2012 and 15 July 2013 (14.8%
to 42.8%) compared to the average results of the other treatments, which were the
following: weekly (T2), biweekly (T3) and deficit (T4) (0.4 to 11.5%). No significant
differences between the irrigation treatments were observed in ‘Arbequina’, although the
DI progressed consistently (60% in all treatments). In ‘Frantoio’ little disease developed.
We conclude that a daily irrigation treatment encourages VWO development in the
susceptible cultivar Picual. Therefore, in susceptible cultivars growing in infested soils
under daily irrigation regimes, the extension of irrigation frequency may reduce disease
incidence. In the context of an integrated control, the use of resistant cultivars seems to be
more relevant than the detrimental effects observed in frequent irrigation schedules.
Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: marioagro25@hotmail.com.
This chapter has been published in:
Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Amaro, M., Serrano N., Lorite I. J., Arquero
O., Orgaz F., López-Escudero F. J., 2015. Influence of irrigation frequency on the onset
and development of Verticillium wilt of olive. Plant Disease 99:488-495.
31
Chapter 2
Introduction
The occurrence of vascular wilts due to the soil-borne pathogen Verticillium
dahliae Kleb are particularly correlated with the irrigation regimes of many of their hosts,
such as potato (Arbogast et al.1999), tomato (Harrington and Dovison 2000) or cotton
(Blanco-López and De Vay 1987; Huisman and Grimes 1989). In olive, this pathogen
causes Verticillium wilt of olive (VWO), a vascular disease that kills thousands of young
and producing trees annually in the major areas of olive oil and table olive production
around the world (Bubici and Cirulli 2011; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011,
2012; Tsror 2011). In the Guadalquivir Valley of Andalucía (southern Spain), where
nearly 900,000 ha of this commodity are planted (Anonymous 2013), the disease
incidence (DI) and prevalence significantly increases when orchards are reconverted from
dry lands to irrigated zones (López-Escudero et al. 2010; Rodríguez et al. 2008).
Irrigation water collected from wells or delivered from pumping stations and used
for watering olive orchards are an important means of dispersal of the infectious forms of
this pathogen (García-Cabello et al. 2012; Rodríguez Jurado and Bejarano Alcázar 2007).
Moreover, López-Escudero and Blanco-López (2005) have previously demonstrated that
drip irrigation results in an increase in the abundance of this pathogen in the soil. In this
study, we found that fungal populations in the soil were greater and increased at a faster
rate over time in the wet zones surrounding the drippers compared with the dry areas
away from them.
In this context, olive growers and agronomists assume that increasing irrigation
dosages or shortening irrigation frequencies provides some protection against
Verticillium wilt onset and decreases severity. This has been previously reported in some
woody hosts, such us maple (Shufelt and Linderman 1986). However, there is no
scientific evidence as to how this agricultural practice affects disease prevalence and
severity in olive.
In this work, we studied the influence of irrigation frequency on the onset and
development of VWO. Experiments were conducted in microplots using soil that was
naturally infested with the pathogen.
Materials and Methods
Experimental plot
The experiment was conducted under semi-controlled conditions in a plot located
in Campus de Rabanales (Universidad de Córdoba, Spain) during the period December
2011 to October 2013. This plot consisted of a line of 40 concrete containers located
above ground. Each plot was 1 m2 by 70 cm deep, open at the bottom, oriented north to
south, and protected from rain and excessive sun by a galvanized steel cover. The
microplots were filled with a soil that was naturally infested with V. dahliae. The
32
Irrigation Frequency in microplots
microplots were planted with different olive cultivars and irrigated with several different
irrigation frequencies, as explained below.
Collecting and characterizing the soil naturally infested with Verticillium dahliae.
The naturally infested soil was collected from a field located in the municipality
of Utrera (Sevilla, southern Spain) in a marsh area annually cropped with V. dahliae
hosts. In this zone, soils are heavily infested with highly virulent strains of V. dahliae
(cotton-defoliating pathotype) (Bejarano-Alcazar et al. 1996) and VWO incidence and
mortality develops quickly (Trapero et al. 2013).
To assess the fungal population in the selected plot, approximately 40 100-g soil
samples were collected from a depth of 25 to 30 cm using a cylindrical soil auger. Subsamples were bulked, crumbled, and mixed. The resulting soil samples were then air dried
for 4 weeks at room temperature. Following the drying period, samples were sieved through
a 0.8-mm sieve to remove organic debris and larger particles. Samples were then mixed
manually and air-dried for an additional 1 to 2 weeks. The inoculum density (ID) of V.
dahliae was estimated using the wet-sieving-technique described by Huisman and Ashworth
(1974). A sample aliquot of 25 g was suspended in 100 ml of distilled water, shaken for 1 h
at 270 rpm, and filtered through 150- and 35- µm sieves. The residue retained in the 35-µm
sieve was recovered in 100 ml of distilled water. Finally, 1 ml of the suspension was plated
onto a modified sodium polypectate agar medium (Butterfield and DeVay 1977) with 10
replicates. After a 14-day incubation at 22 ± 2 ºC in the dark, soil residues were removed
with tap water and colonies of V. dahliae were counted under a stereoscope microscope.
The ID in the soil was estimated using the number of colonies of V. dahliae observed and
expressed as propagules or microsclerotia (MS) per gram of air-dried soil. A highly
infested soil (21 MS/g) was chosen for the experiment.
The isolation and molecular characterization of the pathogens in the soil used for
the experiment were conducted using the methodology described by López-Escudero and
Blanco-López (2005) and Mercado-Blanco et al. (2003). This analysis revealed that
highly virulent strains of V. dahliae (defoliating pathotype) were prevalent in the soil.
Soil properties
The soil used for planting was a clay soil (pH in ClK= 7.45, organic matter =
1.57%, total CaCO3 equivalent = 25.64%, active CaCO3 = 3.33%, available K= 475 ppm,
and available P= 8.4 ppm). The soil was repeatedly cultivated in previous years with
cotton, tomato and alfalfa and surrounded by plots with similar crops.
To determine the hydraulic properties of the soil, a 12-liter plastic pot filled with
soil was watered to saturation and covered with a black plastic film to avoid evaporation.
After the water was freely drained, the plastic pot was weighed and dried in an oven at 70
ºC for 7 days. The pot was then weighed to determine the mass of water and the mass of
soil solid. The upper limit soil water content (θUL) was determined according to the
33
Chapter 2
gravimetric method using the following formula: θUL= (Vw)/(Vs), where Vw = the mass of
water and Vs = the total volume of soil. The θUL value calculated for this soil was 0.37 m3
m-3.
The available water in this soil was also assessed by measuring the lower limit of
the soil water content (θLL). To calculate this variable, barley seeds were sown in a 12liers plastic pot filled with soil. When the plants reached maximum vegetative growth, the
irrigation was cut. After plants had died, the soil water content was determined using the
above formula. The θLL value calculated for this soil was 0.17 m3 m-3.
Plant material
Nine-month-old rooted olive cuttings of cultivars with differing levels of resistance
to infections caused by V. dahliae were used in the experiment. The cultivars used were as
follows: ‘Picual’ (susceptible to disease), ‘Arbequina’ (moderately susceptible) and
‘Frantoio’ (resistant) (López-Escudero et al. 2004; Martos-Moreno et al. 2006). The
cuttings were clones of each cultivar. These were obtained from certificated mother olive
plants free of pathogen infection from the World Olive Germplasm Bank (Caballero and
Del Río 2008) from IFAPA, Centro ‘Alameda del Obispo’, Córdoba, Spain, and
propagated according Caballero and Del Río (2010).
At the beginning of the experiment, plants were 0.5-0.7 m high, with a single
trunk, and with two or three secondary branches. The initial leaf area and aerial biomass
of the plants were 297.1 cm2/plant and 11.7 g/plant, respectively, for ‘Picual’ plants,
283.2 cm2/plant and 12.6 g/plant, respectively, for ‘Arbequina’ plants, and 200 cm2/plant
and 12.5 g/plant, respectively, for ‘Frantoio’ plants.
Irrigation treatments.
For this experiment, the following four irrigation frequencies were analyzed: daily
(T1), weekly (T2), biweekly (T3), and deficit (T4). Irrigation scheduling (see below) was
calculated using the relative soil water deficit (RSWD) parameter according to the
following formula: RSWD = (θUL- θi)/(θUL- θLL), where θi is the volumetric soil water
content. For the T1, T2 and T3 treatments, the RSWD parameter was generally < 0.9. For
the T4 treatment, the RSWD parameter was generally ≥ 0.9. For this treatment, irrigation
frequencies were greater in the spring and summer (approximately 20 days) and lower in
the winter (approximately 40 days).
Microplot establishment and experimental design.
In October 2011, approximately 36 tons of the collected soil was carried from the
Utrera Marsh to the experimental plot in Rabanales. The soil was homogenized by
continuous crumbling and mixing using a tractor shovel at the experiment site. Each
34
Irrigation Frequency in microplots
microplot was filled with 800 kg of soil (bulk density= 1300 Kg/m3). For the noninfested
control microplots, the soil was sterilized.
Olive plants were transplanted in December 2011. A split-plot design was used.
Three microplots per cultivar and watering treatment were used, with 9 plants per
microplot. Two non-infested control microplots, irrigated according to the T1 treatment,
were assigned to each cultivar.
Plants were drip irrigated using a programmable irrigation controller (Image 6
Rain Bird, Rain Bird Iberica S.A., Spain) connected to a PVC water pipe (50 mm
diameter and 40 m long) extended along the container line. For each microplot, a
stopcock, six branch lines (16 mm in diameter and 80 cm in length, and with 16.5 cm
spacing), and 36 compensating drippers (2 liters/h, 6 per branch) (NetafimTM) were
connected to the pipe.
Soil water content measurement in the microplots.
The soil water content in each microplot was recorded every 15 days using a time
domain reflectometry (TDR) system (6050X1 Trase System I; Soil Moisture Equipment
Corp., Santa Barbara, CA). Data were used for planning an irrigation schedule that was
individually calculated for each treatment and microplot. The volumetric water content of
each container (RSWD level) was maintained corresponding to its irrigation treatment.
Inoculum density of Verticillium dahliae in microplot soil.
The ID of the pathogen in the soil was assessed just before and at the end of the
experiment for all individual microplots and for all treatments. A 100-g soil sample was
taken from the 0-to 25-cm depth profile from each container using a cylindrical auger.
The ID was quantified using the method described above.
Disease progression and tree development.
The experimental plot was surveyed periodically for 22 months after planting for
disease symptoms, particularly during the most favorable environmental periods for
disease development (for our conditions, these periods were spring, early summer and
fall). Disease severity was estimated based on a 0-to-4 rating scale according to the
percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis
or defoliation (0 = no symptoms; 1 = 1-33%; 2 = 34-66%; 3 = 67-99%; 4 = dead plant).
These values were used to build the progress curves for the DI of the affected plants and
the mean severity of the symptoms over time during the recording period. Curves of
mean severity over time were adjusted to the logistic model.
The parameter ρ1 is the upper asymptote, ρ2 is related to initial level of disease severity,
and ρ3 is the rate of the process (Hau et al. 1993, Navas-Cortés et al. 2008).
35
Chapter 2
For these curves, the maximum disease progress rate (MDPR) (the slope of the
tangent line at the inflection point of the curve) was calculated as described by Moral and
Trapero (2009). Moreover, the time elapsed between plantation establishment and when
50% of diseased trees (DI50), 50% of dead trees (M50) and 50% of the maximum values
of disease severity (value=2) (MS50) were reached was also calculated for each
treatment.
At the end of the experiment, the area under the disease progress curve (AUDPC)
was estimated as the percentage of the maximum possible value in the considered period
according to the following formula based on Campbell and Madden (1990): AUDPC =
[(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, where t = the interval in days between
observations; Si = the final mean severity; 4 = the maximum disease rating; n = the
number of observations. This value was also calculated for three other recording times
during the assessment period in which the interaction between the irrigation treatment
frequency and cultivar became significant.
The final percentage of dead plants, or mortality (M), was also considered in
estimating the severity of the reactions. The time that elapsed from transplanting to the
onset of disease symptoms (FS) and the mean mortality time (MM) (mean time between
the onset of disease symptoms and plant death) were determined for all irrigation-cultivar
treatments.
To avoid the incorporation of new inoculum into the soil, falling leaves and dried
plant debris from dead shoots and buds from affected plants in infested microplots due to
slow decline caused by pathogen infection (López-Escudero and Mercado-Blanco 2011)
were removed periodically from the surface of the microplots.
Pathogen isolation.
Plant infection was confirmed by isolating the fungus from the affected shoots or
leaf petioles of diseased plants. Affected woody tissue samples were washed in running
tap water and the bark was removed. The tissue surface was then disinfected in 0.5%
sodium hypochlorite for 1 min. Wood chips were placed on potato dextrose agar (PDA)
plates and incubated at 24 ºC in the dark for 6 days. When affected tissues did not yield
detectable pathogen cultures, shoot tissues were analyzed using polymerase chain
reaction methods, as described by Mercado-Blanco et al. (2003).
Data analysis.
In this trial, an analysis of variance (ANOVA) of the parameters was performed
using the Statistix 10.0 software program (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA).
The mean values of the analyzed parameters were compared using Fisher’s protected
least significant differences test at P = 0.05.
36
Irrigation Frequency in microplots
To determine whether there was significant interaction between the irrigation
frequencies and the cultivars, an ANOVA was performed using the most representative
disease parameter, AUDPCP, as the dependent variable. Data were analyzed in a splitplot design with the irrigation frequency as the main plot and the cultivars as the subplot.
MM and FS parameters were analyzed using nonparametric Kaplan–Meier survival
analysis (Kaplan and Meier 1958), in which the survival times were calculated as the
week in which a plant died or showed disease symptoms for the first time. Pair-wise
comparisons were tested using the log-rank test at P = 0.05 and performed using the
SPSS software program (Statistical, Package for Social Sciences, SPSS Inc. Chicago).
Nonlinear regression analyses were conducted using mentioned Statistix 10 software. A
pseudo-R2 parameter was used to evaluate the appropriateness of the logistic model to
describe the data.
Results
ID of V. dahliae in the soil.
Soil analyses of ID at a depth of 20 cm revealed that pathogen MS were present in
all microplots at the two recording times. ID in the container soil was homogeneous, with
an average value of 9.8 MS/g. No significant differences were detected in the initial and
final amounts of soil pathogens between microplots with different irrigation treatments
and different cultivars
Disease symptoms.
During the experiment, the affected plants exhibited slow decline (López-Escudero
and Mercado-Blanco, 2011). During the fall and early spring, plants showed chlorosis, dieback, and rolling of the leaves without the defoliation of green leaves.
Necrosis and desiccation in flowers mainly occurred during the second year of
observation in Picual and Arbequina trees. Defoliation and sudden wilt were frequently
observed together in Picual under T1 treatment.
Pathogen isolation from affected tissues.
Tissues from the stems of all plants exhibiting foliar symptoms produced V.
dahliae upon culturing on PDA after 3 or 4 days of incubation. Almost all isolates
recovered from symptomatic plants corresponded to the defoliating pathotype of the
pathogen.
Disease progression
The first symptomatic plant was recorded in ‘Picual’-T1 just 20 weeks after
planting. In October 2012, 45 weeks after tree establishment, disease symptoms were
37
Chapter 2
observed affecting several plants of ‘Picual’ and ‘Arbequina’ (Table 1). The onset of
symptom development was first observed in the daily-irrigated (T1) microplots planted
with susceptible ‘Picual’ trees. The appearance of first symptoms was significantly earlier
in ‘Picual’ plants under this treatment (an average of 46 weeks) compared to ‘Picual’
plants under other treatments and ‘Arbequina’ and ‘Frantoio’ plants, where differences
were not detected (from 69 to 78 weeks) (Table 1).
During the fall of 2012, a serious epidemic developed in ‘Picual’ plants under-T1
treatment; DI values reached 80% in 4 weeks (from September 15 to November 15)
(Figure 1). By this time, the DI in other ‘Picual’ irrigation treatments (T2, T3, and T4)
did not reach values greater than 20% (Figure 1).
At the end of the assessment period, the DI in ‘Picual’ plants under T1 treatment
reached 100 %. For other treatments, DI for this cultivar remained below 67% (Table 1).
The 50% DI, (DI50) was reached earlier in trees under T1 treatment (41 weeks) than for
trees subjected to other irrigation treatments (average of 76 weeks) (Table 2). Similar
progression, in the parameters MS50 and M50 were observed for the ‘Picual’-T1
treatment (Table 2). The mean time from symptom onset to plant death was significantly
shorter in trees under the treatments T1 and T3 (44.1 and 47.0 weeks, respectively) than
for plants under T2 and T4 treatments (73.9 and 68.1 weeks, respectively) (Table 1). The
percentage of trees killed by the pathogen in T1 was 63% after 22 months.
The AUDPC ANOVA demonstrated that the interaction between the irrigation
treatment and the cultivar was significant (P < 0.05) between 15 December 2012 and 15
July 2013. For this period, each cultivar was studied separately.
‘Picual’ trees that were irrigated daily (T1) reached AUDPC values of 14.8% in
December 15; on average, ‘Picual’ trees under the remaining treatments reached AUDPC
values of 0.4%. Significant differences continued past this date, because AUDPC was
42.8% for T1 compared with an average of 11.5% for T2, T3, and T4. From October
2013 onward, the differences were not statistically significant (Table 2 and Figure 2).
Significant differences in disease progression in affected trees and in any of the
investigated phytopathological parameters in the ‘Arbequina’ trees subjected to different
irrigation treatments were not detected during the observation period. The onset of
symptom development occurred at 72.2 weeks after plantation. In this cultivar, disease
onset in the four irrigation treatments also began during the fall of 2012 and progressed at
a moderate rate that was similar between treatments (Table 1 and 3; Figures 1 and 2). The
pathogen caused disease symptoms in 60% of trees following the observation period.
These plants exhibited low mean severity values (an average of 1.2), and only 1.8% of
trees died (Table 1). The DI50 value recorded for ‘Arbequina’ plants was higher than that
registered for ‘Picual’ plants (Table 3). No significant differences were detected in the
AUDPC values during the observation period among the different irrigation treatments.
38
Irrigation Frequency in microplots
The epidemic was significantly delayed in ‘Frantoio’. The first symptomatic
plants were recorded 6 months later than had been observed in ‘Picual’ and ‘Arbequina’.
The final DI value in the T1 treatment was 26%; for other treatments, DI did not reach
values greater than 8% (Table 1 and Figures 1 and 2). In this resistant cultivar, a major
increase in the DI occurred during the spring of 2013. The maximum final values of
AUDPC were observed in the T1 trees, which reached 2.1%. Values of this parameter
were lower in the T2, T3 and T4 treatments, accounting for 0.2, 1.6 and 0.6 %,
respectively. The mean severity of the symptoms remained very low during the recording
period. Only 3.7% of plants were killed by the pathogen at the end of the experiment in
one of the treatments (T3) (Table 1).
The largest seasonal increase in DI during the experiment occurred in the fall
2012 (23 and 19 trees of the ‘Picual’ and ‘Arbequina’ cultivars, respectively, out of 108
trees planted for each cultivar) (Figure 3). Remarkably, 19 of these trees were from the
‘Picual’-T1 treatment (Figure 3). In the winter of the second year after planting (2013),
the number of newly affected plants was higher in ‘Arbequina’ (19 trees) than in the
‘Picual’ (10 trees), and the first ‘Frantoio’ plants (2 trees) began to show wilt symptoms.
During the second spring, the number of trees affected by VWO was greater in the
‘Picual’ (30 newly affected plants) than in ‘Arbequina’ (20 trees) and ‘Frantoio’ (5 trees).
When the final DI values were analyzed, only significant differences between cultivars (P
= 0.00) were found. These values accounted for 72.2, 58.3 and 11.1% for ‘Picual’,
‘Arbequina’ and ‘Frantoio’ cultivars, respectively.
Mean disease severity progress curves for ‘Picual’ and ‘Arbequina’ were well
described by the logistic model (pseudo-R2 > 0.98), with the exception of the ‘Picual’-T1
treatment. This treatment was described by a logistic model with a double sigmoid
pattern (pseudo-R2 > 0.98). No significant differences in MDPR were observed in
‘Picual’ and ‘Arbequina’ between irrigation frequencies; the average MDPR significantly
higher for ‘Picual’ plants (0.0254) (Table 2) than for ‘Arbequina’ plants (0.0070) (Table
3). The disease progression curves for ‘Frantoio’ cultivar could not be fitted to any model
(Figure 2).
Discussion.
The influence of irrigation frequency on the occurrence and development of
Verticillium wilts has been studied in several hosts of Verticillium spp., particularly
herbaceous plants (Bletsos et al. 1999; Cappaert et al. 1992, 1994; Jefferson and Gossen
2002; Pennypacker et al. 1991; Wheeler et al. 2012), Similar studies have been scarce in
woody crops affected by Verticillium wilts, likely due to the difficulties associated with
the experimental design and the length of the observation period necessary to obtain
results. Therefore, this research provides novel information about the impact of irrigation
schedules in the development of Verticillium wilt in an economically important woody
crop, the olive tree. For vascular diseases in which transpiration is one of the major
physiological function affected, an increase in irrigation dose or a shortening in irrigation
39
Chapter 2
frequency in the field may support disease development (López-Escudero and MercadoBlanco 2011). In our trial, the T1, T2 and T3 treatments were established to produce
maximum plant growth using different irrigation frequencies. However, the volumetric
soil water content in T4 prior to irrigation was below the allowable depletion. Therefore,
although it has not been measured, a reduction in transpiration could have occurred only
in T4 (Steduto et al. 2012). This would suggest that soil moisture in each treatment
played a larger role in disease, than leaf transpiration. In addition, increases in root
growth in wet soils could favor contact between susceptible olive roots with infective
pathogen structures (Fernandez et al. 1991; Huisman 1982; López-Escudero and BlancoLópez 2005; Xiao and Subbarao 2000). This factor needs to be further clarified, so that
factors such as the host variety or cultivar or other agronomical aspects may be involved.
The symptoms in the affected trees were similar to those previously described in
young olive trees planted in soils naturally infested with the pathogen (Blanco-López et
al. 1984; López-Escudero and Blanco-Lopez 2001, Lopez-Escudero and Mercado-Blanco
2011) including dieback, wilting and slow decline (the defoliation of green leaves and
flower death). These symptoms developed on ‘Picual’ trees under the daily-waterde
treatment (T1).
Three olive cultivars were chosen based on economic importance and the level of
resistance to the pathogen. Worldwide, 'Picual' is the most important variety
economically and is susceptible to VWO in both artificial inoculations and field
conditions. 'Arbequina' has increased international economic relevance due to adaptation
to intensive and hedgerow orchards; it has a similar level of susceptibility as ‘Picual’
following artificial inoculation but shows moderate susceptibility in field conditions.
‘Frantoio' is one of the more important Italian cultivars, and shows a high level of
resistance to VWO in both artificial and natural inoculation scenarios (Barranco et al.
2010; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Trapero et al. 2013).
The results obtained under the experimental conditions of this study suggest that
olive cultivars with diverse levels of resistance to VWO show differential reactions when
subjected to differing irrigation frequencies. One of the major conclusions of this work is
that a daily irrigation schedule strongly encourages the onset and development of VWO
in the susceptible ‘Picual’ olive (Tables 1 and 2, Figures 1 to 3). The final DI values
reached 100% and the AUDPC values remained significantly different from the
remainder of the treatments between fall 2012 (14.7%) and the summer 2013 (42.8%).
This effect was not observed in other irrigation frequencies in this cultivar, for which no
significant differences were recorded for AUDPC. Meanwhile, disease progress in
‘Arbequina’ was not influenced by the irrigation frequency, and the AUDPC did not
show significant differences between the four treatments over the observed time period
(Tables 1 and 3, Figures 1 to 3), reaching a maximum average value of 14.6%. Finally,
the low disease rates recorded for ‘Frantoio’ clearly suggest that the use of resistant
cultivars might have more impact on disease control than the application of certain
40
Irrigation Frequency in microplots
irrigation frequencies that may be unfavorable for disease development in susceptible
cultivars.
The period in which an increase in the number of affected trees occurred was
similar among all treatments in ‘Picual’ and ‘Arbequina’; this period started in the fall of
the second year after planting (October 2012) and peaked at the end of spring 2013
(Tables, Figure 1). Disease progression in ‘Picual’ plants under T1 followed a logistic
model with a double sigmoid pattern; other cultivar-irrigation treatment combinations
were fitted to a simple logistic curve (Figure 2).
VWO incidence in our conditions (southern Spain) increases during two important
periods (spring and fall) (López-Escudero and Blanco-López 2001; López-Escudero and
Blanco-López 2004; Rodríguez-Jurado et al. 1993). A logistic model of a multiple
sigmoid pattern has been successfully fitted the VWO epidemic by Navas-Cortes et al.
(2008). Most likely, the influence of daily irrigation has helped encourage disease
progression in the ‘Picual’-T1 treatment. For other treatments, a longer period of
observation than our experimental conditions would be necessary in order to observe the
onset and progression of disease.
Several hypotheses could explain the accentuated disease progression in ‘Picual’
plants under T1 treatment. One of the most reasonable explanations is that plant infection
occurred very soon after the establishment of the experiment. In our conditions, high and
low temperatures during summer and winter, respectively, usually impede the disease
progress; however, root infections could have occurred during the prior spring. In this
study, these periods were similar, with some divergence between treatments. In the
‘Picual’-T1 treatment, the MDPR after the first summer (2012) was greater than in other
treatments, despite not being statistically significant. Subsequently, the AUDPCP value
increased to 14.8%, compared to an average of 0.4% for the T2, T3 and T4 treatments
(Table 2). We conclude that daily irrigation created a more conducive soil environment
for the establishment of infection due to a reduction in soil temperature during the
summer. This would have also facilitated continuous infections from MS present in the
soil and a reduction in the incubation period during the summer months. Karaca et al.
(1971) reached similar conclusions; soil temperatures at depths of 5 and 15 cm in
Anatolian cotton fields in July fell 4-5 ºC, after irrigation, allowing infection to occur.
Temperatures registered during the winter of 2012-2013 were moderate, which also
promotes disease development in general. Another possibility to consider is that the daily
irrigation promoted more root development and more root tips, which would increase the
number of infection sites.
We assume that other factors are likely also implicated in disease development,
including complex interactions involved with cultivar resistance that must be elucidated
in new research.
41
Chapter 2
For this study, the observations were finalized in fall 2013. As of May 2013, the
maximum number of affected `Picual'-T1 plants had been reached (27 plants), of which
63% had died. In the remaining treatments, the appearance of newly diseased plants
stopped or slowed. A reduction in the DI after the third year was also observed in the
studies mentioned above that were conducted in microplots; this was ascribed to the
limitations of the microplot system (López-Escudero and Blanco-López 2007). Moreover,
the vegetative growth of many plants was excessive by this time and did not allow for
correct plant management.
The results from this study strongly encourage a reduction in irrigation frequency
when growing very susceptible cultivars in soils containing Verticillium dahliae.
Acknowledgments
This research was funded by a contract between the University of Córdoba and
The Spanish Interprofessional Olive Oil Association. (UG 400544). We especially wish
to thank the Oficina Comarcal Agraria “Las Marismas” (Lebrija, Sevilla) and the
Sociedad Cooperativa Andaluza “Agroquivir” (Trajano, Sevilla) for their essential
participation, for permitting the authors to collect the infested soil necessary for this study
from its property, and their technical assistance. We also thank Francisco Gonzalez for
his persevering technical assistance in the experimental plot.
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45
Chapter 2
Table 1. The effect of irrigation frequency on the final estimated disease values for three
cultivars of olive trees (‘Picual’, ‘Arbequina’ and ‘Frantoio’) in microplots, naturally
infested by Verticillium dahliae a.
FS (Weeks)
Cultivar
Picual
b
Range
Mean
Mortality c
(%)
T1 (Daily)
T2 (Weekly)
T3 (Biweekly)
T4 (Deficit)
20-77
41- 93
45-93
51-81
46 a
77 b
75 b
78 b
69
62.9 a
37.0 a
59.2 a
29.6 a
47.2
3.5 a
1.8 a
2.5 a
1.6 a
2.3 a
100 a
62.9 a
66.6 a
59.2 a
72.2 a
3.5 a
3.1 a
3.7 a
2.9 a
3.3 a
44.1 a
73.9 b
47.0 a
68.1 b
T1 (Daily)
T2 (Weekly)
T3 (Biweekly)
T4 (Deficit)
45-93
45- 77
45-72
41-77
76 b
74 b
69 b
70 b
72.2
3.7
3.7
1.8
1.0 a
0.9 a
1.5 a
1.3 a
1.2 b
59.3 a
55.5 a
59.3 a
59.3 a
58.3 a
1.4 a
1.5 a
2.5 a
1.9 a
1.8 b
89.0 c
88.9 c
T1 (Daily)
T2 (Weekly)
T3 (Biweekly)
T4 (Deficit)
57-93
74
55-93
65-81
75 b
74 b
74 b
73 b
74
3.7
0.9
0.3 a
0.1 a
0.2 a
0.1 a
0.2 c
25.9 a
3.7 a
7.4 a
7.4 a
11.1 b
0.6 a
0.3 a
1.4 a
0.7 a
0.7 c
17
-
Treatments
mean
MS
d
Incidence
(%)
MS Affected
e
plants
MM f
(Weeks)
Arbequina
mean
Frantoio
mean
a
Trees were surveyed every 2 weeks for symptom development over 22 months
(December 2011 to October 2013). The values listed in columns followed by the same
letter were not significantly different at P= 0.05
b
FS = The time from tree transplantation to the onset of disease symptoms. Differences
were estimated according to the log rank test.
c
Mortality (%) = Differences were estimated according to Fisher's protected LSD test.
d
MS = Mean severity. Differences were estimated according to Fisher's protected LSD
test.
e
MS affected plants = Mean severity of symptomatic plants. Differences were estimated
according to Fisher's protected LSD test.
f
MM = The time from symptom onset to plant death. Differences were estimated
according to the log rank test.
46
Irrigation Frequency in microplots
Table 2. The progression of the disease parameters for ‘Picual’ olive trees in microplots,
naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to different irrigation
frequencies a.
AUDPC
Treatments
b
c
M50
d
DI50
e
MDPR
f
15/12/2012
01/04/2013
15/07/2013
01/10/2013
MS 50
T1 (Daily)
14.8 a
26.7 a
42.8 a
48.4 a
57
74
41
0.047 a
T2 (Weekly)
0.3 b
1.3 b
9.7 b
13.9 a
--
--
77
0.017 a
T3 (Biweekly)
0.9 b
3.8 b
15.7 b
21.7 a
75
81
74
0.021 a
T4 (Deficit)
0.05 b
1.8 b
9.2 b
13.3 a
--
--
77
0.016 a
a
The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P =
0.05 according to Fisher's protected LSD test.
b
AUDPC = The standardized area under the disease progression curve calculated using
the trapezoidal integration of severity values expressed as a percentage of the maximum
theoretical curve.
c
MS50 = The time in weeks from planting until the severity of the affected plants was
equal to 2.
d
M50 = The time in weeks from planting until 50% of the plants had died.
e
DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected.
f
The parameter derived from the logistic regression of the severity over time: the
maximum disease progress rate (MDPR).
47
Chapter 2
Table 3. The progression of disease parameters in ‘Arbequina’ olive trees in microplots,
naturally infested with Verticillium dahliae subjected to different irrigation frequencies a.
AUDPC
b
15/12/2012
01/04/2013
15/07/2013
01/10/2013
DI50 c
T1 (Daily)
1.2 a
4.7 a
8.9 a
11.0 a
93
0.004 b
T2 (Weekly)
1.2 a
4.4 a
8.8 a
10.5 a
72
0.005 b
T3 (Biweekly)
1.8 a
8.7 a
16.7 a
19.7 a
63
0.010 b
T4 (Deficit)
1.9 a
7.8 a
14.8 a
17.4 a
67
0.009 b
Treatments
a
MDPR d
The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P =
0.05 according to Fisher's protected LSD test.
b
AUDPC = The standardized area under the disease progression curve calculated using
the trapezoidal integration of severity values expressed as the percentage of a maximum
theoretical curve.
c
DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected.
d
The parameter derived from the logistic regression of the severity over time: the
maximum disease progress rate (MDPR).
48
Irrigation Frequency in microplots
Fig. 1. Verticillium wilt disease incidence over time in the olive cultivars Picual
(susceptible), Arbequina (moderately susceptible) and Frantoio (resistant) in microplots,
naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation frequencies:
Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4).
49
Chapter 2
Fig. 2. Mean severity of symptoms of Verticillium wilt over time in the olive cultivars
Picual (susceptible) Arbequina (moderately susceptible) and Frantoio (resistant) in
microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation
frequencies: Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4). Disease severity
was estimated on a 0 to 4 rating scale that reflected the percentage of plant tissue affected
by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms; 1
= 1 to 33%, 2 = 34 to 66%, and 3 = 67 to 99% affected tissue; and 4 = dead plant). A
severity progression curve of the ‘Picual’-T1 treatment was described using a logistic
model with a double sigmoid pattern. Other curves were well described using the logistic
model. Curves of disease progression for the Frantoio cultivar could not be fitted to any
model.
50
Irrigation Frequency in microplots
Fig. 3. Number of symptomatic olive trees of the Picual (susceptible) Arbequina
(moderately susceptible) and Frantoio (resistant) cultivars affected by Verticillium wilt in
microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation
frequencies: Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4).
51
Chapter 2
SUPPLEMENTARY FIGURES
Figures chapter 2
Collecting naturally infested soil (A) (B). Preparation of infested soil (C). Microplot
filling (D).
Irrigation system (A), (B).
52
Irrigation Frequency in microplots
Measuring soil water in microplots (A). Grow of the plants with a deficit irrigation
frequency (T4) and with a weekly irrigation frequency (T2) (B).
Disease symptoms of affected plants.
53
Chapter 2
‘Picual’ plants with a daily irrigation frequency (T1) dead by V. dahliae (A). Pathogen
isolation from ‘Arbequina’ affected tissues (B).
54
Irrigation dose
55
56
Irrigation dose
EFFECT
OF
THE
IRRIGATION
VERTICILLIUM WILT OF OLIVE
DOSE
ON
Abstract
From autumn 2012 to autumn 2013 a survey comprising 70 olive orchards was carried
out in an Irrigation Community of the central Guadalquivir Valley, (Andalucía, Southern
Spain) with the objective of studying the influence of the irrigation dose on Verticillium
wilt (Verticillium dahliae Kleb.) of olive (VWO). The 93.1% of the visited orchards were
planted with susceptible cultivars to V. dahliae (‘Picual’ and ‘Hojiblanca’). Mean disease
incidence (DI) of the orchards accounted for 14.9%. In almost all investigated plantations
disease onset occurred after farmers had introduced irrigation. In the case that it was
present, the introduction of the irrigation always encouraged VWO development, and DI
was positively associated with the number of years of irrigation, showing a linear trend
(P=0.006). VWO was significantly more severe in olive plantations irrigated with high
irrigation doses. The 47.1% of olive plantations were irrigated with mean values of
2059.9 (in 2012) and 1793.4 (in 2013) m3/ha, and showed the highest DI (21.42%).
Plantations watered with lesser doses (the 28.6%) with average values of 712.5 (in 2012)
and 741.5 (in 2013) m3/ha showed a DI significantly lower, which accounted for 13.3%.
Finally, dry-land olive orchards (24.3%) showed the lowest DI (4.0%).
Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: marioagro25@hotmail.com.
This chapter has been published in:
Pérez-Rodríguez, M., Lorite I. J., Orgaz F., López-Escudero F. J., 2015. Effect of the
irrigation dose on Verticillium wilt of olive. Scientia Horticulturae 197: 564-567.
57
Chapter 3
Introduction
Verticillium wilt (Verticillium dahliae Kleb.) of olive (VWO) is nowadays the most
threatening disease in many of the olive producing countries (López-Escudero and
Mercado Blanco, 2011; Tsor, 2011). From the last decade, several epidemiological
aspects have been identified regarding the influence of irrigation on the development of
the disease in olive orchards. López-Escudero and Blanco-López (2005) demonstrated
that pathogen population in soil was higher in wet zones close to drippers used for
irrigation than in dryer zones. Indeed, surveys conducted by López-Escudero et al. (2010)
showed higher values of VWO incidence in infected irrigated orchards compared to dryland ones. García-Cabello et al. (2012) verified that microsclerotia, associated to soil
particles and/or infected plant debris were distributed by irrigation systems. These effects
may even be accentuated when using saline water (Levin et al., 2003). The most recent
studies (Pérez-Rodríguez et al., 2015) evidence that daily irrigation frequencies favour
VWO in susceptible cultivars when compared to more widely spaced in time irrigations.
These studies have had the objective of identifying how this practice could influence on
the development of VWO. However, information of the effect of different watering
dosages on the disease remains still unknown. Therefore, objective of this research was to
obtain and assess data from orchards in a representative zone of olive cultivation in
Andalucía, for determining a best practice guide of irrigation under risk conditions, that
allow ameliorate VWO control.
Materials and methods
Disease surveys
During autumn 2012 and 2013 a survey comprising 70 olive orchards (53 irrigated,
mainly by drip-irrigation, and 17 dry-land plantations) was carried out in an olive cultivated
zone affected by VWO that belongs to the Genil-Cabra Irrigation Community of Córdoba
province (southern Spain). In each orchard, companied by the farmer or a technician, a
survey consisting of two parts was completed. First one comprised general information
related to irrigation in the orchards (watering regime, number of years on irrigation, the
estimated-by-farmer watering doses in the orchard, watering periods etc.). In a second part,
information about the disease (first disease symptom onset, estimated mean disease
incidence (DI) and tree mortality in the plantation) was recorded. Finally, the DI in a
rectangular plot chosen at random in each olive orchard containing 100 trees was assessed.
From some of affected trees, plant material samples were taken for confirming V. dahliae
infections according to López-Escudero et al. (2010). Indeed, the Irrigation Community
provided us the real value of water consumption for irrigation during the years 2012 and
2013 for the orchard zone where the plot was chosen for recording the DI. After assessing
data, visited plots were classified in three groups depending on water consumption,
regarding normal mean values of consumption in this crop: High (2400–1800 m3/ha),
reduced (1400–500 m3/ha), and dry-land (just rainfall). Water consumption was correlated
with the recorded phytopathological parameters.
58
Irrigation dose
Data analysis
Analyses of variance and Pearson’s correlation coefficient of the studied disease
parameters (incidence and mortality as dependent variables) regarding irrigation recorded
values (watering consumption of 2012 and 2013 years; number of years of irrigation, etc)
were analyzed according to a completely randomized design using the Statistix 10.0
software program (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA). Mean values were
compared using the T-student test or the Fisher’s protected LSD test at P = 0.05 for two
or more than two treatments, respectively. In addition, trend was studied using
polynomial contrast. A principal component analysis (PCA) was carried out using Xlstat
v.7.5.2 excel add-in software (http://www.xlstat.com, Addinsoft) in order to represent the
relationship between DI and irrigation parameters and age of visited orchard.
Results and discussion
Present study provides novel information about the relationship between VWO
incidence and water consumption in olive plantations. The disease was widespread in the
70 visited orchards, with a mean DI of 14.9%, values lightly lesser than those reported by
López-Escudero et al. (2010), which accounted for 20.4% as a mean in affected trees in the
Guadalquivir Valley. In the 94.3% of cases V. dahliae could be recovered from affected
sampled tissues. The DI recorded inside the assessed plots was significantly higher in
irrigated (18.5%) than in dry-farming (4.0%) olive orchards (Table 1). Also the values of
DI estimated by farmer for the whole farm followed this pattern, accounting for 10.0 and
1.9%, respectively (Table 1). The estimated mortality values of the plantation did not
showed significant differences between irrigation regimes, reaching an average of 2.0%.
Previous reports (López-Escudero et al., 2010) also showed significant differences
of DI between irrigated (20.7%) and dry-land (18.3%) orchards in the Guadalquivir
Valley. Nevertheless, the DI in dry-land visited plots in present research was much lower
(4.0%). Probably differences are due to that, in the former cited surveys, owner would
have stopped of watering before the visit date as a consequence of the alarming disease
progress in the plots.
In this work we have also novelty demonstrated that water consumption has a
strong influence on VWO (Table 2). Thus, plots classified as highly irrigated, according
to water consumption in years 2012 and 2013, showed significantly higher values of DI
(21.4%) than those irrigated with reduced doses (13.3%). Indeed, dry-land visited plots
showed significantly lesser values of DI compared with irrigated ones (Table 2).
Interestingly, the 93.1% of visited olive orchards were planted with olive cultivars ‘Picual’
and/or ‘Hojiblanca’, in which WVO develops very fast (López-Escudero and MercadoBlanco, 2011), particularly when irrigated frequently (Pérez-Rodríguez et al., 2015).
Estimated values of DI and mortality that were provided by farmers did not show
significant differences (Table 2).
59
Chapter 3
Other interesting results of this work is that in 70% of olive farms, disease
symptoms onset coincided with the conversion of the orchard from dry-land into irrigation,
and the DI progress was influenced by the number of years of irrigation. Thereby, nonirrigated orchards and those irrigated for less than one year showed significant lower DI
(4.0%) than olive plantations irrigated for longer, that moved from 15.6% (from 2 to 4
year under irrigation) to 23.2% (more than 10 years of irrigation), following a linear trend
(P=0.006) (Table 3).
According to the Pearson test, DI recorded in plots was positively correlated with the
water consumption for years 2012 (r=0.35, P=0.002), 2013 (r=0.25, P=0.03) and
accumulated during both years (r=0.33, P=0.004). Nevertheless, the value of “r” is low,
probably due to the influence of other factors on disease development, such as inoculum
density of V. dahliae in soil, virulence of isolates, soil type, etc. As example, beside factors
related to irrigation, recorded information from surveys showed that DI decreased linearly
with the plant age (linear trend, P=0.003; data not shown). This finding corroborates results
of previous surveys (López-Escudero et al., 2010).
The Principal Component Analysis (PCA) showed that the first (PC1) and the
second (PC2) principal components accounted for 68.4% of the total variance. The PC1
variance was explained (49.8%) by years of irrigation, water consumption of 2012 and 2013
and the accumulated consumption of both years (Figure 1A). The PC2 variance was
explained (18.6%) by plant age and DI. This latter variable increased in the same direction
than the irrigation dosage and years of irrigation. Moreover, age variable showed nearly
opposite direction (Figure 1A).
The plots clearly clustered into three groups of watering consumption (Figure 1B).
Almost all highly irrigated plots were located in the higher DI zone. On the contrary, the
dry-land plots occupied the opposite zone (Figure 1B). Indeed, DI increased in plots that
have been irrigated for more than one year (Figure 1C). Finally, orchards with trees older
than 30 years were located below the horizontal axis, while young orchards (3-6 year old)
were distributed above this axis, despite both had high water consumption (Figure 1D).
In summary, data shows that the reduction in watering dosage could be an advisable
cultural practice for controlling VWO in affected olive orchards.
Acknowledgment
Research founded by a contract between the University of Córdoba and The Spanish
Interprofessional Olive Oil Association (UG 400544). We want to thank to Mª Asensión
Carmona Graciano and José Berlanga Mercado from the Comunidad de Regantes Genil
Cabra for organizing the meetings with farmers.
60
Irrigation dose
References
García-Cabello, S., Pérez-Rodríguez, M., Blanco-López, M.A., López-Escudero, F.J.,
2012. Distribution of Verticillium dahliae through watering systems in widely
irrigated olive growing areas in Andalucia (southern Spain). Eur. J. Plant Pathol. 133,
877-885.
Levin, A.G., Lavee, S., Tsror, L., 2003. Epidemiology and effects of verticillium wilt on
yield of olive trees (cvs. Barnea and Souri) irrigated with saline water in Israel.
Phytoparasitica 31, 333-343.
López-Escudero, F.J., Blanco-López, M.A., 2005. Effects of drip irrigation on population
of Verticillium dahliae in olive orchards. J. Phytopathol. 153, 238-239.
López-Escudero, F.J., Mercado-Blanco, J., Roca, J.M., Valverde-Corredor, A., BlancoLópez, M.A., 2010. Verticillium wilt of olive in the Guadalquivir valley (southern
Spain): Relations with some agronomical factors and spread of Verticillium dahliae.
Phytopathol. Mediterr. 49, 370-380.
López-Escudero, F.J., Mercado-Blanco, J., 2011. Verticillium wilt of olive: a case study
to implement an integrated strategy to control a soil-borne pathogen. Plant Soil 344, 150.
Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Amaro, M., Serrano, N., Lorite, I.J., Arquero, O.,
Orgaz, F., López-Escudero, F.J., 2015. The influence of irrigation frequency on the
onset and development of verticillium wilt of olive. Plant Dis. 99, 488-495.
Tsror, L., 2011. Epidemiology and control of Verticillium wilt on olive. Isr. J. Plant Sci.
59, 59-69.
61
Chapter 3
Table 1 Irrigation regime, disease incidence and mortality caused by Verticillium
dahliae, in olive orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain) a
Disease incidence (%)
In the
Estimated for Estimated
Factor
Sub-factor
surveyed the whole olive Mortality
plot b
orchard c
(%) d
Irrigation regime Irrigated
53
18.5 a
10 a
2.9 a
Dry-farming
17
4.0 b
1.9 b
1.0 a
a
The values in columns followed by the same letter were not significantly different
according to T-student test.
b
Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100
trees.
c,d
Incidence and Mortality according to farmers.
Field
(nº)
62
Irrigation dose
Table 2 Water consumption, disease incidence and mortality caused by Verticillium dahliae, in olive
orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain) a
Water consumption (m3/ha)
Disease incidence (%)
Groups
Number
Estimated for Estimated
of
of the
In the surveyed the whole olive Mortality
b
c
consumption
fields
2012 2013 Accumulated
plot d
orchard e
(%) f
High
33
2059.9 1793.4
3853.3
21.4 a
12.7 a
3.8 a
Reduced
20
712.5 741.5
1454.3
13.3 b
7.0 a
1.6 a
Dry-land
17
3.3
0
3.3
4.0 c
1.9 a
1.0 a
a
The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to
Fisher's protected LSD test.
b
The plots were classified in three groups depending on water consumption: High (2400–1800 m3/ha),
reduced (1400–500 m3/ha), and dry-land (just rainfall).
c
Accumulated consumption (m3/ha) of years 2012 and 2013.
d
Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100 trees.
e, f
Incidence and Mortality according to farmers.
63
Chapter 3
Table 3 Years of irrigation, disease incidence and mortality caused by
Verticillium dahliae, in olive orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain)
a
Disease incidence (%)
Years of
Number of
Estimated
In the
Estimated for
irrigation
the fields
surveyed the whole olive Mortality (%) d
plot b
orchard c
0-1
17
4.0 a
1.9 a
1.0 a
2-4
24
15.6 b
8.1 a
1.6 a
5-7
9
19.7 b
14.8 a
8.6 a
8-10
8
17.9 b
8.1 a
0.5 a
> 10
12
23.2 b
13.7 a
3.1 a
e
**
Trend
L
NS
NS
a
The values in columns followed by the same letter were not significantly
different at P = 0.05 according to Fisher's protected LSD test.
b
Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100
trees.
c,d
Incidence and Mortality according to farmers.
e
NS, **, Non-significant or significant at P ≤ 0.01, respectively; L: linear.
64
Irrigation dose
Figure 1 Principal Component Analysis of the data in which the associated vectors with
the original variables have been represented (A) and the data have been colored
according to: B) water consumption; C) Years of irrigation. Trees equal or higher 2
years were included in a single category due to the lack of significant differences
between them in the ANOVA analysis (Table 3); and D) Age.
65
Chapter 3
SUPPLEMENTARY FIGURES
Figures of chapter 3
66
Irrigation dose
67
Chapter 3
68
Irrigation dose
Survey carried out in the olive orchards
69
Chapter 3
Location of studied area
Symptomatic olive trees affected by Verticillium dahliae
70
Irrigation dose at field
conditions
71
72
Irrigation frequency at field conditions
THE EFFECT OF SHORT IRRIGATION FREQUENCIES ON THE
DEVELOPMENT OF VERTICILLIUM WILT IN THE SUSCEPTIBLE OLIVE
CULTIVAR ‘PICUAL’ AT FIELD CONDITIONS
Abstract
The effect of irrigation frequency (daily-T1, biweekly-T2, and dryland-T3) on
Verticillium wilt of olive was studied in two fields that were naturally infested by
Verticillium dahliae in southern Spain and planted to cultivar Picual. Disease onset
(average 61 weeks after planting) and disease incidence (average 75.6%) did not differ
among irrigation treatments in both fields. Irrigation consistently increased disease
development regarding dryland treatment, but this effect varied over time. In Experiment
I, T1 the area under the disease progress curve was greater on all recording dates (ranging
from 15.8%-33.7%) in comparison to T3 (average 6.6%). Data for Experiment II were
similar on the most favorable recording dates for disease (March-April). The T2
treatment effect varied over time depending on the season, rainfall and field, and was
difficult to differentiate from T1 and T3. Significant correlation between disease
incidence and severity increments during spring and fall with the soil water content of the
same and/or previous favorable seasons was observed. Through these correlations, we
detected soil water contents of 23.5-25.5% (Experiment I) and 23.5-23.6% (Experiment
II), where the increments of disease parameters remained at zero. Therefore, spacing
irrigation treatments, depending on rainfall, may be a feasible method for maintaining the
soil moisture below levels that favor for disease development.
Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: marioagro25@hotmail.com.
This chapter has been published in:
Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J. , and LópezEscudero F.J. 2015. The effect of short irrigation frequencies on the development of
Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions. Plant
Disease (Accepted, in press).
73
Chapter 4
Introduction
The Spanish Research Group AGR-216 from the University of Cordoba has
conducted experiments over the last four years to study the effect of irrigation on the
onset and development of Verticillium wilt of olive (VWO), which is caused by
Verticillium dahliae. Verticillium wilt is the most important disease of this tree crop in all
areas where it is cultivated, and particularly in Andalucía (southern Spain; Jiménez-Díaz
et al. 2012; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Tsror 2011). There are several
reports that excessive irrigation or soil moisture increased Verticillium wilt development
in herbaceous hosts such as potato (Cappaert et al. 1992), cauliflower (Xiao and Subbarao
2000), eggplant (Bletsos et al. 1999), and cotton (Wheeler et al. 2012). Limiting the
amount of water applied to the field may reduce severity of the disease in some plant
species, such as potato (Cappaert et al. 1992). Berlanger and Powelson (2000) reported
overwatering, particularly early in the growing season, resulted in increased infection
and, thus, increased disease severity. Data on the effect of excess water on woody hosts
of V. dahliae is scarce (Hiemstra and Harris 1998), but increased disease has been
reported in some hosts, namely cacao (Emechebe 1980), apricot (Vigouroux 1984) and
maple (Shufelt and Linderman 1986).
Preliminary studies on the effect of excess soil moisture on VWO were conducted
in semi-controlled conditions, i. e., in microplots filled with naturally infested soil, in
which plants were watered daily, weekly, biweekly or with deficit irrigation (PérezRodríguez et al. 2015). In the same experiment, the interaction of irrigation treatments
with olive cultivars with different levels of resistance to V. dahliae (‘Picual’, susceptible;
‘Arbequina’, moderately susceptible; and ‘Frantoio’, resistant) was also assessed. Daily
irrigation resulted in greater VWO development in Picual compared to the other
combinations of cultivar and irrigation frequency tested.
However, there is little information about regarding the effect of irrigation
frequencies on VWO disease progress in field conditions. This is difficult to study
because the progress of Verticillium wilt in olive is modified by environmental changes,
particularly by seasonal variations in rainfall and temperature over time but also by, e.g.,
differences in the inoculum density of the pathogen and its virulence, in the types of soil,
and in cultural management. Nevertheless, we conducted long-term experiments at two
locations in Spain to examine if short irrigation frequencies increase the risk of VWO in
fields in which Verticillium dahliae is present in the soil.
74
Irrigation frequency at field conditions
Materials and Methods
Field experimental plots
Experiment I.
Soil properties and Verticillium dahliae inoculum density. The experiment was
conducted in naturally infested soil in the municipality of Andújar (Jaen province, upper
Guadalquivir Valley; X: 409.007,90763; Y: 4.204.618,5853, according to system ED50 /
UTM zone 30N) in southern Spain from June 2013 to April 2015. The soil of the plot was
clay soil (pH in ClK= 7.47, organic matter = 1.27%, total CaCO 3 equivalent = 31.60%,
active CaCO3 = 14.24%, available K= 570 ppm, available P= 11.5 ppm, and organic N =
0.06%).
The hydraulic properties of the soil were assessed using a 12 l plastic pot filled
with the soil, which was watered to saturation and covered with a black plastic film to
avoid evaporation. The pot was allowed to drain freely, and thereafter, it was weighed
and dried in an oven at 70 ºC for 7 days. Then, the pot was again weighed to determine
the mass of water and the mass of solid soil. The upper limit soil water content (θUL) was
determined according to the gravimetric method using the following formula: θUL=
(Vw)/(Vs), where Vw = the mass of water and Vs = the total volume of soil. The θUL value
accounted for 0.32 m3 m-3.
To determine the available water in this soil, the lower limit of the soil water
content (θLL) was measured using barley seeds that were sown in a 12 l plastic pot filled
with soil. Irrigation was cut when the plants reached maximum vegetative growth, and
after plants had died, the soil water content was determined using the above formula. The
θLL value was 0.18 m3 m-3.
The plot had been cultivated with cotton for the five previous years, and it was
surrounded by olive orchards severely affected by VWO. The initial inoculum density
(ID) of V. dahliae of the plot soil was determined as described by Trapero et al. (2013).
Forty 100 g soil subsamples were homogeneously taken from the plot from a depth of 2530 cm using a cylindrical auger. Subsamples were mixed, bulked and crumbled.
Resulting soil sample was then air-dried under ambient conditions for three weeks. The
sample was then passed through a 0.8 mm sieve to remove organic debris and large
particles, mixed by hand and air-dried for an additional week. The V. dahliae ID was
estimated by the wet sieving technique (Huisman and Ashworth 1974). An amount of 25 g
of the sample was suspended in 100 ml of distilled water, shaken at 270 rpm for 1h and
filtered through 150 and 35 µm sieves. The residue retained on the 35 µm sieve was
recovered in 100 ml of distilled water. Finally, 1 ml of the suspension was plated onto
plates (20 replications) of a modified sodium polypectate agar medium plates (MSPA,
Butterfield and DeVay 1977). After 14 days of incubation at 22-24ºC in the dark, soil
residues were removed with tap water, and colonies of V. dahliae counted under a
stereoscope. The ID was estimated by the number of colonies of V. dahliae and expressed
75
Chapter 4
as propagules or microsclerotia per gram of air-dried soil. For this soil, ID reached 5.4
microsclerotia per gram of soil (MS/g). At the end of the experiment, the ID of the
pathogen in soil was assessed for all irrigation treatments and quantified using the method
described above.
The isolation and molecular characterization of the pathogen in the soil were
conducted using the methodology described by López-Escudero and Blanco-López
(2005b) and Mercado-Blanco et al. (2003). This analysis revealed that the 82.7% of the
soil isolates of the pathogen recovered from the soil were highly virulent strains
(defoliating pathotype).
Plant material. For planting, twenty-month-old rooted olive cuttings of the susceptible
olive cultivar Picual (López-Escudero et al. 2004; Trapero et al. 2013) were used. The
cuttings were collected from Verticillium dahliae-free mother olive plants from the World
Olive Germplasm Bank (Caballero and Del Río 2008) from IFAPA, Research Center
‘Alameda del Obispo’, Córdoba, Spain, and propagated according to Caballero and Del
Río (2010). At planting time, the plants were 1.3-1.5 m high with single trunk and three
or four secondary branches.
Orchard establishment, experimental design and irrigation treatments. The
experimental olive orchard was established in June 2013. The plot occupied 0.2 ha (28 x
67.5 m), with an average slope of 4%. The orchard consisted of 5 rows (distance between
rows = 7 m; between plants = 2.5 m). For soil management, reduced tillage and herbicide
applications were used.
A randomized block design with 5 blocks was used. There were twenty-seven plants
per block (row), three irrigation treatments per block, and nine plants per treatment. Three
irrigation frequencies were assessed: daily (T1), biweekly (T2), and dryland (T3). The
plants were drip-irrigated using a programmable irrigation controller (Image 6 Rain Bird,
Rain Bird Iberica S.A., Spain) connected to two 50-mm diameter and 40-m-long PVC
water pipes extended in a direction perpendicular to the tree rows. From these pipes, two
16 mm pipes started per row (one for each treatment, T1 and T2) with two and twelve
compensating drippers (NetafimTM, 8 l/h) per tree for T1 and T2 irrigation treatments,
respectively.
The soil water content in each treatment was recorded every fifteen days just
before irrigation using a Time Domain Reflectometry (TDR) system (6050X1 Trase
System I; Soil Moisture equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA). Subsequently, in
treatments T1 and T2, at every irrigation date (daily or every fifteen days, respectively),
the soil was irrigated until it reached the upper limit of water content.
76
Irrigation frequency at field conditions
Experiment II.
Inoculating the experimental site and collecting and characterizing a
naturally infested soil. Experiment II was conducted in a previously Verticillium
dahliae–free site located in the Campus of Rabanales of the University of Córdoba
(Córdoba province,
middle Guadalquivir
Valley; (X:349349.734175 m;
Y:4197887.92704 m, according to system ED50 / UTM zone 30N) in Southern Spain,
from December 2013 to May 2015. The selected site occupied 0.06 ha (19 x 30 m), had an
average slope of 1.8% and was previously tilled by a tractor to remove weeds. One hundred
tons of soil naturally infested by the pathogen was collected from a field located in the
municipality of Utrera (Sevilla, southern Spain) in a marsh area annually cropped with V.
dahliae hosts, primarily tomato, cotton and eggplant. The soil in this zone is heavily
infested with highly virulent strains of V. dahliae (cotton-defoliating pathotype) and the
VWO incidence and mortality develop quickly (Trapero et al. 2013). Indeed, soil from
this zone was successfully used in previous studies to determine the effect of irrigation
frequencies on VWO development in microplots (Pérez-Rodriguez et al. 2015). The ID of
the collected soil, assessed as described above, was 1.2 microsclerotia per gram of soil
(MS/g), and almost the 100% of soil isolates of the pathogen recovered from it were
characterized as highly virulent strains (defoliating pathotype). As in Experiment I, the
final value of ID was assessed for all irrigation treatments.
The soil was a clay soil (pH in ClK= 7.45, organic matter = 1.57%, total CaCO3
equivalent = 25.64%, active CaCO3 = 3.33%, available K = 475 ppm, and available P =
8.4 ppm, and organic N = 0.07%). The hydraulic properties of the soil were assessed as
described above. Thus θUL and θLL values of the soil in Experiment II accounted for 0.37
m3 m-3 and 0.17 m3 m-3, respectively.
Plot infestation, orchard establishment, experimental design and irrigation treatments.
In October 2011, the collected soil was transported by trucks to the Campus of Rabanales
and was homogenized by continuous crumbling and mixing using a tractor shovel at the
experiment site. In the plot, trenches (30 m long, 1 m wide, 70 cm deep) were dug and
subsequently filled with the infested soil (bulk density=1,300 Kg/m3). During the filling,
plastic sheets 2 mm thick were used for to line the trenches of soil and thus separate the
different irrigation treatments (see below) and to prevent water from passing from one to
another. The filled trenches were finally covered with a 10-cm layer of the original soil of
the plot to prevent infested soil dispersal.
‘Picual’ plants that were of the same age as those in Experiment I and propagated
with the same procedure were used for planting. The olive plantation was established in
December 2013. The orchard consisted of 4 rows (distance between rows = 5 m, between
plants = 2 m). The plot occupied 0.06 ha (20 x 30 m), with an average slope of 1.8%. For
soil management, reduced tillage and herbicide applications were used. As in Experiment I,
T1, T2, and T3 treatments were studied, and the plants were arranged according to a
randomized block design with 4 blocks. There were fifteen plants per block (row), three
77
Chapter 4
irrigation treatments per block, and five plants per treatment. The irrigation system was
installed and controlled as described for Experiment I. The soil water content in each
treatment was recorded as in Experiment I, and the irrigation program was decided
according to the same criteria.
Assessment of disease progression Experiments I and II were inspected every two
weeks for 23 and 18 months after planting, respectively, for disease symptoms. Disease
severity was estimated based on a 0 to 4 rating scale according to the percentage of plant
tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 =
no symptoms; 1 = 1-33%; 2 = 34-66%; 3 = 67-99%; 4 = dead plant). These values were
used to construct the progress curves for disease incidence (DI) and mean disease severity
of the affected plants over time during the recording period. For both experiments, the
curves of mean severity over time were adjusted to the logistic model (Pérez-Rodríguez
et al. 2015).
Moreover, the time that elapsed from the plantation establishment to the point
where 50% of trees were diseased (DI50) was also calculated for each treatment.
At the end of the experiment, the area under the disease progress curve (AUDPC)
was estimated as the percentage of the maximum possible value in the considered period
according to the following formula based on Campbell and Madden (1990): AUDPC =
[(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, where t = the interval in days between
observations, Si = the final mean severity, 4 = the maximum disease rating, and n = the
number of observations. The final percentage of dead plants, or mortality (M), was also
considered in estimating the severity of the reactions. The time that elapsed from the
transplanting to the onset of disease symptoms (FS) was determined for all irrigation
treatments.
Plant infection was confirmed by isolating the fungus from the affected shoots or
leaf petioles of diseased plants via microbiological methods, as described by LópezEscudero and Blanco-López (2001). Briefly, affected twigs showing disease symptoms
mentioned above were collected from wilted plants (three 20cm long twigs per tree).
When leaf petioles were used, ten defoliated leaves per tree were collected just after
affected shoots in the tree were shaken. For pathogen isolation, pieces of collected twigs
were washed in running tap water, bark was removed and woody tissues surface
disinfesting in 0.5% sodium hypoclorite for 1 min. Chips of wood were placed onto
potato dextrose agar (PDA) or acidified PDA. Plates were incubated at 24ºC in the dark
for 5-6 days. Leaf petioles cut from defoliated leaves were processed in a similar way.
Almost all affected samples were also analyzed using PCR methods according to the
methodology of Mercado-Blanco et al. 2003, with the aim to determine the pathotype of
the isolates recovered from trees.
78
Irrigation frequency at field conditions
Relationship between increase in disease parameters (incidence and severity) and
soil water content in Experiments I and II. Soil water content data and disease
parameters (incidence and severity) were grouped by seasons: spring (1 April to 1 June),
summer (15 June to 15 September), autumn (1 October to 15 December) and winter (1
January to 15 March). The effect of increase in disease parameters per day of each
irrigation treatment was calculated as ((last day of season)-(first day of the next season–
1)). The soil water content in each of three treatments was computed as average values of
all days of the season.
A non-linear asymptotic regression model was used to evaluate the relationship
between soil water content in percentage and increase in diseased parameters (incidence
and severity).
This equation has three parameters: a is the horizontal asymptote on the right-hand
side when 0 < c < 1, a-b is the response when x=0 and c is the growth rate of the curve.
The minimum soil water content (MSWC; the soil water content in percentage for
which disease incidence and severity were zero) of these curves was calculated.
Rainfall data. Rainfall data were collected from the two nearest official weather stations
of The Junta de Andalucía to the experimental sites (Anonymous 2015). Then, the agroclimatic stations located in Finca La Paz (La Higuera de Arjona, Jaen province; UTM
coordinates X: 411463.0 m and Y: 4200610.0 m; altitude = 267.0 m; latitude:
37º56'55''N; longitude: 04º00'27''W) and Finca Alameda del Obispo (Córdoba, Córdoba
province; UTM coordinates X: 341399.0 m and Y: 4191480.0 m; altitude 117.0 m;
latitude: 37º51'25''N; and longitude: 04º48'10''W), were used for the field trials at Andújar
(Experiment I) and the University of Córdoba (Experiment II), respectively.
Data analysis. For each trial, individual analyses of variance (ANOVA) of the evaluated
parameters were performed using Statistix 10.0 program (Analytical Software). The data
were analyzed in a randomized completed block design with studied diseased parameters
as the dependent variable. The mean values of analyzed parameters were compared using
Fisher’s protected least significant difference test at P=0.05. The FS parameter was
analyzed using Kaplan-Meier survival analysis (Kaplan and Meier 1958), in which the
survival times were calculated as the week showed diseased symptoms for the first time.
Comparisons were tested using the log-rank test at P=0.05.
The relationship between the increase in incidence, severity and the soil water
content of the three treatments during each season was studied using the Pearson
correlation, and then by a non-linear asymptotic regression model described above. The
Akaike’s information criterion and pseudo-R2 parameter were used to evaluate the
appropriateness of the logistic model and the asymptotic regression model to describe
data. The effect of water content during seasons on the increase of incidence or severity
during a given season was also studied by multiple linear regression analysis. We
79
Chapter 4
evaluate the appropriateness of multiple linear regression according to the significance of
the estimated individual parameters and general significance of model (P ≤ 0.05),
Mallow’s Cp statistic, Akaike’s information criterion, the coefficient of determination
(R2), R2 adjusted for degrees of freedom (Ra2), and the pattern of residuals over predicted
and independent variables. The collinearity among parameters was chequed according to
Variance Inflaction Factor (VIF)
Results
Inoculum density of Verticillium dahliae in the soil. Soil analyses showed that the
pathogen remained viable in the soil in both trials throughout the investigation period.
The V. dahliae population detected in soil reached 5.4 ± 1.06 MS/grams and 1.2 ± 0.4
MS/grams in Experiment I and II, respectively. No significant differences (P>0.05) were
detected in the initial and final amounts of infective propagules between different
irrigation treatments.
Disease symptoms and pathogen isolation from affected tissues. Typical symptoms of
the disease (López-Escudero and Blanco-López 2001; Trapero et al. 2013), i.e., wilting,
dieback, and/or defoliation, were usually observed in the affected plants. Wilting
primarily started at the lower branches and developed as a generalized green leaf
defoliation that affected the entire tree canopy. However, partial defoliations of green
leaves affecting the higher branches were observed occasionally. Desiccation of flowers
occurred during spring and early summer. Occasionally, primarily in early spring,
affected plants exhibited wilt, chlorosis and rolling of leaves without the defoliation of
green leaves. These plants became completely wilted, and necrotic leaves remained
attached to shoots. Affected plants were consistently colonized by the pathogen and a
collection of 57 V. dahliae isolates was obtained from both fields, of which 89% of
recovered isolates corresponded to the defoliating pathotype, that was present in similar
percentages in wilted trees from Experiment I (19 out of 23 isolates were classified as
defoliating pathotypes) and Experiment II (32 out of 34 isolates).
Disease progression. Verticillium wilt symptoms were first observed at 48 and 42 weeks
in Experiments I and II, respectively (Table 1). Time to the onset of the disease
symptoms from orchard establishment did not differ between irrigation treatments, and
was very similar in the two experiments. (62.2 and 60.7 weeks for Experiments I and II,
respectively).
In Experiment I, the disease incidence increased faster in trees under T1 irrigation
treatment compared to those in T2 and T3 irrigation treatments (Figure 1). For example,
in mid-May 2014, DI was 33% in the T1 treatment and 17% and 2% in the T2 and T3
treatments, respectively. Throughout June 2014, there was little increase in the number of
new diseased trees, however, starting in July, DI increased gradually and by October, DI
was 89%, 64% and 54% for T1, T2 and T3, respectively (Figure 1). No significant
differences between treatments were found (P=0.143) in the final DI values, which were
80
Irrigation frequency at field conditions
91.3%, 76.6% and 63.6% for T1, T2 and T3 treatments, respectively (Table 1 and Figure
1).
In Experiment II, the progress of the DI was similar for the T1 and T2 treatments.
The first plants were symptomatic in early October of 2014, and thereafter, the
percentage of affected plants progressively increased until the end of the observations in
spring of 2015, reaching final values of 83.7 and 78.7% of plants in the T1 and T2
treatments, respectively. DI increments were primarily recorded from September to
December 2014 and in spring 2015. Although the final values of DI registered for T3
were not significantly different (P=0.355) from those of T1 and T2 (Table 1), the disease
was considerably delayed in T3, and plants did not exhibit disease symptoms until April
2015 (Figure 1). Nevertheless, despite this delay in disease onset, 60% of the plants under
the T3 treatment developed some of the symptoms described above during spring 2015
(Figure 1).
After 23 months of observations in Experiment I, the percentage of trees killed by
the pathogen in irrigated treatment T1 was not significantly higher than that of T2 (28.4%
and 17.3%, respectively). However, plant mortality was significantly higher (P=0.04)
than that of the T3 irrigation (6.4%; Table 1). In Experiment II, 18 months after planting,
there were not differences in percentages of the dead plants among the three treatments,
varying from 15% (T3 treatment) to 27.5% (T2 treatment; Table 1).
The time that elapsed from the plantation establishment to the point where 50% of
trees were diseased (DI50) for T1 treatment was 58 and 55 weeks in Experiment I and II,
respectively (Table 2). For the other two treatements, the DI50 was greater than 61
weeks.
Significant differences regarding the AUDPC among treatments varied depending
on the recording period. In Experiment I, the AUDPC calculated for trees irrigated under
T1 irrigated treatment in June 2014 was significantly higher (15.8%) than for trees that
received T2 and T3 treatments (7.9% and 2.1%, respectively; Table 2). In August, the
AUDPC of the trees that received T3 treatment was significantly lower (4.8%) than those
that received irrigated treatment. From October 2014 until the end of the observations, the
AUDPC for plants that received T1 treatment remained significantly higher than that for
trees that received T3 treatment, whereas for treatment T2, this parameter remained in
intermediate and not significantly different between T1 and T3 at the end of experiment
(Table 2). In Experiment II significant differences in AUDPC values between irrigation
and the T3 treatment were observed in March and April 2015 (Table 2).
The mean disease severity progress curves for the three irrigation treatments in
Experiment I were well described by a logistic model (pseudo-R2=0.98; Figure 2). In
Experiment II, the T1 treatment was described by a logistic model with a double sigmoid
pattern (pseudo-R2=0.99), and the disease progression curves for the T2 and T3
treatments could not be fitted to a logistic model (Figure 2).
81
Chapter 4
Rainfall at experimental plots. The accumulated precipitation at the study fields was
740.2 mm (from 1 June 2013 to 1 May 2015) and 927.6 mm (from 1 December 2014 to
15 May 2015) for Experiments I and II, respectively. Periods in which higher rainfall was
recorded were winter 2013-2014 (289.4 and 309.8 mm for Experiments I and II,
respectively) and fall 2014 (190.8 and 326.0 mm for Experiments I and II, respectively).
1 June 2013 and summer 2013 were particularly dry, and almost no rainfall was
registered in Experiment I. The driest season in Experiment II was fall 2013.
Relationship between the increase in disease parameters (incidence and severity)
and soil water content. In Experiment I, the largest increase in DI occurred in summer
2014 in which an average of twenty newly diseased trees was recorded in all treatments
(Figure 3). The largest symptom severity increments were observed in spring 2014 in
trees that received the T1 irrigation treatment (Figure 3).
The increment of DI observed in spring 2014 was significantly correlated with the
soil water content recorded during this season (r=0.70; P=0.0033) and during the previous
fall (year 2013; r=0.57; P=0.0252 Table 3 and Figure 3). Disease symptom increments
showed high correlation with values of this parameter for the two seasons (r=0.65;
P=0.0079 and r=0.8; P=0.0003 for spring 2014 and fall 2013, respectively). Indeed, in
fall 2013, the soil water content in the three irrigation treatments was well differentiated
and was 30%, 26% and 23% in the T1, T2 and T3 blocks, respectively (Figure 3). In
spring 2014, these average soil water content values in T1 and T2 were more similar
(T1= 30.5% and T2=28.6%), while the soil water content of the T3 treatment remained
near 24% (Figure 3). By contrast, the increase in symptom severity in fall 2014 was
correlated (r=0.54; P=0.037) only with the soil water content of spring 2014 (Table 3).
In spring 2015, five and three new trees developed wilt symptoms in the T2
irrigation and T3 treatments, respectively. The average value of the soil water content of
the three irrigation treatments was approximately 30% at this time (Figure 3). In this
experiment I, the total water consumption after 23 months, in the T1 and the T2
treatments, was 68.9 and 54.7 m3, respectively.
In Experiment II, disease onset occurred in fall 2014, when 8 and 6 diseased trees
were recorded in the T1 and T2 treatments blocks, respectively (Figure 3). The increase
in disease incidence and severity recorded during fall 2014 was significantly correlated
with the soil water content measured in fall 2014 (r=0.67; P=0.0161 and r=0.71; P=0.009,
respectively) and the previous spring (r=0.69; P=0.0116 and r=0.64; P=0.025,
respectively; Table 3). However, the increase in disease incidence (R2=0.61; P=0.0142)
and severity (R2=0.59; P=0.0168) during fall 2014 was better explained by multiple linear
regression considering soil moisture in spring and fall 2014.
Soil water content in Experiment II between the irrigation treatments in spring and
fall 2014 differed similar to that observed in the Experiment I (Figure 3). Soil water
82
Irrigation frequency at field conditions
content was 23%, 27% and 29% in the T3, T2 and T1 blocks respectively, just before
irrigation in the spring and 23%, 25% and 28%, respectively, in the fall.
In spring 2015, an increase in the number of diseased trees (6, 5 and 12 new trees in
T1, T2 and T3, respectively) was again recorded, and disease severity showed the
greatest increments (Figure 3). In this season, the water content of the soil was
approximately 30% in the three treatments. In Experiment II, the total water
consumption, in the T1 and T2 treatments after 18 months was 9.1 and 4.6 m3,
respectively (Figure 3).
The correlations between the soil water content and the increase of disease
parameters (incidence and severity) were well described by a non-linear asymptomatic
regression model in both fields (pseudo-R2 between 0.35 and 0.71) and the asymptote
trended toward 30%. According to the equation previously mentioned (see Material and
Methods section), MSWC accounted for average values of 24.3% and 23.6% for
Experiments I and II, respectively.
Discussion
Among the agronomic factors that may influence VWO, the use of irrigation has
always been identified as a key factor and has been mentioned in the best agricultural
practices for this tree crop (Hiemstra 2015). However, the only data reported regarding
the effect of irrigation on VWO was a study recently conducted by Pérez-Rodríguez et al.
(2015) in semi-controlled conditions using microplots with naturally infested soil.
The present research contributes new findings for clarifying the effect of irrigation
on the onset and development of VWO, and confirms that the disease is promoted by
short irrigation frequencies in large field trials in the susceptible cultivar Picual.
Moreover, it provides novel data on the relationship between disease development and
the soil water content as a result of different irrigation schedules, and consequently these
data have important implications for the practical management of irrigation in
commercial olive orchards.
Under field conditions, we observed several differences in the results when
comparing with those of the mentioned research conducted in microplots which will be
discussed in this section (significant differences in disease development between
irrigation treatments, decrease of trees killed by the pathogen, decrease of mean severity,
time from tree plantation to the onset of disease symptoms was higher than microplot
study, etc...). These differences are likely due, among other things, to the effect of the
reduced soil volume of the containers (1 m2 by 70 cm deep) used in the microplot study,
the limitation of the tree growth within the container due to the high tree density (9 plants
per microplot), the changes in edaphic and water relationships (primarly involving
evapotranspiration and soil water content), and that rainwater in the microplot study
83
Chapter 4
would not have affected the study since -the microplot rows were covered (PérezRodríguez et al. 2015).
The pathogen population in the soils of both experimental fields was similar and
did not vary over the observation period. This finding indicates that the periodic
variations in soil moisture caused by the different irrigation schedules of treatments did
not increase (in the case of irrigated blocks) or reduce (in the case of dryland blocks) the
pathogen population. This contradicts what some authors have reported. For example,
inoculum density in wet areas around the drippers in Verticillium-infested olive orchards
was higher than in the dry areas (López‐Escudero and Blanco‐López 2005a). Moreover,
Green (1980) reported changes in the soil profile variations in the number of
microsclerotia recovered from naturally infected potato stems. It is possible that our study
was not long enough to detect changes in V. daliae inoculum density.
The onset of the disease symptoms did not differ between irrigation treatments in
the two experiments (62.2 and 60.7 weeks for Experiment I and II, respectively) Table 1.
Conversely, Pérez-Rodríguez et al. (2015) reported an effect of irrigation treatment on
VWO disease onset. They observed disease symptoms in daily irrigated plants of ‘Picual’
that grew in microplots with naturally infested soil at 46 weeks after planting, which was
30 weeks before symptoms were observed on the trees of the biweekly and irrigation
deficit treatments and approximately 15 weeks before disease was observed in the present
study. It is possible that a more conducive soil environment for infections caused by V.
dahliae microsclerotia occurred in the microplots compared to the natural conditions in
field trials. Some authors have argued that the increase in root growth promoted by high
soil moisture could facilitate contact between roots and the infective propagules of the
pathogen (Emechebe 1980; Fernández et al. 1991; Huisman 1982; López-Escudero and
Blanco-López 2005a; Saadatmand et al. 2006; Xiao and Subbarao 2000). Moreover, the
lower soil temperature that occurs during summer in daily irrigated blocks, would also
facilitate infection and reduce the incubation period. Karaca et al. (1971) reported in
cotton this effect may be accentuated in microplots´ conditions by the limited volume of
soil (Pérez-Rodríguez et al. 2015) but was not as marked in the experimental fields of the
current research where this fact was not observed.
The mean disease severity progress in Experiment I fitted to a logistic model
(Figure 2), likely because symptom development was slower during summer 2014 in the
three treatments. In Experiment II, only the daily irrigation treatment could be adjusted to
a double sigmoid logistic model. This result agrees with the results obtained in previous
studies (Pérez-Rodríguez et al. 2015), where the disease progression in 'Picual' plants
subjected to a daily irrigation program followed the double sigmoid logistic model.
Disease was consistently worse in the frequent irrigation treatments, T1 and T2,
compared to reduced irrigation frequency (T3) in both field trials. Significant differences
in the AUDPC values between irrigation treatments varied with the assessment time
(Table 2). Thus, in Experiment I, T1 had significantly greater AUDPC values at all
84
Irrigation frequency at field conditions
assessment dates compared to the T3 treatment. The values for T1 ranged from 15.8%,
one year after planting (June 2014) to 33.7% at the final assessment (May 2015), whereas
in the T3, accounted for an average value of 6.6% throughout the period. Moreover, in
Experiment II, these values also significantly differed between T1 and T3 at recording
dates during the most favorable months for disease development (March and April) in
spring 2015.
Under these field conditions, the effect of the T2 irrigated treatment was not
different from either the T1 or T3 treatments over the course of the study. Thus, the T2
irrigation program scheduling favored disease development significantly more than T3
during August and October 2014 (Experiment I) and March and April 2015 (Experiment
II), but was only different from T1 in spring (June 2014) of Experiment I
The interactions between the studied parameters and the experimental variables
under natural conditions (e.g., soil and the microbiological characteristics of the soil and
environment) of the two study fields are sufficiently complex and further research is
needed to explain their effect on VWO development. The final values of DI were similar
in both experiments and did not differ between irrigation treatments. Thus these data
suggest that the sum of the long-term effect of non-controlled parameters that influence
disease development, such as temperature, inoculum density, the virulence of isolates,
and other harmful agronomic practices, was similar in the two experimental trials.
Based on our previous work on VWO in microplots, we suggest that disease
development was directly influenced not by the frequency of irrigation schedule, but by
the water content in the soil profile. Thus we hypothesize that VWO could be managed
by adjusting water content in soil could to lower values that do not affect the physiology
(particularly the growth) of the plants but do reduce the incidence and/or severity of
symptoms. Indeed, we determined in our research during favorable periods for disease
development exist values of soil water content for which increments of DI and severity
remained at zero, Table 3.
In the present study, we included T1 and T2 irrigation treatments because we
wanted to compare two irrigation frequencies for which the soil water content was
calculated to try to produce maximum plant growth. Moreover, the T3 treatment, in
which the tree growth could be more affected depending on the rainfall, would be a good
control regarding the influence on disease of keeping water low in the soil profile. The
weekly irrigation treatment was not studied, as was done by Pérez-Rodriguez et al.
(2015), because we thought that, at field conditions, its effect on disease development
would be very difficult to differentiate from effect of the T1 irrigation. Furthermore, its
omission allowed us to simplify the irrigation program.
With this aim, correlations between the soil water content recorded in the soil
profile and DI and severity were investigated. In the two fields, and during the
observation period, a significant correlation between the DI and severity increments
85
Chapter 4
during spring and fall with the soil water content of the same and/or previous favorable
seasons was observed (Table 3, Figure 3). All these relationships were well adjusted to an
asymptotic model in which the asymptote trended toward a moisture content of 30%. The
value was close to the water content in the upper limit of Experiment I (37%) and
Experiment II (32%). Additionally, in Experiment II, it was observed that if the soil water
content values in the spring and fall of 2014 were studied jointly, a higher correlation was
obtained with the increasing incidence and severity of symptoms in the fall of 2014.
These results demonstrate that the soil water content in our favorable seasons (spring and
fall) influences VWO development.
The reduction of the available water in soil, with the aim to reduce the impact of
VWO, probably had an influence in the plant vegetative development, although, in our
experiments we did not measured tree growth. Nevertheless, according to Steduto et al.
(2012) and Villalobos et al. (2002), in young olive trees similar to the ones used in
present study, the threshold values of soil water content that would not reduce tree growth
would be 25% and 27% in Experiments I and II, respectively. Indeed, the values of
incidence and symptom severity remained at zero when values of moisture content were
reduced to 24.3% and 23.6% in Experiments I and II, respectively. Therefore, we think
that most likely tree growth was also subsequently reduced.
Total recorded rainfall in this treatment was 740.2 mm and 927.6 mm in
Experiment I and II, respectively. The winter 2013-2014 (289.4 mm and 309.8 mm for
Exp I and II, respectively) and fall 2014 were particularly wet (326.0 mm for Experiment
II; Figure 3). However the winter of 2014-2015 was considerably drier than the previous
year in both fields (53 and 67.8 mm in Experiments I and II, respectively), although the
soil moisture content at the beginning of spring 2015 was close to the highest recorded
water content in T3 treatments, particularly in Experiment II (Figure 3).
Thus in this treatment, there were long periods without rainfall that may have had
a negative influence on tree growth, which consequently reduced crop yield. This
reduction in yield needs to be considered by farmers in cases of disease risk, although it is
a fairly common practice for farmers to stop irrigation when the disease is increased
alarmingly to prevent high mortality (López-Escudero et al. 2010). This was observed in
Experiment I, in which the percentage of dead plants at the end of the observations was
significantly higher in the T1 irrigation treatment (28.4%) than in the T3 treatment
(6.4%).
The data from this study suggests that, under the climatic conditions of the
Guadalquivir Valley, careful scheduling of irrigation during periods of low rainfall in the
spring and/or fall may be considered to manage VWO management since keeping the soil
water content below 24 % may delay or slow disease development. For example, farmers
could consider a biweekly irrigation frequency rather than daily irrigation, or even not
irrigating the affected orchard for a period of time. However, the effect of reduced
irrigation scheduling on yield needs to be determined.
86
Irrigation frequency at field conditions
Acknowledgments
This research was partially funded by Projects AGL2007–65766 (Spanish
Ministerio de Ciencia e Innovación, co-financed by FEDER of the EU) and by a contract
between the University of Córdoba and The Spanish Interprofessional Olive Oil
Association (UG 400544). We thank the Oficina Comarcal Agraria “Sierra
Morena/Campiña Jaén” (Andújar, Jaén), the Comunidad de Regantes “Ntra. Sra. de los
Dolores” (Arjona, Jaén), and Rafael Jiménez del Río for technical assistance at plot of
Experiment I. We are also grateful to the Oficina Comarcal Agraria “Las Marismas”
(Lebrija, Sevilla) and the Sociedad Cooperativa Andaluza “Agroquivir” (Trajano, Sevilla)
for permitting us to collect from their property the infested soil necessary for Experiment
II. We also thank Francisco Gonzalez for his constant valuable support at both
experimental plots and Juan Moral Moral who holds a Talent Hub fellowship launched by
the Andalusian Knowledge Agency and cofounded by the European Union’s 7th FP.
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89
Chapter 4
Table 1. The effect of irrigation frequency on the final estimated disease values in two
experimental olive orchards of the susceptible cultivar ‘Picual’ established on naturally
infested soils by Verticillium dahliae u.
FS (Weeks) w
Experiment and
treatments
Range
Mean
Mortality
(%)
48-83
48-99
57.1 a
64.0 a
28.4 a
17.3 ab
48-99
65.4 a
62.2
42-70
42-70
66-70
55.8 a
58.5 a
67.8 a
60.7
x
Incidence
(%)
MS Affected
z
plants
1.8 a
1.4 ab
91.3 a
76.6 a
2.1 a
1.7 a
6.4 b
17.3
0.8 b
1.3
63.6 a
77.2
1.4 a
1.7
20.0 a
27.5 a
15.0 a
20.8
1.2 a
2.0 a
1.3 a
1.5
83.7 a
78.7 a
60.0 a
74.1
1.5 a
2.5 a
1.9 a
1.9
MS
y
Experiment I
T1 (Daily)
T2 (Biweekly)
T3 (Dryland)
Mean
Experiment II
T1 (Daily)
T2 (Biweekly)
T3 (Dryland)
Mean
u
Trees were surveyed every 2 weeks for symptom development over 23 months (June
2013 to April 2015) in Experiment I and 18 months (December 2013 to May 2015) in
Experiment II. The values listed in columns followed by the same letter were not
significantly different at P= 0.05.
w
FS = The time from orchard establishment to the onset of disease symptoms.
Differences were estimated according to the log rank test.
x
Mortality (%) = Differences were estimated according to Fisher's protected (LSD) test.
y
MS = Mean severity. Differences were estimated according to Fisher's protected (LSD)
test.
z
MS affected plants = Mean severity of symptomatic plants. Differences were estimated
according to Fisher's protected (LSD) test.
90
Irrigation frequency at field conditions
Table 2. Progression of the disease parameters in two experimental olive orchards of the
susceptible cultivar ‘Picual’ established on naturally infested soils by Verticillium dahliae
and subjected to different irrigation frequencies u.
AUDPC (%)w from the beginning of the experiment to the
date
Experiments and
treatments
Experiment I
T1 (Daily)
T2 (Biweekly)
T3 (Dryland)
Experiment II
T1 (Daily)
T2 (Biweekly)
T3 (Dryland)
1 Jun 2014
15 Aug 2014
1 Oct 2014
1 May 2015
DI50(weeks)x
15.8 a
7.9 b
2.1 b
22.0 a
12.8 a
4.8 b
24.5 a
15.6 a
6.9 b
33.7 a
22.9 ab
12.8 b
58
62
68
1 Dec 2014
15 Mar 2015
15 Apr 2015
15 May 2015
4.5 a
2.1 a
0.0 a
8.9 a
4.7 a
0.0 b
9.8 a
6.2 a
0.2 b
12.3 a
10.5 a
3.1 a
55
66
70
u
Values in columns followed by the same letter were not significantly different at P =
0.05 according to Fisher's protected (LSD) test.
w
AUDPC = Standardized area under the disease progression curve calculated using the
trapezoidal integration of severity values expressed as a percentage of the maximum
theoretical curve.
x
DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected
91
Chapter 4
Table 3. Relationship between the volumetric water content in soil and Verticillium wilt
disease incidence and severity in two experimental olive orchards of the susceptible
cultivar ‘Picual’ established on naturally infested soils by Verticillium dahliae and
subjected to different irrigation frequencies
Experiment and
period of recording
the volumetric water
contenta
Pearson
correlationc
Disease
parameterb
Period of
correlation
Experiment I
Fall 2013
Spring 2014
Fall 2013
Spring 2014
Spring 2014
Experiment II
DI
DI
MS
MS
MS
Spring 2014
Spring 2014
Spring 2014
Spring 2014
Fall 2014
Spring 2014
Fall 2014
Spring 2014
Fall 2014
a
Asymptotic
Regressiond
r
P
Pseudo R2
MSWCe (%)
0.57
0.0252
0.35
23.6
0.70
0.0033
0.56
24.5
0.80
0.0003
0.64
23.5
0.65
0.0079
0.56
24.3
0.54
0.0370
0.29
25.5
DI
DI
MS
Fall 2014 0.69
Fall 2014 0.67
Fall 2014 0.64
0.0116
0.70
23.6
0.0161
0.0250
0.54
0.71
23.5
23.6
MS
Fall 2014 0.71
0.0090
0.56
23.6
Spring period runs from the 1 April to 1 June; Fall period runs from 1 October to 15
December.
b
DI = Disease incidence; MS = Mean severity
c
Pearson correlation coefficient were calculated by volumetric water content and
incidence or severity values.
d
The relations were adjusted to a non-linear asymptotic regression model (Y= a-b*cx).
e
Parameter obtained from the asymptotic regression between volumetric soil water
content and parameter studied; Minimum soil water content in percentage (MSWC) for
which disease incidence and severity were 0.
92
Irrigation frequency at field conditions
Fig. 1. Verticillium wilt disease incidence over time in the olive cultivar Picual in two
experimental olive orchards, Experiment I and II, established on naturally infested soils
by Verticillium dahliae and subjected to three irrigation frequencies: daily (T1), biweekly
(T2) and dryland (T3).
93
Chapter 4
Fig. 2. Mean severity of symptoms of Verticillium wilt over time in the olive cultivar
Picual in the two experimental olive orchards, Experiment I and II, established on soil
naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to three irrigation frequencies:
daily (T1), biweekly (T2) and dryland (T3). Disease severity was estimated on a 0 to 4
rating scale that reflected the percentage of plant tissue affected by any of the following
symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms 1 = 1 to 33%, 2 = 34 to
66%, 3 = 67 to 99% affected tissue, and 4 = dead plant).
94
Irrigation frequency at field conditions
Fig. 3. Number of symptomatic olive trees, disease severity increase, soil water content
and registered rainfall in two experimental olive orchards of the cultivar Picual,
Experiment I and II, established on soils naturally infested by Verticillium dahliae and
subjected to three irrigation frequencies: daily (T1), biweekly (T2) and dryland (T3).
Disease severity was estimated on a 0 to 4 rating scale that reflected the percentage of
plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation
(0 = no symptoms, 1 = 1 to 33%, 2 = 34 to 66%, 3 = 67 to 99% affected tissue, and 4 =
dead plant). The soil water content was recorded every fifteen days just before watering,
with a time domain reflectometry. Subsequently, in T1 and T2, at every irrigation date
(daily or every fifteen days, respectively), the soil was irrigated until it reach the upper
limit of soil water content.
95
Chapter 4
SUPPLEMENTARY FIGURES
Figures of chapter 4
Croquis of Experimet I
96
Irrigation frequency at field conditions
Field work. Measure of volumetric soil water content (A). Collecting natural infested soil
(B).
Experiment I: Symptoms of affected olive trees (A),(B) and (C). Row of trees with different
irrigation treatments (T1) Daily Irrigated, (T3) Dryland (D).
97
Chapter 4
Croquis of Experiment II
Experiment II: Conditioning the experimental plot (A). Collecting naturally infested soil
in a marches zone. (B). Moving the soil to University of Córdoba. (C). Soil mixing and
homogenization (D).
98
Irrigation frequency at field conditions
Experiment II: Trenches opening (A). Trenches filling (B). Tree plantation (C).
Treatments separated by buried plastic sheets (D).
‘Picual’ trees affected by V. dahliae. Olive tree daily irrigated (A). Trees biwikly
irrigated (B).
99
100
Discusión General
101
102
Discusión General
La Verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo de suelo Verticillium
dahliae Kelb, es actualmente la enfermedad más grave del olivo en la Cuenca
Mediterránea y probablemente en la mayoría de las zonas olivareras del mundo
(Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011). En
Andalucía, la presencia de VO en los campos de cultivo ha sido atribuida
principalmente al uso de plantones infestados, a la aplicación de prácticas agronómicas
inadecuadas y a la gran capacidad de dispersión y resistencia que tienen las estructuras
infectivas y de supervivencia (microesclerocios) de este patógeno (Jiménez-Díaz et al.,
2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011).
Durante las últimas décadas en Andalucía se ha observado, además, que la
expansión de VO en las zonas olivareras ha sido paralela a la reconversión de olivares
de secano a regadío en plantaciones en las que antes la enfermedad no era un problema
grave (López-Escudero et al., 2010; Rodríguez et al., 2008, 2011). Por otra parte,
numerosas observaciones parecen apuntar a que el aumento de las dosis y frecuencia del
riego producen incrementos de la incidencia de las plantas afectadas y de la gravedad de
las infecciones, provocando además una aparición más temprana de la enfermedad
(Blanco-López et al., 1984; López-Escudero y Blanco-López, 2005). Estos hechos están
generando al agricultor grandes dudas sobre el adecuado manejo del riego en las
plantaciones.
En este sentido, el grupo de Patología Agroforestal del Departamento de
Agronomía de la Universidad de Córdoba inició hace varios años una línea de
investigación para intentar dar una respuesta científica a la influencia del riego sobre la
VO. Esta línea ha sido financiada por la Interprofesional del Aceite de Oliva Español
(proyecto de investigación UG 400544). La presente tesis constituye una continuación
de los trabajos realizados por López-Escudero y Blanco-López (2005) y García-Cabello
et al. (2012) sobre la VO en relación al agua de riego. Además, esta tesis ha querido
abordar la influencia de las variables epidemiológicas estudiadas en relación al riego
sobre la resistencia varietal de esta enfermedad.
Desde hace tiempo se ha comprobado que el riego es una práctica agronómica
que aumenta considerablemente la producción del olivar. Este hecho ha llevado al
agricultor a realizar aportaciones de agua muchas veces excesivas, tanto en dosis como
en frecuencias de riego (Orgaz y Fereres, 2008). Por tanto, el aspecto que ha suscitado
el interés entre los investigadores ha sido constatar científicamente si dosis y
frecuencias elevadas de riego influyen favorablemente en el desarrollo de la
enfermedad.
La influencia del riego en el inicio y desarrollo de las Verticilosis ha sido estudiada
particularmente en cultivos herbáceos (Arbogast, 1999; Bletsos et al., 1999; Cappaert et
al., 1992; 1994; Harrington y Dobinson, 2000; Huisman y Grimes, 1989; Jefferson y
Gossen, 2002; Pennypacker et al., 1991; Wheeler, 2012; Talboys y Wilson, 1970; Xiao
et al., 1998; Xiao y Subbarao, 2000). En cultivos leñosos, este tipo de estudios han sido
103
Discusión General
escasos (Hiemstra y Harris, 1998), seguramente debido a la complejidad de su diseño y
a la necesidad de largos periodos de evaluación.
En la investigación realizada por Pérez-Rodríguez et al. (2015a) (Capítulo 2) en
condiciones semicontroladas (microparcelas) se estudió la influencia de cuatro
frecuencias de riego (Diaria, Semanal, Quincenal y Deficitaria) en el inicio y desarrollo
de la enfermedad sobre tres cultivares de olivo con diferente nivel de resistencia a VO.
‘Picual’ susceptible, ‘Arbequina’, moderadamente susceptible y ‘Frantoio’, resistente
(López-Escudero y Mercado-Blanco 2011; Trapero et al. 2013). En este trabajo, la
epidemia comenzó en el mismo periodo en todos los tratamientos de riego en los
cultivares Picual y Arbequina. El primer incremento notable en el número de plantas
afectadas se produjo en otoño del segundo año después de la plantación y finalizó a
finales de la siguiente primavera. Durante este periodo se pudo comprobar que la
progresión de la enfermedad en las plantas de ‘Picual’ sometidas a un tratamiento de
riego diario seguía un modelo logístico de doble sigmoide (pseudo-R2 > 0.98). Sin
embargo las combinaciones restantes, ‘Picual’ y ‘Arbequina’ con los diferentes
tratamientos de riego, se ajustaron mejor a un modelo logístico simple (pseudo-R2 >
0.98) (Figura 2; Capítulo 2).
El progreso de la enfermedad en nuestras condiciones (sur de España) es
particularmente importante durante las estaciones de primavera y otoño (LópezEscudero y Blanco López, 2001; López-Escudero et al., 2004; Rodríguez-Jurado, 1993).
Seguramente, el tratamiento de riego diario promovió el establecimiento y desarrollo de
infecciones y/o síntomas de la VO en el cultivar susceptible Picual durante estos
períodos. Esta interacción (‘Picual’- riego diario) provocó que al final del periodo de
evaluación se alcanzara una incidencia del 100% y un 63% de plantas muertas (Figura 1
y Tabla 1; Capítulo 2). Debido probablemente al rápido progreso de la enfermedad en
‘Picual’- riego diario, la evolución de la epidemia se ajustó muy bien a un modelo
logístico doble sigmoide, el cual ya fue utilizado con éxito por Navas-Cortés et al.
(2008). Para las otras combinaciones cultivar-tratamiento creemos que sería necesario
más tiempo de observación para su ajuste a un modelo de estas características (Figura 2;
Capítulo 2), que en cualquier caso podría no ser posible por las limitaciones de espacio
de los contenedores infestados.
A partir de las curvas logísticas estudiadas se obtuvo el ratio de máximo desarrollo
del progreso de la enfermedad (MDPR) (las pendientes de las rectas tangentes del punto
de inflexión de cada curva). Este parámetro, que corroboró la mayor susceptibilidad del
‘Picual’ respecto ‘Arbequina’, ha sido utilizado por otros autores para describir el
desarrollo de otras enfermedades de olivo (Moral y Trapero, 2009). Los valores del
Área Bajo la Curva Progreso de la Enfermedad (ABCPE) reflejaron un mayor avance de
la enfermedad en la interacción ‘Picual’- riego diario. Los otros parámetros estudiados
sirvieron para caracterizar de forma detallada el progreso de la enfermedad en los
diferentes tratamientos (Tabla 1, 2 y 3; Capítulo 2).
104
Discusión General
Por otra parte, los resultados obtenidos de este estudio demuestran que cultivares
con diferente nivel de resistencia a la VO muestran distintas reacciones, cuando se
hayan sujetos a diferentes frecuencias de riego. Una programación de riego con una
frecuencia diaria agravó el desarrollo de las infecciones de la VO en el cultivar
susceptible Picual. En ‘Arbequina’, sin embargo, el desarrollo de síntomas no se vio
influenciado por las diferentes frecuencias de riego estudiadas.
Finalmente, los bajos niveles de enfermedad observados en ‘Frantoio’ sugieren
claramente que, en el marco de un control integrado de la enfermedad, el uso de
cultivares resistentes podría tener mucha mayor relevancia que el efecto negativo que
provoca la aplicación de ciertas frecuencias de riego favorables para la enfermedad
cuando se emplean cultivares susceptibles.
Estos resultados coinciden con las observaciones de Jefferson y Gossen (2002) y
Wheeler et al. (2012) que concluyeron en sus investigaciones en alfalfa y algodón,
respectivamente, que la severidad de la Verticilosis era mayor en las variedades
susceptibles sometidas a una alta frecuencia de riego que en las variedades resistentes
sometidas a esa misma frecuencia. También se cuenta en olivo con los recientes
resultados de Ostos et al. (2015) basados en estudios sobre ortofotos realizadas en un
período de diez años sobre dos plantaciones vecinas de olivar sobre suelos infestados
con V. dahliae en el término de Mengibar (provincia de Jaén). El uso de ‘Frantoio’,
incluso introduciendo el riego tras dos años de la plantación, no ocasionó epidemias
importantes durante el periodo estudiado en relación a la alta tasa de incidencia y
mortalidad que se detectó anualmente durante los diez años de estudio en la plantación
vecina, plantada con ‘Picual’ que se mantuvo además en secano.
En consecuencia, creemos que los resultados obtenidos en este trabajo (PérezRodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2) permiten recomendar frecuencias de riego más
espaciadas en el tiempo que la diaria cuando se usan cultivares susceptibles de olivo en
suelos infestados por V. dahliae.
El estudio del efecto de la dosis de riego en el desarrollo de VO también ha sido
otro de los objetivos de esta línea de investigación. En el trabajo realizado por PérezRodríguez et al., (2015b) (Capítulo 3) se evaluaron los datos de 70 fincas de olivar de
una zona afectada por VO representativa del Valle del Guadalquivir, en el término de
Santaella, en la provincia de Córdoba. Todas las fincas fueron visitadas junto al técnico
o el propietario, con el fin de obtener la máxima y fiable información posible de cada
parcela.
En este trabajo se demostró que la VO se encuentra ampliamente distribuida en los
campos prospectados y que el porcentaje de incidencia de la enfermedad (IE) en las
fincas de regadío era significativamente más alto que en las fincas de secano (Tabla 1,
Capítulo 3). En investigaciones previas este hecho ya había sido observado (LópezEscudero et al., 2010), aunque las conclusiones se obtuvieron de los datos de riego
105
Discusión General
estimados por los agricultores. Sin embargo, este trabajo aporta mayor exactitud ya que
gracias a la colaboración de la Comunidad de Regantes Genil-Cabra, pudimos conocer
el consumo real de cada finca que se dispensó en cada una de las parcelas visitadas,
concluyendo que éste tiene una influencia notable sobre la VO (Tabla 2; Capítulo 3). De
hecho, las plantaciones con alto consumo (2400-1800 m3/ha) mostraron valores
significativamente más altos de IE (21.4%) que aquellas regadas con una dosis reducida
(1400-500 m3/ha), en las que se contabilizó una IE media de 13.3%. Por su parte,
corroborando nuestras hipótesis de partida, en las plantaciones de secano prospectadas
se observó un valor medio de IE del 4%, significativamente menor que el de las
plantaciones de riego. Es importante remarcar que el 93% de las fincas prospectadas
estaban plantadas con ‘Picual’ o ‘Hojiblanca’, cultivares que en campo han mostrado
elevada susceptibilidad a la enfermedad en particular cuando se riegan frecuentemente
(López-Escudero y Blanco-López, 2001; Pérez-Rodríguez et al., 2015a; Capítulo 2;
Trapero et al., 2013; 2005). Además se pudo observar que el progreso de IE estaba
significativamente relacionado, siguiendo una tendencia lineal (P=0.006), con los años
que llevaban las explotaciones en regadío (Tabla 3; Capítulo 3).
Con los datos obtenidos a través de las encuestas empleadas en las prospecciones
de la zona descrita es muy razonable proponer que la reducción del riego podría ser una
práctica cultural aconsejable para controlar VO en los olivares afectados por la
enfermedad.
En esta tesis doctoral también se ha explorado la influencia de la frecuencia de
riego y su consecuente efecto en el contenido de humedad del suelo y en el desarrollo de
la enfermedad en condiciones de campo. Estas investigaciones se han realizado solo con
el cultivar Picual (susceptible y el más importante económicamente), ya que el estudio
de la interacción riego-resistencia suponía en campo una elevada complejidad
experimental, de espacio y coste. Además, atendiendo a los resultados obtenidos en la
investigación previa (Pérez-Rodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2) parecía la opción más
lógica.
Se ha estudiado en esta parte de las investigaciones la influencia de tres
tratamientos de riego (Diario, Quincenal y Secano) en el desarrollo de VO en dos
campos naturalmente infestados localizados en el sur de España. Los resultados en estas
condiciones difirieron respecto a los obtenidos en la primera investigación en
condiciones semicontroladas (Pérez-Rodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2), ya que en los
dos experimentos de campo la evolución de la enfermedad, en su época más favorable,
muchas veces fue similar en los dos tratamientos de riego. Sin embargo, en esas mismas
épocas, el desarrollo de la enfermedad fue siempre significativamente más pronunciado
en los árboles con tratamientos de riego respecto a los de secano (Pérez-Rodríguez et
al., 2015c, Tabla 2 del Capítulo 4). Las diferencias existentes entre los ensayos de
campo (Capítulo 4) y el ensayo en microparcelas (Capítulo 3) seguramente estuvieron
debidas a que el ensayo en condiciones semicontroladas se hallaba protegido de la
lluvia.
106
Discusión General
Por lo que hemos revisado en bibliografía y observado en campo, la influencia de
un aumento de humedad, ocasionada por el riego, en el inicio y desarrollo de la
enfermedad podría deberse a que un mayor contenido de agua de forma constante
aumentara el crecimiento de las raíces de los árboles. Nosotros coincidimos con varios
autores en que esto seguramente incrementó la probabilidad de contacto entre las raíces
y las estructuras de supervivencia del patógeno (microesclerocios). (Emechebe, 1980;
Fernández et al., 1991; Huisman, 1982; López-Escudero y Blanco-López, 2005;
Saadatmand et al., 2006; Xiao y Subbarao, 2000).
Los valores de contenido de humedad medidos con el ‘TDR’ cada quince días
durante los periodos de observación en los experimentos permitieron estudiar la
correlación existente entre el contenido de agua en el suelo y el incremento de los
parámetros de enfermedad (incidencia y severidad). De esta forma se ha demostrado
que en los dos ensayos de campo existió una correlación significativa entre los
incrementos de los parámetros de enfermedad durante la primavera y el otoño y el
contenido de agua en el suelo en la misma y/o anterior estación favorable para la
enfermedad (Tabla 3, Capítulo 4). Esta correlación en uno de los campos, mejoró
cuando se estudió de una manera conjunta el contenido de agua en el suelo de las dos
estaciones favorables (misma época y anterior época).
Como conclusión, estos resultados demuestran que el contenido de agua en el suelo
en las estaciones favorables (primavera y otoño) de las zonas en las que se han
establecido los experimentos de campo de este trabajo influye favorablemente al
desarrollo de VO.
Asimismo, en nuestros ensayos de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capítulo
4) no apreciamos que los riegos aplicados durante los meses de verano influyeran
favorablemente sobre la VO. Sin embargo, se desprende del experimento realizado en
microparcelas (Pérez-Rodríguez et al., 2015a; Capítulo 2) que, presumiblemente, debido
al contenido limitado de volumen de suelo, los riegos de verano podrían a ver influido
en el desarrollo de la enfermedad reduciendo la temperatura del suelo, favoreciendo así
a que el hongo causara las primeras infecciones y se redujera el periodo de incubación
(Figura 1 y 2 y Tabla 1; Capítulo 2). Este argumento también ha sido considerado por
otros autores como Karaka et al. (1971) tras evaluar los resultados de sus ensayos de
riego en algodón cultivado en campos infestados por V. dahliae.
En los 2 experimentos de campo realizados (Pérez-Rodríguez et al., 2015c;
Capitulo 4) también se observó que determinados contenidos de agua en el suelo no
provocaban durante épocas consideradas como favorables, que la enfermedad
progresara, permaneciendo los incrementos de incidencia y severidad de síntomas
cercanos a cero. Este porcentaje de agua medido en el perfil del suelo varió en los
Experimentos I y II entre 23.6% y 25.5% y 23.5% 23.6%, respectivamente.
107
Discusión General
Este aspecto resulta interesante ya que según varios autores parece existir un valor
umbral de contenido de agua en el suelo por debajo del cual el olivar reduce su
crecimiento (Studeto et al., 2012; Villalobos et al., 2002). En el caso de los árboles
utilizados en nuestro experimento, que eran jóvenes, este valor umbral resultó elevado
(25 y 27% en los Experimentos I y II, respectivamente). Esto conlleva a pensar que no
regar o espaciar los riegos en plantaciones con riesgo de verticilosis, aunque podría
reducir el impacto de la enfermedad, podría ocasionar a su vez que el crecimiento de los
árboles se viese afectado (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capítulo 4). Sin embargo, el
uso de esta estrategia de riego en un olivar adulto, gracias a un sistema radicular mejor
desarrollado y a una evapotranspiración relativamente baja, podría afectar en menor
medida su crecimiento y consecuentemente a su producción.
Finalmente cabe mencionar que las periódicas variaciones del contenido de
humedad provocadas por las programaciones de riego en los experimentos de campo y
microparcelas no causaron ningún aumento o disminución del nivel de inóculo. Estos
resultados coinciden con los obtenidos por Xiao et al. (1998) en coliflor. No obstante
López-Escudero y Blanco-López (2005) observaron en diferentes olivares que el
incremento de humedad provocado por el riego por goteo ocasionaba un aumento en la
de la densidad de inóculo del patógeno respecto a las zonas que se hallaban fuera de los
efectos del bulbo húmedo y que estas diferencias se incrementaban además con el
tiempo. En nuestras investigaciones, el hecho de que el nivel de inóculo no variara
significativamente entre los diferentes tratamientos de los experimentos realizados
posiblemente se debió a que las observaciones no se prolongaron lo suficiente en el
tiempo para detectar este tipo de alteraciones en la población del hongo en el suelo.
La presente tesis doctoral supone un avance importante en el estudio de la
influencia del riego sobre la enfermedad más grave del olivar en estos momentos. Los
resultados obtenidos pueden ayudar al agricultor a establecer una estrategia de riego
adecuada en aquellos campos afectados por VO o en aquellas zonas donde en un futuro
la enfermedad pueda estar presente.
108
CONCLUSIONS
109
110
Conclusions

After growing during two years in infested microplots by Verticillium dahliae,
olive cultivars with diverse levels of resistance to Verticillium wilt of olive
exhibit differential reactions when subjected to different irrigation frequencies.
Daily irrigation schedule strongly encouraged the onset and development of the
disease in the susceptible cultivar Picual when compared to the rest of
treatments (weekly, biweekly and deficit). ‘Arbequina’ was not influenced by
the irrigation frequency, showing final values of incidence close to the 60%, but
moderate symptom severity. Finally, in the resistant cultivar Frantoio only very
low disease rates were recorded in any of treatments (Chapter 2).

In the context of an integrated control of the disease, these results have
demonstrated that the extension of irrigation frequency in susceptible cultivars
growing in infested soils by the pathogen may reduce disease incidence.
Moreover, these suggest that the use of resistant cultivars seems to be more
relevant than the detrimental effects observed in frequent irrigation schedules
(Chapter 2).

Surveys conducted during 2012 and 2013 in a representative olive growing area
in the Guadalquivir Valley under disease risk conditions have novelty shown
that the water consumption has a strong influence on Verticillum wilt of olive.
The 47.1% of olive plantations classified as high irrigated (mean water
consumption of 1900 m3/ha), showed the highest value of disease incidence
(21.42%). Plantations watered with lesser doses (the 28.6%) (mean water
consumption of 725 m3/ha) showed a disease incidence significantly lower,
accounting for 13.3%. Finally, dry-land olive orchards (24.3%) showed the
lowest Verticillium wilt incidence (4.0%). Therefore, these data shows that the
reduction in watering dosage could be an advisable cultural practice for controlling
the disease in affected olive orchards (Chapter 3).

In 70% of olive visited farms, disease symptoms onset coincided with the
conversion of the orchards from dry-land into irrigation, and disease incidence was
influenced by the number of years of irrigation, following a linear trend (Chapter
3).

As in semi-controlled conditions (infested microplots) (Chapter 2), disease
progression in ‘Picual’ trees daily irrigated was clearly exacerbated at field
conditions. One of the more plausible reasons is that increments of the root
growth in wet soils could favor the contact between susceptible olive roots with
infective pathogen structures. In addition, in field conditions, the effect of
biweekly irrigation treatment was more difficult to differentiate of daily
irrigation and dryland treatment, probably due to rain (Chapter 4).
111
Conclusions
112

Disease development, as recorded at field experiments, was directly influenced
by the water content in the soil profile in our favorable seasons (spring and fall).
Therefore, we have identified during these favorable periods for wilt progress an
average value of volumetric soil water content for which disease incidence and
severity remained at zero. In our experiments this average value was 24.3% in
Experiment I and 23.5% in Experiment II (Chapter 4).

Under the climatic conditions of the Guadalquivir Valley, spacing out irrigation
across time in years in which low rainfall is registered in spring and/or fall may
be a feasible method for keeping the volumetric soil water content below
detrimental values for disease development. This could be achieved using a
biweekly irrigation frequency instead daily irrigation, or even leaving the
affected orchard on dryland for a certain period of time. (Chapter 4).
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137
138
Estancia en el extranjero
139
140
Estancia en el extranjero
ESTANCIA EN EL CENTRO “WAGENINGEN UR/APPLIED PLANT RESEARCH SECTOR FLOWER
BULBS, NURSERY STOCK & FRUITS” EN HOLANDA.
Objetivos de la estancia
Como actividad complementaria a la Tesis doctoral se realizó una estancia de 3
meses en Lisse, en el centro “Applied plant research, Sector flower bulb, nursery stock
and fruits” (Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, PPO), el cual pertenece a la
Universidad de Wageningen.
Los objetivos de esta estancia fueron conocer la distribución de Verticillium
dahliae a lo largo de los haces vasculares en dos cultivares de olivo, ‘Picual’
(Susceptible) y ‘Frantoio’ (Resistente) y en dos especies forestales, arce (Acer sp.)
(Susceptible) y fresno (Fraxinus sp.) (Resistente).
Experimento I: Inoculación de variedades de olivo
Material y métodos
Material vegetal.
En este experimento se utilizaron plantones de olivo de 9 meses de edad
procedentes de un vivero comercial de Castro del Río (Córdoba). Los cultivares
utilizados fueron ‘Picual’, susceptible a la enfermedad y ‘Frantoio’, resistente (LópezEscudero y Mercado Blanco, 2011). Mediante una compañía de transportes, las plantas
fueron enviadas por carretera al centro de investigación en Lisse (Holanda).
Inoculación
Se inocularon 120 plantas (1.107 conidias/ml) con dos aislados V117 (defoliante)
y V4 (no defoliante) transformados mediante Agrobacterium tumefasciens, con el gen
GFP, cuya función era emitir luminiscencia con radiación ultravioleta. La inoculación
de los plantones fue mediante el método descrito por López-Escudero et al. (2004).
Dicha transformación y inoculación fue realizada por el Doctorando Mojtaba Keyha
Saber, 2 semanas antes de que se iniciará la estancia.
Este experimento se realizó durante dos meses y medio (Agosto-Octubre; 2014)
en un invernadero a una temperatura de 22±5 ºC y a una iluminación de 216 μmol·m-2·s1
de luz fluorescente durante 14h/día. La humedad relativa dentro del invernadero osciló
entre 50 al 70%.
Diseño experimental.
En este experimento se utilizó un diseño completamente alzar, con 20 plantones
de olivo por cultivar y aislado inoculado, más 20 plantones de cada cultivar como
testigo.
141
Anejo 1
Evaluación del progreso de la enfermedad.
Semanalmente se tomaron datos de severidad de síntomas mediante una escala
de 0 a 4 (0 = planta sana; 4 = planta muerta). Con los datos de severidad de la
enfermedad se calculó el área bajo la curva progreso de la enfermedad en términos
porcentuales (ABCPE) = [(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, donde t = es el
intervalo en días entre observaciones, Si = Valor final de severidad, 4 = valor máximo
de enfermedad, y n = número de observaciones. El porcentaje final de plantas muertas o
Mortalidad (M) y el tiempo transcurrido entre el trasplante y el inicio de los primeros
síntomas también fueron considerados.
Visualización del patógeno
Cada semana se recogío una planta de cada combinación cultivar-aislado
inoculado y una planta testigo de cada cultivar. Una vez en el laboratorio se realizaron
cortes histológicos de la parte radical, de la parte media del tallo y de la parte alta de
cada planta, para su posterior visualización en el microscopio confocal.
Análisis de los datos
Para este experimento se utilizó un análisis de Varianza (ANOVA) para analizar
los datos. Las medias de los valores analizados fueron comparadas mediante el test
protegido de Fisher LSD (P=0.05). En este estudio, los parámetros de enfermedad
fueron utilizados como variable dependiente. Los datos fueron analizados por el
programa estadístico Statistix 10.0 (Analytical Software, Tallahassee, FL).
Resultados Preliminares
Síntomas de la enfermedad.
Durante el experimento las plantas afectadas mostraron los dos síndromes
característicos de la enfermedad, apoplejía y decaimiento lento. (López-Escudero y
Mercado-Blanco, 2011). Durante el periodo de evaluación las plantas desarrollaron
clorosis, marchitez, enrollamiento de las hojas hacia el envés y defoliación de hojas en
verde.
Progreso de la enfermedad
Los primeros síntomas de la enfermedad se identificaron en la tercera semana de
la inoculación tanto en las plantas de ‘Picual’ como en las de ‘Frantoio’. Sin embargo,
el valor medio de severidad final en las plantas de ‘Frantoio’, independientemente del
patotipo, fue muy bajo (Tabla 1). Durante el periodo de evaluación el porcentaje de
plantas muertas en los plantones inoculados fue cero. El ABCPE demostró el progreso
de la enfermedad en el cultivar Picual inoculado con el patotipo no defoliante V4 fue
142
Estancia en el extranjero
significativamente mayor en comparación con las otras combinaciones cultivar-patotipo
(Tabla 1).
Visualización del patógeno
Durante la estancia fue complicado encontrar estructuras de los dos aislados
inoculados (V117, V4). Únicamente en la parte media del tallo de un plantón de ‘Picual’
se visualizó una clara colonización en los haces vasculares del aislado (V117). En las
semanas previas al inicio de la estancia hubo una identificación positiva de los 2
aislados en el sistema radical.
Tabla 1. Progresión de los parámetros de la enfermedad en plantas de ‘Picual’ y
‘Frantoio’ inoculadas con dos patotipos, V117 (defoliante) y V4 (no defoliante) en
condiciones controladas de invernadero a.
a
Valores en columna seguidos de la misma letra no difirieron significativamente a un nivel de
PS (SEMANAS) b
ABCPE(%) d Incidenca (%)
SM plantas
afectadas
Cultivar, patotipo
Rango
Media
SM c
Picual (V-117)
3-9
5.1
1.3 a
17.6 a
100
1.3
Picual (V-4)
3-7
4.7
1.8 a
27.2 b
100
1.8
Frantoio (V-117)
3-7
5
0.1 b
1.5 c
20
0.4
Frantoio (V-4)
3-7
5
0.06 b
1.0 c
20
0.2
probabilidad de P=0.05 según el test de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher
(LSD).
b
PS = Tiempo en semanas desde la inoculación hasta el inicio de los primeros síntomas.
c
SM = Severidad Media.
d
ABCPE = Área bajo la curva progresión de la enfermedad calculada utilizando la integración
trapezoidal de los valores de severidad expresado como porcentaje respecto al valor máximo
teórico.
143
Anejo 1
Experimento II: Distribución de Verticillium dahliae en plantones de Fresno y
Arce.
Material vegetal.
Para este experimento se emplearon plantones de arce y de fresno de 3 años de
edad que se plantaron en un campo naturalmente infestado (10 propágulos/gramo)
localizado en Randwijk (Holanda).
Inoculación
A principios de agosto del año 2013, 115 plantones de arce y 101 plantones de
fresno fueron inoculados (1.105conidios/ml) con un aislado no defoliante el cual era
patogénico para ambas especies (Hiemstra, 1998). Para realizar esta inoculación se
realizó una hendidura a una altura aproximada de 30 cm y mediante una inyección en el
tronco se introdujo la suspensión conidial. Una vez introducido el inóculo, la herida se
tapó con una cinta biodegradable. Esta inoculación fue realizada por el Dr. Jelle
Hiemstra y el doctorando Motjaba Keykha Saber.
Recogida y procesado de muestras
Una semana antes del inicio de la estancia se arrancaron 8 árboles afectados por
la enfermedad. 4 plantones de arce y 4 plantones de aresno. Una semana después, ya en
el laboratorio, de cada árbol se cortaron 5 secciones de 10 cm. 2 por debajo del punto de
inoculación y 3 por encima. De cada sección se extrajeron virutas de madera de la parte
nueva y vieja. Las cuales se introdujeron en tubos eppendorff de 2 ml diferentes para la
posterior extracción de ADN.
La extracción de ADN de las muestras, 80 en total, se realizó con el Kit
comercial de Qiagen, llamado DNeasy Plant Mini Kit. Una vez realizada la extracción
de ADN, las muestras se conservaron en un congelador a -20ºC.
A finales de septiembre se volvieron arrancar 16 árboles afectados por la
enfermedad, 8 plantones de arce y 8 de fresno y se volvió a repetir el proceso descrito
en el párrafo anterior.
Una vez se obtuvo el ADN de todas las secciones, de cada muestra se realizó
una qPCR a tiempo real, mediante la técnica SYBRGreen, con los primers específicos
para V. dahliae desarrollados por Khanh Pham en el laboratorio de Lisse (Van Doorn et
al., 2009), basados en secuencias ITS. Mediante la qPCR se obtuvo la cantidad de ADN
de V. dahliae de cada muestra en nanogramos (ng) respecto al ADN total de la planta
también en (ng). Además, de cada sección de cada muestra analizada se realizaron
aislamientos del patógeno para corroborar los resultados obtenidos mediante las técnicas
moleculares.
144
Estancia en el extranjero
Resultados preliminares
Los resultados de este trabajo actualmente están siendo elaborados para su
posterior publicación.
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Island, Greece.
145
Anejo 1
FIGURAS SUPLEMENTARIAS
Figuras del anejo 1
Experimento I ubicado en un invernadero de la Universidad de Wageningen. A.
Disposición de todas las plantas del ensayo. B. Plantón de Picual inoculado con
el aislado V117 modificado genéticamente respecto a su testigo, 6 semanas
después de realizar la inoculación.
Campo experimental naturalmente infestado por V. dahliae (10
propágulos/gramo) localizado en Randwijk (Holanda). A. Síntomas de la
enfermedad en fresno. B. Planta muerta de arce a causa de la enfermedad.
146
Estancia en el extranjero
Sección de una rama de arce (Acer platanoides) y sección de una rama de Fresno
(Fraxinus excelsior) afectados por la enfermedad.
Procesado de las muestras de arce y fresno para la realización de aislamientos y
extracción de ADN.
147
Anejo 1
Aislamientos de Verticillium dahliae sobre Arce (Acer platanoides).
148
Producción científica
149
150
Producción científica
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DURANTE LA TESIS DOCTORAL
Contribución a revistas internacionales de carácter científico (SCI)
Chattaoui M., Raya, M.C., Bouri, M., Moral, J., Pérez-Rodriguez, M., TraperoCasas, A., Msallem, M., and Rhouma, A. 2015. Morphological, Physiological
and molecular characterization of a Colletotrichum population associated to olive
(Olea europaea) anthracnose in Northern Tunisia. J Appl. Microbiol. (Accepted,
in Press).
Chattaoui M., Raya, M.C., Bouri, M., Pérez-Rodríguez, M., Moral, J., Trapero, A.,
Msallem, M., and Rhouma, A. 2014. First report olive anthracnose caused by
Colletotrichum acutatum in Tunisia. Plant Dis. (Doi: 10.1094/PDIS-05-13-0519PDN).
Chattaoui, M., Rhouma, A., Msallem, M., Pérez, M., Moral, J., and Trapero, A.
2012. First Report of Botryospheria obtusa as Casual Agent of Olive Tree Branch
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García-Cabello, S., Pérez-Rodríguez, M., Blanco-López, M.A., and LópezEscudero, F.J. 2012. Distribution of Verticillium dahliae through watering
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Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J.,
Arquero O., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015a. Influence of irrigation
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conditions. Plant Dis. (Accepted, in press).
151
Anejo 2
Contribución a revistas de carácter divulgativo
Moral J., Roca L.F, Romero J., Pérez M., Jurado J., Xaviér C.J., Cabello D., y
Trapero A., 2014. Gestión integrada de la antracnosis del olivo. Vida Rural 379:
2-6.
Aportaciones científicas en congresos nacionales
Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Serrano, N., Lorite, I.J., Arquero, O., Orgaz,
F., y López-Escudero, F.J. 2012. Efecto de la frecuencia de riego en la
Verticilosis del Olivo, en: XVI Congreso Sociedad Española de Fitopatología
(SEF), del 17 al 21 de Septiembre del 2012, Malaga, España. Libro de resúmenes,
PAN-99:300. (Póster)
Pérez-Rodríguez, M., Palma-Jiménez, M.J., Roca, L.F., Moral, J., y Trapero, A.,
2012. Evaluación de fungicidas para el control de Neofusicoccum mediterraneum
agente causal de la muerte de ramas de olivo, en: XVI Congreso Sociedad
Española de Fitopatología (SEF), del 17 al 21 de Septiembre del 2012, Malaga,
España. Libro de resúmenes, PAN-65:263. (Póster).
Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J., y LópezEscudero F. J., 2014. Influencia de la frecuencia de riego en la Verticilosis del
olivo en condiciones en condiciones semicontroladas y en campo, en XVII
Congreso Sociedad Española de Fitopatología (SEF) del 7-10 de Octubre del
2014, Lleida, España. Libro de resúmenes, SIM6-6 (0-48) 1459. (Comunicación
Oral).
Aportaciones científicas en congresos internacionales
Moral, J., Pérez-Rodríguez, M., Michailides, T.J., and Trapero, A. 2015. First
report of the teleomorph of Neofusicoccum mediterraneum, a pathogen of olive,
en: APS Annual meeting. Pasadena, California, USA 1-5 August 2015 (Póster).
Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J.,
Arquero O., Orgaz F., López-Escudero F.J. 2013. Influence of irrigation
frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive, en: 11 th
International Verticillium Symposium-Göttingen, Germany 5-8 May 2013
(Comunicación oral).
Pérez-Rodríguez, M., Lorite I.J., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015. Effect of
irrigation dose on Verticillium wilt of Olive, en: 7th Meeting of the IOBC/WPRS
integrated protection of olive crops Kalamata 11-14 May 2015 (Póster).
152
Producción científica
Pérez-Rodríguez, M., Serrano N., Lorite I.J., Arquero O., Orgaz F., and LópezEscudero F.J. 2015. Influence of irrigation frequency on the onset and
development of Verticillium wilt of olive, en: 7th Meeting of the IOBC/WPRS
integrated protection of olive crops Kalamata 11-14 May 2015 (Comunicación
oral).
Otras aportaciones
Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Evolución de la población de
Verticillium dahliae en el suelo en diferentes condiciones experimentales relacionadas
con el riego en olivar.” Mayo 2014. Departamento de Agronomía. Universidad de
Córdoba.
Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Evolución de Materias activas para
la eliminación de las estructuras infectivas de Verticillium dahliae en agua y residuos
decantados”. Julio 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba.
Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Influencia de la fertilización en la
Verticilosis del olivo en plantaciones afectadas en las comarcas de Sierra Morena y de
la Campiña de Jaén”. Septiembre 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de
Córdoba.
Codirector de la Tesis de Fin de Máster de Producción, Protección y Mejora
Vegetal titulada: “Influencia de componentes de la fertilización del olivo en la
supervivencia y germinación de las estructuras infectivas de Verticillium dahliae”.
Octubre 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba.
153
154
155