Documento 2171399

Enz
Ag Accw = Complejo Anticuerpo - Conjugado enzima-antígeno
–
Ka = Tasa Constante de Asociación
k-a = Tasa Constante de Disociación
K = Ka / K –a = Constante de Equilibrio
Después que el equilibrio se mantiene, la fracción unida al
anticuerpo es separada del antígeno no unido mediante
decantación o aspiración. La actividad enzimática determinada
con un sustrato que genera luz, la fracción unida a anticuerpo
será inversamente proporcional a la concentración del antígeno
nativo. Al utilizar varios sueros de referencia diferentes con
concentración de antígenos conocida, se puede generar una
curva de respuesta de dosis a partir de la cual se establece la
concentración de antígeno de una sustancia desconocida.
Triyodotironina (T3)
Código del producto:175-300
Propósito: Determinación cuantitativa de Concentración
total de Triyodotironina en Suero o plasma humano
mediante inmunoensayo de Quimioluminiscencia en
microplacas (CLIA)
RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO
La medición de la concentración de Triyodotironina sérica es
generalmente considerada como una herramienta valiosa para
el diagnóstico de la disfunción tiroidal. La importancia de este
ensayo brinda los medios para lograr una significativa mejoría
en la metodología del ensayo que se ha registrado en las
últimas 2 décadas. La aparición de anti-suero monoespecífico y
el descubrimiento de agentes bloqueadores de las proteínas
séricas unidas al T3 permitieron el desarrollo de un
procedimiento sencillo de radioinmunoensayo (1,2).
La metodología de inmunoensayo enzimático por microplacas
proporciona la técnica de sensibilidad óptima donde se requiere
pocas manipulaciones. De acuerdo con este método, el suero
de referencia, la muestra del paciente o el control es primero
adicionado al pozo de la microplaca. El conjugado de enzima T3
es adicionado y luego los reactivos son mezclados. El resultado
es una reacción de competencia entre el conjugado de enzima y
la Triyodotironina nativa para un número limitado de anticuerpos
que combinan sitios inmovilizados en el pozo.
Después de completar el período de incubación requerido, el
anticuerpo unido al conjugado de enzima-T3 es separado del
conjugado enzima-T3 no unido mediante aspiración o
decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie
del pozo se cuantifica mediante reacción con un sustrato
luminiscente.
El uso de varios sueros de referencia de concentraciones
conocidas de Triyodotironina permite la construcción de una
grafica de actividad y concentración. Desde la comparación a la
curva dosis respuesta, una actividad de la muestra desconocida
puede ser correlacionada con la concentración de T3.
PRINCIPIO
Inmunoensayo competitivo de quimioluminiscencia (Tipo 5)
Los reactivos esenciales requeridos para un inmunoensayo
enzimático de fase sólida incluyen anticuerpos inmovilizados,
conjugado enzima-antígeno y el antígeno nativo.
Después de la mezcla del anticuerpo inmovilizado, el conjugado
enzima-antígeno y el suero que contiene el antígeno nativo, se
obtiene una reacción de competencia entre el antígeno nativo y
el conjugado enzima-antígeno para un número limitado de sitios
de unión insolubilizados. La interacción es ilustrada por la
siguiente ecuación:
Ka
Enz
enz
Ag + Ag + Acc.w.
AgAbc.w. + AgAccw
K-a
Ac c.w = Anticuerpo Inmovilizado Monoespecífico (Cantidad
constante)
Ag = Antígeno Nativo (Cantidad variable)
Enz
Ag = Conjugado Enzima-Antígeno (Cantidad constante)
AgAcc.w.= Complejo Antígeno-anticuerpo
REACTIVOS
Materiales Suministrados
A. Suero de Referencia Humano– 1ml/vial- Iconos A-F
6 viales de suero de referencia para Triyodotironina a
concentraciones aproximadas de 0 (A), 0.5 (B), 1.0 (C), 2.5 (D),
5.0 (E) y 7.5 (F) ng/ml. Almacenar de 2-8ºC. Un conservante ha
sido adicionado.
B. Trazador T3 total – 1.5 ml/vial – icono
Un (1) vial de conjugado T3 -peroxidasa de rábano picante
(HRP) en una matriz estabilizada con albúmina. Un conservante
ha sido adicionado. Almacenar de 2-8ºC.
C. Buffer trazador T3 total /T4 – 13 ml – Icono
Un reactivo en frasco que contiene buffer, tinción roja,
conservante e inhibidores de unión a las proteínas. Almacenar
de 2-8 ºC.
D. Pozos de reacción de luz T3-- 96 pozos- Icono
Una microplaca blanca de 96 pozos cubierta con suero anti-T3
de oveja y empacada en una bolsa de aluminio con un agente
de secado. Almacenar de 2-8ºC.
E. Concentrado de Solución de Lavado- 20 ml – Icono
Un vial que contiene un surfactante en tampón salino. Un
conservante ha sido adicionado. Almacenar de 2-30ºC.
F. Reactivo de señal A – 7 ml/vial- Icono CA
Un (1) frasco que contiene luminol en búfer. Almacenar de 28ºC.
B
G. Reactivo de señal B – 7 ml/vial – Icono C
Un (1) frasco que contiene peróxido de hidrógeno (H2O2) en
búfer. Almacenar de 2-8ºC.
H. Instrucciones del Producto
Nota 1: No usar reactivos más allá de la fecha de expiración
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando
son almacenados de 2-8ºC.
Nota 3: Los reactivos anteriores son para una sola microplaca
de 96 pozos.
PRECAUCIONES
Para uso Diagnóstico in Vitro
No para uso externo o interno en humanos o animales
Todos los productos que contienen suero humano han sido
hallados no reactivos para antígeno de superficie de hepatitis
B, VIH 1 y 2 y anticuerpos HCV según pruebas exigidas por la
A. Ninguna prueba puede asegurar completamente la ausencia
de agentes infecciosos, Todos los productos de suero humano
deben manipularse como potencialmente peligrosos y con
capacidad de transmitir enfermedades. Las buenas practicas
de laboratorio para el manejo de productos sanguíneos pueden
ser encontrados en el Centro de Control de Enfermedades/
Instituto Nacional de Salud, “Bioseguridad en Laboratorios
Microbiológicos y Biomédicos”, 2da Edición, 1988, HHS
Publicación Nº (CDC) 88-8395.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Se deben emplear las precauciones en la recolección de
muestras por punción venosa para las muestras de suero o
sangre. La sangre se recolecta por punción venosa en un tubo
de 10mL al vacío con silicona o tubos al vació que contengan
EDTA o heparina. Centrifugar la muestra para separar el suero
o plasma de las células rojas para el procedimiento de T3 Total.
Las muestras pueden ser refrigeradas de 2-8ºC por un período
máximo de 48 horas. Si la muestra no puede ser ensayada
dentro de este tiempo, la muestra puede ser almacenada a
temperatura de -20ºC por hasta 30 días. Antes del ensayo
permitir que las muestras alcancen temperatura ambiente (20ºC
– 27ºC). Cuando ensayamos en duplicado, se requiere 0.100ml
de las muestras.
Materiales requeridos pero no proporcionados:
1. Pipeta de 50µl con una precisión superior a 1.5%
2.
Dispensador(es) para mediciones repetitivas de 0.100 ml y
0.350ml con una precisión superior al 1.5%.
3.
Dispensador de volumen graduable (20-200µl) y (2001000µl) para diluciones de conjugado y sustrato.
4.
Lavador de microplaca o botella de lavado (opcional).
5.
Luminómetro de Microplaca
6.
Tubos de ensayo para dilución de conjugado de enzimas y
sustratos Ay B.
7.
Papel absorbente para secar los pozos de la microplaca.
8.
Cubierta plástica o de microplaca para los pasos de
incubación.
9.
Aspirador al vacío (opcional) para los pasos de lavado.
10. Cronómetro
11. Materiales de control de calidad.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS
1. Solución de Conjugado de trabajo Trazador T3-Enzima
Diluir el trazador T3 en proporción de 1:11 con un búfer de
trazador de T3 total/T4 en un recipiente limpio. Por ejemplo,
diluir 160µl de conjugado con 1.6 ml de buffer para 16 pozos (se
prepara un ligero exceso de solución). Este reactivo debe ser
usado dentro de las 24 horas para un máximo desempeño del
ensayo. Almacenar de 2-8ºC.
Formula general: Cantidad de búfer requerido = número de
pozos x 0.1
Cantidad de enzima-T3 necesaria =# de pozos x 0.01 por
ejemplo = 16 x 0.1 = 1.6ml para un total de búfer de conjugado
T3 total/T4.
16 x 0.01 =0.16ml (160µl) para el conjugado enzima-T3.
2. Buffer para Lavado
Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado con 1000 ml
de agua destilada o des ionizada en un recipiente adecuado de
almacenamiento. Almacenar el búfer diluido a temperatura
ambiente de 20-27ºC.
3. Solución de trabajo reactivo de señal - Almacenar de 28ºC
Determinar la cantidad de reactivos necesarios y preparar
mezclando porciones iguales del reactivo de señal A y del
reactivo de señal B en un recipiente limpio. Por ejemplo,
adicionar 1ml de A y 1ml de B por cada dos (2) tiras de pozos
de ocho (se prepara un ligero exceso de solución). Eliminar la
porción no utilizada en caso de que no se emplee dentro de
las 36 horas siguientes al mezclado. Si se planea la
utilización total de los reactivos, teniendo en cuenta las
limitaciones de tiempo anteriores, verter el contenido del
reactivo de señal B dentro del reactivo de señal A y Etiquetar
según corresponda.
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA
Antes de seguir adelante con el ensayo, los reactivos, los
sueros de referencias y controles deberán estar a temperatura
ambiente (20-27ºC).
1.
Formatee los pozos de la microplaca para cada suero de
referencia, control y muestra de pacientes que deba
ensayarse en duplicado. Colocar las tiras no utilizadas de
micro pozos nuevamente en la bolsa de aluminio, sellar y
almacenarlo de 2-8ºC.
2.
Pipetee 0.050 ml (50µl) del suero de referencia apropiado,
control o muestras dentro del pocillo asignado.
3.
Adicione 0.100ml (100µl) de Trazador de trabajo, solución
de conjugado Enzima -T3 a todos los pozos.(Ver sección
de preparación de reactivos)
4.
Agite suavemente la microplaca durante 20-30 segundos
mezclar y cubrir.
5.
Incube durante 45 minutos a temperatura ambiente.
6.
Elimine el contenido de la microplaca mediante
decantación o aspiración. Si se decanta, golpee la placa y
séquela con papel absorbente.
7.
Adicione 350µl de buffer de lavado (ver Sección
Preparación de Reactivos), decante (golpear y secar) o
aspire. Repetir 4 veces más (4) para obtener un total de 5
lavados. Se puede utilizar un lavador automático o
manual de placas. Seguir las instrucciones del
fabricante para asegurar el uso apropiado. Si se utiliza
un frasco de lavado, llene cada pozo oprimiendo el
recipiente (evitar la formación de burbujas de aire)
dispensar las solución de lavado. Decante la solución
de lavado y repita 4 veces más.
8.
Adicione 0.100 ml (100µl) de solución de trabajo - reactivo
de señal a todos los pozos (Ver Sección de Preparación
del Reactivo). Siempre adicione los reactivos en el
mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo
de reacción entre los pozos.
9.
Incube por 5 minutos en la oscuridad a temperatura
ambiente.
10. Lea las unidades relativas de luz RLU en cada pocillo,
durante un mínimo de 0.5-1.0 segundos, utilizando un
Luminómetro de microplacas. Los resultados deberán
leerse dentro de los siguientes 30 minutos después de
adicionar la solución de sustrato.
Nota: Para analizar nuevamente muestras con concentraciones
superiores a 7.5 ng/ml, pipetee 25µl de la muestra y 25µl de
suero de referencia 0, dentro del pozo de la muestra (este
procedimiento mantiene una concentración uniforme de
proteínas). Multiplicar el valor de lectura por 2 para obtener la
concentración de Triyodotironina.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe analizar controles externos a niveles en
los rangos de hipotiroidea, eutiroides e hipertiroide para
monitorear el desempeño de los ensayos. Estos controles
deben ser tratados como desconocidos y los valores
determinados en cada procedimiento de prueba realizada. Se
mantendrán gráficos de control de calidad para hacerle un
seguimiento al desempeño de los reactivos suministrados. Se
deberán utilizar métodos estadísticos pertinentes para evaluar
las tendencias. Los
laboratorios en particular deberán
establecer límites aceptables de desempeño de los ensayos.
Adicionalmente, la intensidad máxima de luz deberá ser
consistente con lo registrado anteriormente. Una desviación
significativa a partir de los datos establecidos de desempeño
puede indicar que hay cambios no perceptibles en condiciones
experimentales o degradación de los reactivos del Kit. Los
reactivos frescos serán usados para determinar la razón para
las variaciones.
RESULTADOS
Una curva dosis respuesta es usada para determinar la
concentración de Triyodotironina en muestras desconocidas.
1.
Registre los valores RLUs obtenidos a partir de la
impresión de los resultados de las lecturas del lector de
microplacas como se señala en el Ejemplo 1.
2.
Grafique los RLU para cada suero de referencia en
duplicado vs la concentración T3 correspondiente en ng/ml
sobre un papel de gráfica lineal.
3.
Trace la curva de mejor ajuste a través de los puntos
graficados.
4.
Determinar la concentración de T3 para un valor
desconocido, ubicar los RLUs promedio para cada dato
desconocido en el eje vertical del grafico, encuentre el
punto de intersección en la curva y lea la lectura de la
concentración (ng/ml) a partir del eje horizontal del grafico
(los duplicados de muestras desconocidas pueden
promediarse según se indica). En el siguiente ejemplo, el
RLU promedio (63817) del valor desconocido se intercepta
con la curva de calibración en una concentración de T3
(1.4 ng/ml) (ver figura 1).
Nota 1: Se puede igualmente utilizar el software de reducción
de datos computarizados diseñados para ensayos de
quimioluminiscencia con el fin de obtener la reducción de datos.
Los duplicados de los valores desconocidos se pueden
promediar como se indica (ver Figura 1)
Nota 2: Monobind puede asistir al laboratorio en la adquisición
e implementación de equipos / software para medir e interpretar
los datos de quimioluminiscencia.
* Los datos que se presentan en el ejemplo 1 y figura 1 tienen
el propósito de ilustrar solamente y no deben ser usados en
lugar de una curva dosis-respuesta preparada con cada ensayo.
Adicionalmente, los RLU de los calibradores se normalizaron a
100.000 RLU / segundo. Para el calibrador A (la mayor
producción de luz). Esta conversión minimiza las diferencias
causadas por la eficiencia de los diversos instrumentos que
pueden ser utilizados para medir la producción de luz.
EJEMPLO 1
88644
85333
E1
71996
F1
72553
G1
46658
H1
45247
Cal C
Cal D
A2
26556
B2
27219
Cal E
C2
19549
D2
17871
E2
71096
Cal F
Ctrl 1
F2
72393
G2
49482
Ctrl 2
H2
Pacien
te
Valor
C1
D1
Cal B
(ng/ml)
99532
Media
100468
B1
RLU (B)
RLU (A)
Número
de Pozo
Muestra
I.D.
A1
Cal A
100000
0
86989
0.5
72275
1.0
45952
2.5
26887
5.0
18710
7.5
71745
1.0
49732
2.2
63817
1.4
49981
A3
64506
B3
63127
PARÁMETROS DE CC
Con el fin de que los resultados del ensayo sean
considerados válidos deberán cumplir los siguientes
criterios:
1. La curva de respuesta de dosis deberá encontrarse dentro
de los parámetros establecidos
2.
4 de 6 pools de control de calidad deben ubicarse dentro
de los rangos establecidos.
TABLA I
Valores Esperados para el T3 AccuLiteTM CLIA
(En ng/ml)
ANALISIS DE RIESGOS
A. Desempeño del análisis
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo
sea mantenido en forma constante para obtener
resultados reproducibles.
2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10
minutos para evitar derivar el análisis.
3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas,
bemolizadas o contaminadas.
4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la
curva de respuesta a la dosis.
5. La adición del reactivo de señal inicia una reacción
cinética por lo tanto el reactivo de señal debe ser
adicionado en la misma frecuencia para eliminar
cualquier derivación de tiempo durante la reacción.
6.
La falla al remover solución adherida en los pasos
de aspiración o decantación
puede resultar en
replicación baja y resultados incorrectos.
7. Usar los componentes del mismo grupo no mezclar
los reactivos de diferentes conjuntos.
8. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como
seguir el tiempo exacto y la temperatura requerida.
Cualquier desviación de las instrucciones de uso puede
arrojar resultados inexactos.
9. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio
todos los estándares nacionales aplicables, regulaciones
y leyes de manera estricta para asegurar el cumplimiento
y uso adecuado del dispositivo.
10. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo:
pipetas,
lectores,
lavadores
y/o
instrumentos
automatizados con este reactivo y realizar un
mantenimiento preventivo rutinario
11. El análisis de riesgo – como la requiere la directiva
IVD 98/79/EC de la marca CE- para estos y otros
dispositivos elaborados por Monobind, pueden ser
solicitados vía E-mail: Monobind@monobind.com
B. interpretación
1. Los resultados de laboratorio por si solos son
únicamente un aspecto para determinar el cuidado del
paciente y no deben ser la única base para una terapia,
particularmente si los resultados están en conflicto con
otros determinantes.
2. Para resultados de pruebas válidas, los controles
adecuados y otros parámetros deben estar dentro de los
rangos listados y requerimientos del ensayo.
3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por
mezcla de partes de diferente kits, lo cual puede producir
resultados de prueba falsos o si los resultados son
interpretados incorrectamente, Monobind no tendrá
responsabilidad.
4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos
controlados por Computador para interpretar los
resultados del ensayo, es necesario que los valores de
predicción para los calibradores se ubiquen dentro del
10% de las concentraciones asignadas.
5. La concentración de Triyodotironina sérica total
dependerá de una serie de factores como son:
funcionamiento de la glándula tiroides y su regulación,
concentración de globulina unida a la tiroxina (TBG), y
unión de triyodotironina a TBG (3, 4). De esta manera, la
concentración total de triyodotironina por si sola no es
suficiente para evaluar la condición clínica.
6. Se encuentra una disminución de los valores totales
de triyodotironina en enfermedades de eliminación de
proteínas, en ciertas enfermedades hepáticas y en la
administración de testosterona, difenilhidantoina o
salicilatos. La publicación de la Asociación Americana de
Química Clínica (Journal American Association of Clinical
Chemists) Compiló una tabla de. medicamentos y
condiciones de interferencia, que afectan los valores de
Triyodotironina total.
RANGOS DE VALORES ESPERADOS
Se realizo un estudio de población de adultos eutiroideos para
determinar los valores esperados de T3 AccuLiteTM utilizando el
método CLIA.
Los valores medios (R), de la desviación estándar (σ) y rangos
esperados (±2 σ) son presentados en Tabla 1. El número total
de muestras fue de 85.
Promedio (X)
Desviación estándar (σ)
Rangos esperados (±2 σ)
1.22
0.35
0.52 - 1.98
Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un
rango de valores que puedan esperarse mediante la aplicación
de un método dado para una población de personas “normales”
dependerá de una multiplicidad de factores como son: La
especificidad del método, la población probada y precisión del
método según criterio del analista. Por estas razones cada
laboratorio deberá utilizar el rango de valores esperados
establecidos por el fabricante solamente hasta cuando los
analistas puedan establecer un rango propio utilizando el
método con una población propia del área donde se encuentra
ubicado el laboratorio.
Sustancia
l-Triyodotironina
l-tiroxina
Yodotirosina
Diyodotirosina
Diyodotironina
Fenilbutazona
Salicilato de sodio
Reacción cruzada
1.0000
< 0.0002
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
Concentración
-10ng/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
D. Sensibilidad
El procedimiento de prueba de Triyodotironina tiene una
sensibilidad de 0.04 ng/ml. La sensibilidad fue establecida por la
determinación de la variabilidad del suero calibrador de 0 ng/ml
y utilizando la estadística 2σ (95% de certeza) para calcular la
dosis mínima.
REFERENCIAS
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
A. Precisión
La precisión dentro de un ensayo e inter ensayo del T3 Acculite
se determinaron mediante análisis de tres niveles de un pool
sueros de control. El número, valor medio, desviación estándar
(σ) y el coeficiente de variación para cada uno de estos sueros
controles son presentados en la Tabla 2 y Tabla 3.
TABLA 2
Precisión dentro del Ensayo (Valores en ng/dl)
Muestra
Bajo
Normal
Alto
N
16
16
16
X
0.85
2.25
3.20
σ
0.058
0.123
0.134
C.V.
6.8%
5.5%
4.2%
TABLA 3
Precisión inter - Ensayo (Valores en ng/dl)
Muestra
Bajo
Normal
Alto
N
10
10
10
X
0.81
2.19
3.32
σ
0.068
0.145
0.176
C.V.
8.4%
6.6%
5.3%
Revisión: 3
* Medido en 10 experimentos en duplicado durante un período
de 10 días.
Date: 112210
Cat #: 175-300
B. Exactitud
El ensayo CLIA T3 AccuLite se comparó con un método de
inmunoensayo por enzimas de referencia. Se utilizaron
muestras biológicas tomadas de poblaciones hipotiroideas,
eutiroideas e hipertiroideas. (Los valores se ubicaron en un
rango de 0.010 ng/ml –7.30ng/ml). El número total de estas
muestras fue de 110. La ecuación de regresión de mínimos
cuadrados y el coeficiente de correlación se calcularon para el
CLIA T3 Acculite en comparación con el método de referencia.
Los datos obtenidos son descritos en la Tabla 4.
TABLA 4
Media (X)
Este Método
Referencia
1.43
1.48
Análisis de regresión de
Mínimos cuadrados
y=0.062+0.957 (x)
Correlación
Instrumentos y aplicaciones
0.976
Solamente cantidades mínimas de sesgos entre este método y
el método de referencia son indicados por la proximidad de los
valores promedios. La ecuación de regresión mínimos
cuadrados y el coeficiente de correlación indican excelente
acuerdo con el método.
C. Especificidad
La reactividad cruzada del anticuerpo de Triyodotironina a
sustancias seleccionadas fue evaluada por la adición de la
sustancia de interferencia a una matriz sérica a distintas
concentraciones. La reacción cruzada fue calculada derivando
un radio entre la dosis de la sustancia que interfiere a la dosis
de Triyodotironina necesaria para desplazar la misma cantidad
del trazador.
Los productos de inmunoensayo de Monobind están diseñados
para que funcionen en ambientes de laboratorios manuales y
automatizados. AccuBind y Acculite son compatibles cualquier
instrumentación de extremo abierto incluyendo analizadores
químicos, lectores de microplacas y lavadores de microplacas.
Es posible que exista o no un desarrollo de aplicación para su
instrumento en particular, para estos casos, se recomienda
visitar la sección de instrumentos de nuestro sitio en la web o
comunicarse con techsupport@monobind.com
Monobind ofrece diversos instrumentos, incluyendo el lector de
placa Impulse 2, el luminómetro CLIA diseñado para ser
utilizado simultáneamente con nuestros productos y capaz de
una calibración de dos puntos. Visitar nuestro sitio en la web
para obtener mayor información.