Purificación de ADN plasmídico a escala mini preparativa. • • • • • • • • • • • • • Crecer las colonias de transformantes en medio rico selectivo Ej. LB-A, hasta D.O.= 2.0 aproximadamente (esto generalmente se hace toda la noche en agitación). Centrifugar a 6000 rpm 1.5 ml del cultivo durante 5 min. en un tubo colector, desechar el sobrenadante y repetir. Resuspender pellet mediante vortex “en seco”. Resuspender el precipitado en 100 µl de buffer 1 (liso-, RNasa 10µg/ml), garantizar total resuspención. Añadir 100 µl de sln II (NaOH +SDS) y mezclar por inversión, incubar a TA 5 min. Añadir 100 µl de sln III (KAc +HAc) y mezclar fuerte, incubar en hielo 10 min. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min. Recuperar el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el pellet. Añadir 1 Vol de isopropanol (aprox 300 µl). Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min. Desechar el sobrenadante. Centrifugación rápida al tubo y extracción con pipeta, secar el precipitado a TA. Resuspender en 20 µl de H2O destilada y aplicar 2 µl en gel de agarosa 1% (electroforesis) slnII: 0.4 g NaOH, H2O hasta 35 ml, diluir ,añadir 2.5 ml de SDS al 20%, completar con H2O a 50 ml. Purificación de ADN plasmídico a escala de masivo. • • • • • • • • • • • • • Crecer las colonias de transformantes en medio rico selectivo Ej. LBA, hasta D.O.= 2 aproximadamente (esto generalmente se hace toda la noche en agitación). Centrifugar a 8000 rpm el cultivo de 300 ml durante 10 min, desechar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 10 ml de buffer 1 (add RNasa 10µg/ml). Añadir 10 ml de sln II (NaOH +SDS) y mezclar, incubar a TA 10 min. Añadir 10 ml de sln III (KAc +HAc) y mezclar, incubar en hielo 15 min. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. Extraer el sobrenadante y filtrar en un tubo limpio, añadir 1 Vol de isopropanol y mezclar. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. Desechar el sobrenadante y secar exhaustivamente el pellet. Resuspender en 600 µl de TE 1X y añadir RNasa 10µg/ml, incubar a 37º C 1-2 h. Fenol/ Cloroformo (vol/vol), centrifugar a 12000 rpm 5´, extraer el sobrenadante y repetir 2X, o +. Precipitar con 2,5 vol de ETOH 100% y 1/10 vol NaAc. Incubar -20ºC 30´ a ∞. • • • Centrifugar 10000 rpm 12´. Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con ETOH 70%, añadiendo 500µl de ETOH 70% y centrifugar 10000 rpm 10´. Resuspender en 200 µl de H2O destilada o TE 1X. slnII: 0.4 g de NaOH, H2O hasta 35 ml, diluir, añadir 2.5 ml de SDS al 20%, completar con H2O a 50 ml. TE 1X: tris-HCl 10 mM pH 7.6 – EDTA 1 mM Fenol/cloroformo: ½ vol fenol saturado + ½ vol cloroformo, centrifugar a 12 000 rpm 10´, extraer la fase superior a un tubo limpio cuidadosamente sin tocar la interfase proteica. Precipitación de ADN: • 2.5 vol de ETOH 100% y 1/10 vol NaAc 3M. • Incubar -20ºC durante 30´a ∞. • Centrifugar 12000 rpm 12´(plasmidios) o 20´ (fragmentos o bandas de ADN). • Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con ETOH 70%, añadiendo 500 µl de ETOH 70% y centrifugar 12000 rpm 10´. • Resuspender en X µl de H2O destilada