MEDIOS CROMOGENICOS vS TRADICIONALES (G - Medica-Tec

ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ DE LOS MEDIOS CROMOGENICOS EN LA
DETECCION DE Listeria monocytogenes FRENTE A LOS MEDIOS
SELECTIVOS TRADICIONALES.
Mengoni Graciela B. (1)
(1)
Carrera de Tecnología de Alimentos y Acuicultura. Universidad Nacional del Centro de la
Provincia de Bs. As. - Tandil. Laboratorio LISTER La Plata. (1900). Argentina.
E-mail: gmengoni@speedy.com.ar
INTRODUCCION
El incremento del comercio internacional de alimentos en los últimos años hizo
necesario el uso de medios de diagnóstico microbiológicos cada vez más
rápidos y eficientes. Es así, que las empresas productoras de medios para
detección y recuento de microorganismos han desarrollado una gran variedad
de medios de cultivos, kits y equipos que permiten un diagnóstico cada vez
más rápido y sumamente eficaz, que conducen a obtener resultados sobre la
presencia de determinado patógeno en tan solo 24 a 48 horas, frente a
métodos tradicionales que requieren de entre 5 a 7 días para obtener un
resultado. Una de estas nuevas herramientas con que cuentan los
microbiólogos actualmente son los medios de cultivo cromogénicos, basados
en reacciones de color frente al patógeno buscado, y hasta permiten poner de
manifiesto la producción de hemolisinas en tan solo 24 a 48 hs mostrando una
sensibilidad cercana al 100%.
OBJETIVO
El presente trabajo fue realizado para comparar la selectividad de los nuevos
medios cromogénicos para la detección de L.monocytogenes, frente a los
medios selectivos tradicionales, en cuanto a rapidez en la obtención de
resultados, la selectividad, especificidad y productividad de los mismos.
MATERIALES y MEDIOS:
 La matriz utilizada fue helado con 10%, 6% y 1,5 % de materia grasa








Los medios de cultivo usados:
Caldo Half Fraser (Biokar-Francia)
Caldo Fraser (Biokar-Francia)
Suplemento para caldo Half Fraser (Biokar-Francia)
Palcam agar (Biokar-Francia)
Suplemento de agar Palcam (Biokar-Francia)
Medio cromogénico para Listeria (CHROMagar – Francia)
Medio SIM (Merck-Alemania)
Agar tripteina soja (Biokar-Francia)
 Agar sangre equina al 5% (Lab. Gutierrez-Argentina)
 Agar sangre ovina al 5% (Lab. Gutierrez-Argentina)
Cepa de referencia L.monocytogenes ATCC 7644 (Microbiologics Inc.-USA)
Cepa de L.inocua ATCC 814. (Microbiologics Inc.-USA)
METODO
Se inocularon 38 muestras de helado, dejando 2 muestras para control blanco,
sin inocular.
Se utilizó el método UNE-EN ISO 11290 para la detección de L.monocytogenes
en helados, con concentraciones de materia grasa de 10%, 6% y 1,5%.
La inoculación de los helados se realizó con cultivos de 24 hs. de
L.monocytogenes ATCC 7644 y Listeria sp., en niveles de 100 ufc, 10 ufc y < 5
ufc. por 25 gr. de helado. Cada muestra de diferente contenido graso fue
inoculada con cada uno de los niveles de L.monocytogenes y Listeria sp.
conjuntamente. Se llevaron a freezer, y a las 18-24 hs. se inició el ensayo.
Microorganismos
(en 25 g)
L.monocytogenes
Listeria sp.
Flora autóctona
Inoculación de muestras
Blanco
Nivel bajo
+
1-4
1-4
+
Nivel
medio
10
10
+
Nivel alto
99-100
100-150
+
Siguiendo las recomendaciones de la Norma ISO mencionada, como
enriquecimiento primario se utilizó caldo Fraser a la mitad de la concentración
el cual se incubó a 30°C por 24 hs. ± 2 hs. El medio secundario, caldo Fraser
a la concentración normal, se incubó a 35°C por 48 hs. y luego se realizó el
aislamiento en agar Palcam (uno de los recomendados por la Norma), y en el
agar cromogénico CHROMagar Listeria, en reemplazo del medio ALOA.
Ambos medios sólidos se incubaron a 35°C por 24 hs.- 48 hs.
Las colonias sospechosas de ser Listeria fueron sometidas a pruebas de
identificación: coloración de Gram, reacción de catalasa, movilidad a 22°C,
hemólisis en sangre equina, fermentación de azúcares: ramnosa y xilosa, y test
de CAMP.
RESULTADOS
Las muestras blanco resultaron negativas en los dos medios, puesta de
manifiesto por la falta de crecimiento.
El medio CHROMagar Listeria presentó mayor sensibilidad (100%) frente al
medio Palcam (86%). Un 14% de las placas de Palcam presentaron cultivos
puros de colonias atípicas. (Ver fotos 1 y 2)
Foto 1: Se observa cultivo puro de colonias atípicas sobre fondo fucsia oscuro
Microscópicamente: bacilos Gram (-), anchos, muy largos.
Foto 2: Se observa cultivo puro de colonias atípicas en Palcam agar, mucosas, verdosas, sobre
fondo fucsia oscuro. Microscópicamente: bacilos Gram (-), anchos, con esporas.
Del mismo modo muchas de las placas de Palcam que resultaron positivas
para Listeria sp, presentaban abundante flora acompañante y debieron ser
incubaras por 24 hs. adicionales para poder observar las características de las
colonias que nos hiciera sospechar de la presencia de Listeria.
Se observó el detalle de la diferente coloración del fondo de las placas (Ver foto
3). Las que presentaron el cultivo puro de bacilos largos mostraba un fondo
fucsia muy oscuro, las placas que presentaron Listeria a las 48hs se veían con
fondo marrón negruzco, y las placas que presentaron colonias típicas en poca
cantidad a las 24 hs. se presentaron con fondo negro y naranja-ámbar. En
este ultimo caso, dado el escaso crecimiento, las colonias son
aproximadamente de 2 mm. con las características bien típicas de Listeria en
este medio: grisáceas o verdosas con depresión central negra sobre fondo
fucsia-naranja, debido a que no fermenta el manitol que contiene el medio (Ver
foto 4)
Foto 3: Se observan los distintos colores de fondo en el agar Palcam. Abajo a la izquierda, se
ve una muestra negativa en ambos medios: CHROMagar Listeria sin desarrollo y Palcam agar
colonias amarillas.
Foto 4: colonias típicas en agar Palcam.
Las colonias típicas de Listeria sp deben observarse en CHOMagar Listeria a
las 24 hs. de incubación. El halo que presentan las cepas hemolíticas de
L.monocytogenes o L.ivanovii, crece aproximadamente 5 mm. en 24 hs. y esto
hace que si se dejan más de 24 hs., y el crecimiento es abundante, cubra toda
la placa y puede prestarse a confusión en técnicos no muy experimentados,
pensando que se trata de colonias no hemolíticas. Algunas placas con
abundante crecimiento se encontraban totalmente cubiertas pasadas las 24
hs., dejando solo una pequeña porción sin halo.
El medio cromogénico no presentó ningún falso positivo ni falso negativo para
la presencia de Listeria sp. El color de las colonias se presentaban celestes
de 2 mm. para L.monocytogenes y más azules y pequeñas para L.inocua (Ver
foto 5). Esta última, en muchos casos queda cubierta por el halo.
Foto 5: Colonias típicas de Listerias hemolíticas (L.monocytogenes y L.ivanovii) y no
hemolíticas, azules en el trazo.
Nota: en esta foto, la placa se ve oscura pero en realidad es transparente como en las fotos
anteriores.
Para la identificación de L.monocytogenes en colonias típicas y en placas con
halo total, se realizaron pruebas de identificación de acuerdo con el siguiente
cuadro:
Diferenciación de las especies de Listeria:
L.monocytogenes
Ensayo
Ramnosa
+
Xilosa
Hemólisis
Β-hemólisis
Si la hemólisis no es neta,
sangre ovina.
Linocua
+
No-hemólisis
Livanovii
+
Doble Β-hemólisis
es conveniente realizar el test CAMP en agar
CONCLUSIONES
En este estudio, el patógeno fue eficazmente detectado con el medio
cromogénico.
Aún en las muestras con 10% de grasa, inoculadas con el nivel más bajo del
microorganismo, en donde la cantidad de materia grasa del alimento actúa
como protectora del mismo, la que favorece la capacidad psicrotofa de Listeria
que le permite sobrevivir y reproducirse a bajas temperaturas, el medio
cromogénico funcionó de manera muy eficaz.
Dados los resultados obtenidos y la fácil detección de L.monocytogenes
mediante este medio, se concluye que el mismo tiene una buena performance,
rápidez y eficiencia en la detección de este patógeno, y puede ser utilizado con
confianza como medio alternativo frente a los medios tradicionales.
BIBLIOGRAFIA
1. AFNOR CHROMagarTM Listeria. Certificado de Validation como Método
alternativo de acuerdo al Standard EN-ISO 11290-1 A1- 2004.
2. AFNOR. 2006. ATTESTATION DE VALIDATION OF METHODE
ALTERNATIVE D´ANALYSE SUIVANT LA NORME NF EN ISO 16140:2003.
Estudio colaborativo interlaboratorios. Vencimiento de la validación: Diciembre
del 2009
3. El Marrackchi A, Boum´handi N y Hamama A. 2005. Performance of a ner
chromogenic plating medium for the isolation of Listeria monocytogenes from
marine environments. Letters in Apllied Microbiology. 40:87-91
4. Leclercq, A. . 2004. Colonial atypical morphology and low recoveries of Listeria
monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid´L.mono and ALOA solid
media. J. Microbiol. Methods. 57:251-258
5. Mengoni G, Pellon H. 1999. Comparación de recuentos de coniformes y E.coli
utilizando un medio cromogénico y películas rehidratables en muestras de
superficie de carcasa bovina. La Industria cárnica Latinoamericana 116:48-50
6.
Mengoni G, Narvaiz P, Veronesi P, Gomez F. 2005. Control de Listeria
monocytogenes y otros patógenos mediante radiaciones gamma en tartas de
pollo. Trabajo realizado bajo contrato de investigación CNEA-Agencia
Internacional de Energía Atómica (IAEA) y Laboratorio LISTER
7. Patel JR; Beuchat LR.1995. Evaluation of enrichment broths for their ability to
recover heat-injured Listeria monocytogenes. -Appl-Bacteriol. Apr; 78(4):366-72