LANASEVE Rige a partir de: 31/03/11 Código: IA-MBA-PT-021 Serotipificación de Salmonella spp. Versión 01 Página - 1 - de 5 Elaborado por: Encargado técnico de sección Revisado por: Analista Aprobado por: Jefe de Sección 1. Objetivo Identificar por medio de antisueros específicos las serovariedades de Salmonella spp 2. Alcance Aplica a las cepas de Salmonella aisladas en la sección de Microbiología de Alimentos y Microbiología Médica Veterinaria. 3. Responsabilidad y autoridad Jefe de Sección: velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. El Coordinador Técnico de Sección debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Analista: La identificación del serogrupo de Salmonella spp. 4. Definiciones No aplica 5. Abreviaturas y/o siglas Spp: especies 6. Referencias y/o Bibliografía IA-MBA-PE-021-RE-001 Muestras positivas: Salmonella spp. IA-MBA-PE-021-RE-002 Prueba de Serotipificación de Salmonella spp Instructivo Antisueros Salmonella DENKA SEIKEN Fórmulas antigénicas de serovariedades de Salmonella según esquema Kauffmann-White Manual de Procedimientos para Serotipificación de Salmonella. Organización Mundial de la Salud 2001 7. Descripción del procedimiento 7.1 Fundamento teórico El método que se utiliza es el de aglutinación en placas de microtitulo, se basa en una reacción antígeno –anticuerpo. En una prueba positiva se observa aglutinación macroscópica. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 12/01/10 Código: IA-MBA-PE-021 Serotipificación de Salmonella spp. Versión 03 Página - 2 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada Control de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.2 Materiales, Equipo, Medios y reactivos 7.2.1 Materiales Asa bacteriológica Palillos de madera estériles Placas de microtitulo esteriles de fondo plano o en u, con tapa Portaobjetos Puntas de micropipeta esteriles 7.2.2 Equipo Calentador Centrifuga Incubadora a 35 °C +/- 1°C Micropipetas Agitador mecánico (vortex) Baño María (49 °C± 1°C) Lámpara de luz blanca Pipeteador eléctrico 7.2.3 Medios y reactivos Agar base sangre Caldo trypticasa-triptosa Medio GARD Solución salina 2% Solución salina 0.85 % Solución salina formalinizada 1% Set de inducción Set de antisueros 1 Set de antisueros 2 Set de antisueros 3 Set de antisueros 4 Set de antisueros 5 Set de antisueros 6 Set de antisueros 7 7.3 Procedimiento Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 12/01/10 Código: IA-MBA-PE-021 Serotipificación de Salmonella spp. Versión 03 Página - 3 - de 5 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada Control de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.3.1 Rayar placa de agar base sangre con la cepa de Salmonella spp. a serotipificar e incubar a 35 °C ± 2°C por 24 horas. 7.3.2 Agregar a un tubo 0.5 ml de solución salina 2% y preparar suspensión de la cepa siguiendo instrucciones del fabricante del antisuero (suspensión de antígeno). 7.4 Prueba somática en lámina 7.4.1 Colocar en un portaobjetos 30 µl de solución salina 0.85% y colocar 10 µl de suspensión de antígeno, con un aplicador estéril homogenizar y realizar movimiento circular al portaobjeto por un minuto 7.4.2 Si se observa formación de grumos, la cepa es rugosa y puede dar falsos positivos. Subcultive en AS o ATS, hasta obtener colonias lisas y repita el procedimiento. Si no hay formación de grumos indica que la cepa es lisa y se puede continuar con la prueba en el punto 9.3.3 7.4.3 Colocar una gota de antisuero polivalente Grupo O y 10 µl de suspensión de antígeno, homogenizar con un aplicador estéril realizar movimiento circular al portaobjeto por un minuto 7.4.4 Si se observa la formación de grumos la prueba es positiva para el antisuero polivalente Grupo O, seguir con el punto 9.3.6 7.4.5 Si no se observan grumos la prueba es negativa para el antisuero polivalente Grupo O y se debe probar con el antisuero polivalente Grupo O1 7.4.6 Probar con los siguiente 8 antisueros de la misma forma que en el punto 9.3.3 (utilizar set n°1) O2 O4 O7 GRUPO O O8 O9 O9,46 O3,10 O1,3,19 7.4.7 Si la prueba es positiva para el antisuero polivalente Grupo O1, probar con los siguientes 7 antisueros, de la misma forma que en el punto 9.3.3 (utilizar set n°1) GRUPO O1 O11 O13 O6,14 O16 O18 O21 O35 7.4.8 Esta prueba define el grupo somático que pertenece la cepa. Anotar resultados en formulario IAMBA-PE-021-RE-002 Prueba de Serotipificación de Salmonella spp. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección 7.4.9 LANASEVE Rige a partir de: 12/01/10 Código: IA-MBA-PE-021 Serotipificación de Salmonella spp. Versión 03 Página - 4 - de 5 Revisado por: Encargada Control de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Si no hay aglutinación con los antisueros polivalentes O y O1 repita los pasos 9.3.3 y 9.3.4 con antisuero Vi. Si la reacción es negativa puede que la cepa no sea Salmonella o que pertenezca a un serogrupo que no esté incluido en los antisueros polivalentes O y O 1 usados en la prueba. Si la reacción es positiva con el Vi seguir los siguientes pasos: En un tubo colocar 0.2 ml de la suspensión de la cepa para grupo y adicionarle 2 ml de solución salina fisiológica y calentar a 121°C por 15 minutos o a 100°C por 1 hora. Luego centrifugar el tubo a 900 gravedades por 20 minutos y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 0.2 ml de solución salina fisiológica. Repita los pasos 9.3.3 y 9.3.4.Si la prueba es positiva, la cepa puede ser S. Typhi, S. Paratyphi C o S. Dublin. 7.5 Prueba flagelar 7.5.1 Inocular un tubo de caldo trypticasa-triptosa de 5 ml con la cepa rayada en el agar base sangre e incubar a 35 °C ± 2°C por 24 horas. Separar 0.5 ml en un tubo estéril y Guardar a 4 °C por si es necesario hacer inducción de fase. 7.5.2 A los 4,5 ml de caldo trypticasa triptosa restantes agregar 4,5 ml de solución salina formalinizada 1% , dejar a temperatura ambiente de 1 a 24 horas (suspensión antígeno H) 7.5.3 Colocar en un pocillo de una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y agregar 50 µl de solución salina 0,85 % (control negativo) 7.5.4 Colocar en pocillos individuales de una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y agregar 30 µl de cada antisuero más 20 µl de solución salina 0.85 % (set 2, set 3, set 5, set 6). Se debe probar los antisuero flagelares de la fase 1 de acuerdo grupo sómatico obtenido; estos antígenos de fase 1 corresponden a la tercera columna del esquema de Kauffmann-White. Registrar en IA-MBA-PE-021-RE-002. 7.5.5 Incubar a 49 °C± 1°C por 1 hora. 7.5.6 Revisar aglutinación en placa, para esto utilizar lámpara luz blanca. La visualización de pequeños grumos indica una prueba de positiva. Anotar resultados en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002. 7.5.7 En el pocillo de control negativo no debe observarse ninguna aglutinación; si la hay indica que la cepa es rugosa y se invalida la prueba. Si no hay aglutinación se puede continuar con el punto 9.4.8. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 12/01/10 Código: IA-MBA-PE-021 Serotipificación de Salmonella spp. Versión 03 Página - 5 - de 5 Revisado por: Encargada Control de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.5.8 De acuerdo al antígeno de fase 1 comprobado se delimita un grupo de posibles cepas ; a continuación se deben determinar los antígenos de fase 2 , estos corresponden a la cuarta columna del esquema de Kauffmann-White. 7.5.9 Colocar en una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y agregar 30 µl de cada antisuero de fase 2 más 20 µl de solución salina 0.85 %, que corresponden a la cuarta columna del esquema Kauffmann-White. Registrar en IA-MBA-PE-021-RE-002 Antígenos Fase 2 H-1 H-2 H-5 H-6 H-7 H-Z6 H -en H-x H-w H-Z15 7.5.10 Utilizar lámpara para revisar aglutinación. Si se observan pequeños grumos (prueba positiva), reportar en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002. 7.5.11 Si no se observan grumos (prueba negativa) realizar inducción de fase. 7.6 Inducción de fase 7.6.1 Fundir tubos de medio GARD y dejar enfriar a 50°C aproximadamente. 7.6.2 Agregar 200 µl de antisuero de inducción correspondiente al antígeno de fase 1 determinado, agitar y verter en placa de petri (5cm diámetro X 1,5 cm alto) 7.6.3 Dejar que se solidifique, rotular placa y secar por aproximadamente 20 min en cámara de flujo laminar. 7.6.4 Inocular, de forma superficial, una asada del caldo tripticasa-triptosa para inducción de fase del punto 9.4.1 en el centro de la placa. La superficie del medio no debe de estar muy húmeda, ni tampoco reseca. 7.6.5 Incubar en cámara húmeda a 35 °C ± 2°C por 18 a 24 horas o hasta observar migración del crecimiento ( 1 a 3 días ) en la superficie de la placa a partir del inóculo inicial. 7.6.6 Del crecimiento bacteriano de la periferia de la placa inocular un tubo de caldo trypticasa-triptosa de 5 ml e incubar a 35 °C ± 2°C por 24 horas. 7.6.7 Realizar de nuevo la prueba flagelar de antígenos de fase 2. 7.6.8 Anotar resultados en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002 y revisar el esquema Kauffmann-White para determinar el serotipo de Salmonella analizada. 8 Anexos No aplica Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada