LANASEVE Rige a partir de: 20/09/10 Código: IA-MBA-PT- 016 Determinación de Listeria monocytogenes Versión 01 Página - 1 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 1. Objetivo Disponer de un método para detectar la presencia de Listeria monocytogenes. 2. Alcance Para aplicar en muestras lácteas, pescado y mariscos. 3. Responsabilidad y Autoridad Jefe de Sección: debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Analistas de laboratorio: deben realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento. 4. Definiciones No aplica 5. Abreviaturas y siglas BLEB: Buffered Listeria Enrichment Broth (Listeria leche) 6. Referencias y/o Bibliografía IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes IA-MBA-PE-012-RE-006 Control Interno para análisis de Listeria monocytogenes (FDA) IA-MBA-PE-015 Control de calidad de reactivos IA-MBA-PO-004 Control de Equipo SEG-PE- 005 Control de medios de cultivo FDA Manual de Bacteriología Analítica 8ava Online Capítulo 10 Edición Enero 2003 Instrucciones para la identificación bioquímica de Listeria con el sistema api® Listeria Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 20/09/10 Código: IA-MBA-PT- 016 Determinación de Listeria monocytogenes Versión 01 Página - 2 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7. Descripción del procedimiento 7.1 Fundamento teórico El método consiste en el pre-enriquecimiento de la muestra en caldo listeria leche, este medio contiene acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida agentes selectivos que inhiben los microorganismos competidores. Posteriormente se hace un aislamiento selectivo en agar Oxford para luego hacer la confirmación de las colonias sospechosas con pruebas bioquímicas y pruebas diferenciales (hemólisis, motilidad) 7.2. Equipo, materiales, medios de cultivo y reactivos 7.2.1 Equipo Balanza sensibilidad 0,1g Homogenizador o Stomacher Incubadora de 30 ºC ± 1ºC Incubadora de 35 ºC 1ºC Vortex 7.2.2 Materiales Bolsas plásticas para stomacher 7 ½ x 11 ¾ pulg (ancho x largo) con cierre de alambre Pipetas de vidrio de 1 ml, 2 ml Micropipeta de 50 l -200 l Puntas micropipeta 20 l -200 ul Asas bacteriológicas Aplicadores con algodón estéril 7.2.3 Medios de Cultivo y reactivos Caldo Listeria leche (Buffered Listeria Enrichment Broth) Agar Oxford leche Agar motilidad Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 20/09/10 Código: IA-MBA-PT- 016 Determinación de Listeria monocytogenes Versión 01 Página - 3 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Agar sangre de oveja al 5% Agar tripticasa soya con extracto de levadura Caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC) api® Listeria 7.2.4 Cepas de referencia Listeria monocytogenes Listeria innocua 7.3 Procedimiento Día 1 7.3.1 Pesar 25 gramos de la muestra en una bolsa plástica estéril de stomacher. 7.3.2 Agregar 225 ml de caldo listeria leche y mezclar en stomacher durante 2 minutos. 7.3.3 Incubar el caldo a 30 °C ± 1°C por 24 horas. Día 2 7.3.4 Colocar 0,1 ml del caldo en la placa de agar Oxford leche y con un aplicador con algodón estéril rayar el 25 al 50 % de la superficie del agar . Con el asa bacteriológica rayar la superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 ± 1°C por 24 horas. 7.3.5 El caldo reincubar a 30 °C ± 1°C por 24 horas más. Día 3 7.3.6 Examinar los platos que tengan colonias con morfología típica de Listeria, pequeñas rodeadas de un halo oscuro debido a la hidrólisis de esculina. 7.3.7 Si la placa no presenta crecimiento, reincubar por 24 horas más 7.3.8 Tomar 5 colonias sospechosas y rayar en agar tripticasa soya con extracto de levadura, incubar 35 °C ± 1°C por 24 horas 7.3.9 Colocar 0,1 ml del caldo de 48 horas en la placa de agar Oxford leche y con un aplicador con algodón estéril rayar el 25 al 50 % de la superficie del agar. Con el asa bacteriológica rayar la Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 20/09/10 Código: IA-MBA-PT- 016 Determinación de Listeria monocytogenes Versión 01 Página - 4 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 ± 1°C por 24 horas. Día 4 7.3.10 Examinar los platos (de 24 horas y de 48 horas), buscar colonias con morfología típica de Listeria, pequeñas rodeadas de un halo oscuro debido a la hidrólisis de esculina. 7.3.11 Inocular un tubo de medio motilidad a partir de las colonias aisladas en agar tripticasa soya con extracto de levadura e incubar a por 7 días a temperatura ambiente. Observar diariamente. 7.3.12 A partir del agar tripticasa soya con extracto de levadura, inocular por punción una placa de agar sangre de de oveja al 5%, tomar de 20 a 25 colonias. Incubar la placa a 35 °C ± 1°C por 24 horas Día 5 7.3.13 Hacer la lectura de los tubos de medio motilidad, la movilidad característica de Listeria es de “sombrilla” 7.3.14 Buscar colonias con beta hemólisis en la placa de agar sangre. 7.3.15 Inocular api® Listeria usando colonias beta hemolíticas. Incubar 24 horas a 35 °C ± 1°C 7.3.16 Si no hubiera crecimiento en el agar oxford leche depués de 48 horas , ni colonias sospechosas en el agar sangre, reportar el resultado como ausencia de Listeria monocytogenes. Día 6 7.3.17 Lectura del api® Listeria 7.4 Control de Calidad 7.4.1 Cada lote de reactivos de galerías api® Listeria se les hará control de calidad por medio de cepas de referencia siguiendo procedimiento IA-MBA- PE-015 Control de calidad de reactivos. 7.4.2 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al procedimiento SEG-PE-005. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 20/09/10 Código: IA-MBA-PT- 016 Determinación de Listeria monocytogenes Versión 01 Página - 5 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.5 Reporte de resultados 7.5.1 Reportar presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g 7.5.2 El resultado y los datos obtenidos en cada paso del análisis se registran en el formulario IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes 7.6 Puntos Críticos de Control Control de las temperaturas de los incubadores: se debe mantener el registro de la temperatura óptima de cada incubador, así como las medidas correctivas a seguir en caso de alguna variable, , según se establece en el procedimiento IA-MBA-PO-004 Control de Equipos 8. Anexos No aplica Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada