EXTRACCIÓN DE RNA de Saccharomyces (modif. SCSIE) Mantener todo en hielo, usar guantes y material preparado especialmente para RNA (40‘ autoclave). En todos los pasos de fenolización emplear tubos con tapón de rosca de 2 ml. 1.- Inocular precultivos de las cepas toda la noche. 2.- Inocular 25 mL de medio fresco con estos precultivos a DO600= 0,18 y crecer hasta DO600 0,6. 3.- Centrifugar a 4ºC / 5 minutos / 3500rpm en falcon de 50 mL. 4.- Lavar con H2O de RNA. (unos 10mL) 5.- Congelar el pellet a -80ºC toda la noche (opcional). 6.- Se descongelan las muestras en hielo. 7.- Preparar tubos con tapón de rosca de 2 mL con perlas de vidrio (500 l). 8.- Resuspender las células en 500 L de LETS y 500 L de fenol-tris para RNA. 9.- Romper las células en el Fast-Prep o Mini Beadbeater, 6 x 30 segundos, con periodos intercalados de 30 segundos en hielo. 10.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm. 11.- Recoger el sobrenadante en nuevo tubo y extraer de nuevo con fenol-tris de RNA. Vórtex. 12.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm. 13.- Recoger el sobrenadante y extraer con fenol-cloroformo (5:1) de RNA. 14.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a 13000rpm. 15.- Repetir la extracción con fenol-cloroformo (5:1) dos veces más. 16.- Recoger el sobrenadante y extraer con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Vórtex. 17.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a 13000rpm. 18.- Recoger el sobrenadante y precipitar con 1 V de LiCl 5M, a –20ºC durante toda la noche. 19.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm. 20.- Lavar con EtOH al 70% (unos 500L). 21.- Dejar secar el pellet (en este punto yo no lo seco, recojo los restos de SN con una P20 después de dar un pulso de centrífuga). 22.- Resuspender en 500 L de H2O de RNA. 23.- Precipitar con 1/10 V de NaOAc 3M y 2 V de EtOH absoluto, a –80ºC durante 2-3 horas. 24.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm. 25.- Lavar con EtOH al 70%. 26.- Quitar los restos de SN con P20 y secar 5 minutos al aire o 1 min en speed-vac. 27.- Resuspender en un volumen de 50 a 100 L, dependiendo del tamaño del pellet. Cuantificar en el NanoDrop (Concentración máxima RNA en NanoDrop 3 g/l). LETS: LiCl 0,1M; EDTA 10mM; SDS 0,2%, Tris.HCl 10mM pH=7,4. Referencias 1. Perlas de vidrio, lavadas con ácido (100 g) 425-600 m SIGMA Ref G8772-100G 2. Fenol Saturado pH 4,5 (400 ml) AMRESCO Ref 0981-400ML Fenol equilibrado pH 4,5 (400 ml) USB (Isogen) Ref 77510-400ml 3. Fenol-Cloroformo 5:1 acid equilibrated pH 4,7 (400 ml) (es fenol-cloroformo-alcohol isoamílico 125:24:1) SIGMA Ref P1944-400ML 4. Cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 (100 ml) FLUKA (SIGMA) Ref 25666