Vol. final del ensayo = 0.00312 l

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO
PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA
ACETILCOLINESTERASA ERITROCITARIA E.C. 3.1.1.7. (AcChE)
Preparado por:
Patricia Quiroga
(Analista Instrumental)
Fecha:
03/2002
Revisado por:
Adriana Ridolfi
(Control de Calidad)
Fecha:
05/2002
Aprobado por:
Edda C. Villaamil Lepori
(Jefe del Laboratorio)
Fecha
06/2002
2002
A. SECCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
1.
Aplicación
1.1
Este método es aplicable a la determinación de acetilcolinesterasa (AcChe) en muestras
de sangre.
1.2
El límite de detección de este método es el resultante de considerar el  absorbancia del
equipo (en la mayoría de los casos es igual a 0,001 y corresponde a 287 UI/l)
1.3
El coeficiente de variación se considera aceptable cuando es menor o igual al 5%.
1.4
Mediante este método se puede determinar la actividad de la acetilcolinesterasa en un
rango de 287 a mayor de 11760 UI/l.
2.
Resumen del método
2.1
La AcChe hidroliza a la acetiltiocolina siendo los productos de hidrólisis acetato y tiocolina.
La tiocolina reacciona con el ácido 5,5-ditiobis-2 nitro benzoico (DTNB) formando el
compuesto
coloreado
2-nitro-5-mercaptobenzoato,
el
cual
puede
medirse
espectrofotométricamente a 405 nm.
2.2
La actividad de la enzima varía con la temperatura por lo cual se recomienda efectuar la
determinación a temperatura constante ± 2º C
2.3
Las temperaturas recomendadas: 25 ó 30º C.
3.
Precauciones de seguridad
3.1
Se requiere guantes, anteojos de protección y todas las medidas de precaución
adecuadas para el manipuleo de muestras biológicas.
3.2
Material adecuado para el descarte del material biológico.
3.3
Cada reactivo debe ser considerado como un peligro potencial a la salud y la exposición a
estos compuestos debe ser minimizada por buenas prácticas de laboratorio.
4.
Precauciones
4.1
Solución Tampón- cromógeno: ácido 5,5'-ditiobis-2 nitro benzoico (DTNB) : 0,26 mmol/l
Conservar en heladera y al abrigo de la luz. Estabilidad 1 mes aproximadamente.
4.2
Solución de yoduro de acetil tiocolina (sustrato) 156 mmol/l.
Mantener al abrigo de la luz y en heladera. En estas condiciones es estable durante 7 a
12 días.
4.3
Verificar que la celda de vidrio esté limpia y no presente rayaduras e imperfecciones.
4.4
Se recomienda efectuar determinaciones con muestras controles cada vez que los
reactivos son renovados.
4.5
Lavado del material de vidrio
Los frascos utilizados para el almacenamiento de las muestras pueden ser de vidrio
borosilicato o polietileno y deben ser lavados y enjuagados de la siguiente manera:
a)
b)
c)
d)
Se lava con solución de detergente especial (extrán alcalino Merck o similar) para
limpieza de material de vidrio.
Se enjuaga con abundante agua de grifo para remover los residuos de detergente.
Se enjuaga finalmente con agua destilada.
Se seca en estufa a 50 º C.
5.
Instrumental/materiales
5.1
Espectrofotómetro UV-Visible con celda portacubeta termostatizada.
5.2
Pehachímetro. Precisión : ± 0,1 unidad de pH.
5.3
Frascos de vidrio de 100 ml y 50 ml.
5.4
Probetas de 100 y 50 ml.
5.5
Pipetas graduadas de 50 y 0,2 ml.
5.6
Pipetas automáticas de 100 y 20 l
5.7
Frascos volumétricos de 50 y 100 ml.
6.
Reactivos
Nota: Se debe utilizar reactivos de grado analítico o superior y que cumplan con normas
internacionales de calidad (ACS, ISO).
Nota: Todos los reactivos se deben almacenar en recipientes adecuados, provistos de
etiquetas indicando el nombre del reactivo, fecha de preparación e iniciales del analista.
6.1
Solución de Na2HPO4 .12H2O 52 mmol/l.
Pesar 1,86 g de la droga sólida y llevar a 100 ml con agua destilada.
6.2
Solución de NaH2PO4 .2H2O 52 mmol/l.
Pesar 0,405 g de la droga sólida y llevar a 50 ml con agua destilada.
6.3
Solución Tampón fosfato: Na2HPO4 / NaH2PO4 : 52 mmol/l pH= 7,2
Colocar aproximadamente 65 ml de la solución de Na2HPO4 y 35 ml de la solución de
NaH2PO4 en un vaso de precipitado de 250 ml. Ajustar el pH a 7,2.
6.4
Solución Tampón- cromógeno: ácido 5,5-ditiobis-2 nitro benzoico (DTNB) : 0,26 mmol/l
Pesar 10,3 mg del DTNB y disolverlos en 100 ml de la solución tampón.
6.5
Solución de yoduro de acetil tiocolina (sustrato) (Sigma - Nº de catálogo A 5751) 156
mmol/l.
Pesar 90 mg de la droga sólida y disolverla en 2 ml de agua destilada.
7.
Calibración del equipo
7.1
Para el manejo del espectrofotómetro UV-visible, consúltese el manual de operación del
equipo.
7.2
Se enciende la computadora
7.3
Se enciende el espectrofotómetro UV-visible, el monitor y la impresora.
7.4
Se ingresa el nombre del analista.
7.5
Se introducen los siguientes datos:
a)
b)
c)
d)
Longitud de onda (): 405.0 nm.
Nombre del analito:acetilcolinesterasa.
Tipo de reacción: cinética.
Reporte de datos:delta absorbancia / minuto.
7.6
Se coloca la celda de vidrio con los reactivos excepto la solución de sustrato y se ajusta la
temperatura a 25 ó 30 º C. Esperar que la temperatura se estabilice.
7.7
Agregar la solución del sustrato. Agitar bien.
7.8
Se realizan las lecturas de absorbancia cada 30 segundos o por minuto.
8.
Muestra
8.1
Sangre entera heparinizada (5 ml). Otros anticoagulantes como citrato, fluoruro u oxalato
producen una leve inhibición de las enzimas.
8.2
Centrifugar la muestra de sangre a fin de separar el suero del paquete globular.
8.3
Lavar el paquete globular 3 veces con solución fisiológica, centrifugando cada vez la
suspensión y descartar los líquidos de lavado.
8.4
Tomar 100 l del paquete globular de la parte media del centrifugado, colocarlo en otro
tubo y agregarle 2,4 ml de agua destilada a fin de obtener una dilución 1/25.
8.5
Se produce en estas condiciones la hemólisis de los glóbulos rojos. Homogeinizar bien.
9.
Procedimiento de análisis
9.1
En la cubeta del espectrofotómetro mantenida a 25º ó 30º C colocar 3 ml de la solución
tampón fosfato - cromógeno y 20 l del hemolisado de la muestra
9.2
Se agita y se Incuba durante 3 minutos.
9.3
Si agregan 100 l de la Solución de yoduro de acetil tiocolina (sustrato) y se mezcla bien.
9.4
Leer la absorbancia inicial y cada 30 segundos durante 2 -3 minutos a 405 nm
Tampón fosfato -cromógeno
Hemolisado de la muestra
Incubar
Sustrato
Mezclar bien
Leer a 
3 ml
20 l
3-4 minutos
100 l
405 nm
10.
Análisis de datos
10.1
La actividad de la acetilcolinesterasa se expresa en UI/l según el siguiente cálculo:
UI/l = Abs/min. x106x vol. final del ensayo (l) x f de dil.
x paso óptico(cm) x vol. de muestra (l)
Vol. final del ensayo = 0.00312 l
Paso óptico = 1 cm
f. de dil. = factor de dilución
=coeficiente de extinción molar =13600 l /mol x cm
106 = por pasar micromoles a moles
UI/l = Abs/min x106x 0.00312 x f dil
13600x1 x 0.00002 (l)
UI/l = Abs/min x 11470x f dil.
10.2
Valores de Referencia (30 ºC): 7120 – 11760 U/l
B.
SECCIÓN DE CONTROL DE CALIDAD
1.
Control de la exactitud
Para comprobar la exactitud del análisis se puede usar una muestra de control externo de
la actividad de la esterásica y/o de control interno, (un pool de plasma o suero de
individuos sanos no expuestos a sustancias inhibidoras de las enzimas colinesterasas). Se
compara el resultado con su valor de referencia y límites de aceptación. Cuando el
resultado no se encuentre dentro del rango de los límites, se debe revisar el procedimiento
y repetir el análisis.
2.
Control de la precisión
En el caso del análisis de una serie de muestras, se debe realizar un duplicado en cada
lote de 6 muestras. La diferencia entre la muestra y el duplicado no debe ser mayor de 15
%.
3.
Cartas de control
Se debe mantener al día las cartas de control para las muestras duplicadas y el estándar
de control interno.
C.
REFERENCIAS
1.
Valores Referenciales para Población Clinicamente Sana en la Ciudad de Buenos Aires.
Meraldi de Díaz, N.; Nieto, R.A.; Bett, E.; Basco, J.; Megyes, E.; Roses, O. Rev ABA- vol
54-Nº1-2, 17. pág. 16-18, 1990.
2.
A new and rapid colorimetric determination of acetyicholinesterase activity. Ellman G.;
Courtney, K.D.; Valentino, A; Featherstone,R . Biochem Pharmacol., 7: 88,1961