Introducción Clasificación de inhibidores Importancia en la salud pública Método de detección de inhibidores Descripción de los métodos microbiológicos (Galesloot y Delvotest P y P-multi) ¿Qué son? Son moléculas que bloquean o producen un enlentecimiento en el crecimiento bacteriano. Sustancias que en la leche tienen efecto bacteriostático o bactericida. Reglamento Bromatólogico Nacional (Dec. 315/994) Deseables o no? Genera problemas a diferentes sectores de la sociedad: PRODUCTOR: Pago por calidad INDUSTRIA: Calidad de la materia prima y efectos en los productos a elaborar (productos fermentados) CONSUMIDOR: Salud pública TIPOS DE INHIBIDORES: 1. Naturales 2. Químicos 3. Bacteriófagos 4. Antibióticos Artificiales: sustancias bacteriostáticas o bactericidas (inhibidoras del crecimiento bacteriano), cuya presencia en leche no es ni natural ni deseada INHBIDORES NATURALES Sustancias antibacterianas presentes en leche cruda Clasificación: • Inhibición específica: • Inmunoglobulinas • Aglutininas • Inhibición inespecífica: • Lactoperoxidasa • Lizozima • Lactoferrina INHIBIDORES QUÍMICOS Presentes en leche debido a prácticas defectuosas (lavado maquina de ordeñe, concentraciones no adecuadas, etc) Detergentes e Higienizantes Desinfectantes (clorados, yodados) BACTERIÓFAGOS Son virus de las bacterias Provocan lisis bacteriana Están ligados a la falta de higiene y mal manejo de las tecnologías ANTIBIÓTICOS Se utilizan para combatir enfermedades causadas por microorganismos, por ej: mastitis Clasificación: • Familia Química (ß-lactámicos, Tetracilcinas, Aminoglucósidos) • Efecto- bacteriostático y bactericida • Espectro de actividad Macrólidos, Problemas que plantean los residuos de antibióticos en leche Importancia desde el punto de vista tecnológico: La penicilina pierde solamente un 8% de su actividad luego de la pasteurización. Un tratamiento térmico más exigente (90°C por 30 minutos), destruye el 20% de la actividad de la penicilina y la esterilización un 50%. ANTIBIÓTICOS La cantidad de antibiótico que llega a la glándula mamaria depende de: • Principio activo y vehículo (oleosos o acuoso) • Dosis y vía de administración (determina el % de antibiótico que se elimina por leche) • Tiempo transcurrido entre el fin del tratamiento y el ordeño (tiempo de espera) 1962, Food and Drug Administration (FDA) de EEUU Fines de la década del 60, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otros organismos internacionales (FAO) establecen normas Antibacterianos “residuos”, “concentraciones residuales” o “inhibidores” Para cada sustancia se fija un límite máximo de residuo (LMR) o “niveles de seguridad” o “tolerancia” para la protección hacia el consumidor. Salud pública • Alergias • Resistencia Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la elaboración de queso y yogur Ganadero (sanciones) Salud pública • Alergias • Resistencia Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la elaboración de queso y yogur Ganadero (sanciones) Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados): Demora en la acidificación Demora en la coagulación Coagulación deficiente Disminución en la retención de agua Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados): Desarrollo de microorganismos indeseables Alteración de las características normales del producto Interferencia en la formación de aroma en manteca fermentada Microbiológicos • Prueba de fermentación (coagulación) • GALESLOOT (Disco de filtro) • DELVOTEST (P y P multi) Enzimáticos • Penzime III • SNAP Ensayos de sustitución y competencia (receptores) • CHARM I y II (14C y tritio, H3) • Parallux (sust. fluorescentes) Métodos microbiológicos • Prueba de la coagulación • GALESLOOT (Disco de filtro) • DELVOTEST (P y P multi) Principio Verificar la capacidad de fermentación de un cultivo de Streptococcus termophilus (yogur) en la leche a controlar. Si un inóculo del cultivo falla en producir la acidificación y coagulación, la prueba se considera positiva. • Prueba sencilla • Dificultades para su estandarización • No está considerada en las ordenanzas internacionales Principio: Sustancias inhibidoras (leche) difunden por el medio impidiendo el desarrollo de una cepa bacteriana, verificándose una zona clara alrededor del disco (halo) (Federación Internacional de lechería, FIL, 1991) Metodología: Sembrar 1ml de un cultivo del m.o Bacillus stearotermophilus var. calidolactis Agregar el medio de cultivo TSA, (previamente fundido y enfriado) Identificar Tomar los discos con pinza estéril (discos y pinza), impregnarlos con la leche problema homogeneizada Depositarlos sobre el medio (solidificado), leve presión Invertir la caja e incubar a 55º durante 2 ½hs. Metodología: Control negativo: Colocar disco con leche normal (sin antibiótico) Control positivo: Colocar disco leche con antibiótico (penicilina 0.005 UI) 1. 2. 3. 4. Lectura: Positivo: Zona sin crecimiento microbiano alrededor del disco (verificar con el disco control) Las muestras que presenten halos de inhibición de igual diámetro o mayor que el del disco control se consideran positivas Negativo: Crecimiento homogéneo alrededor del disco Principio: Se agrega la leche (con sust. nutritivas) a un gel de agar que contiene Bacillus Stearotermophilus var. calidolactis Incubación Observa el cambio de coloración del medio Metodología: Cortar las ampollas a utilizar Identificar Perforar el papel de aluminio con el extremo romo de la jeringa Agregar 0,1mL de la muestra con la jeringa con puntero estéril Llevar a baño de agua (64ºC durante 3hs). Realizar la lectura Metodología: Control negativo: Leche en polvo descremada reconstituida, esterilizada en autoclave Control positivo: Preparar un control con penicilina concentración 0.006UI/ml Lectura: Negativo: Amarillo (ausencia de sust inhibidoras), hubo acidificación del medio por crecimiento microbiano Positivo: Púrpura, presencia de sust. inhibidoras (no hubo crecimiento microbiano) Dos presentaciones Ampollas Placas ANTIBIÓTICO Concentración mínima detectable, (Color púrpura) Penicilina 0.004 (UI/ml) Cloxacilina 0.025 (mcg/ml) Ampicilina 0.003 (mcg/ml) Tetraciclina 0.20 (mcg/ml) Oxitetraciclina 0.30 (mcg/ml) Métodos Enzimáticos • Penzyme III • SNAP Principio Método enzimático y colorimétrico Precisa poca infraestructura Rápido (20 minutos) Detecta exclusivamente antibióticos del grupo ß-lactámicos (Penicilina, Ampicilina) Enzima (DD-carboxipeptidasa), efecto residual será menor cuanto mayor cantidad de antibiótico tenga la muestra Principio Principio • Inmunoensayo diseñado para detectar la presencia de diferentes antibióticos • Si el atb esta presente en la muestra se unirá a los anticuerpos de la prueba • Espectro de detección: Betalactamicos Tetraciclinas Gentamicinas Sulfamentazina Metodología • Cargar la muestra de leche (450µl ± 50µl) • Agregue al tubo y mezcle • Incube el tubo y el SNAP a 45ºC, tiempo según lo que se quiera detectar. Betalactamicos (5 min) Tetraciclinas (5 min) Gentamicinas (2 min) Sulfamentazina (2 min) Metodología Metodología • Adicione la muestra en la celda • Cuando la muestra alcance el círculo de activación y el color comience a desaparecer presione el activador • Incube el SNAP para: Betalactamicos (4 min) Tetraciclinas (4min) Gentamicinas (7 min) Sulfamentazina (7 min) Resultados Negativo: El circulo de la muestra es mas oscuro o igual que el Control RECEPTOR SE UNE A LA BANDA (porque no hay atb) Control Control - Resultados Positivo: El circulo de la muestra es mas claro que el Control RECEPTOR (sustrato) SE UNA AL ANTIBIOTICO Control + Resultados Resultados Resultados Sensibilidad Antibiótico ppb Penicilina Ampicilina Amoxicilina Cloxacilina Ceftiofur Cephapirina 3 6 6 30 6 2 Ventajas • Fácil de usar (3 pasos, lectura clara) • Rápido (resultado en menos de 10 minutos) • No necesita mezclar reactivos • Mínima capacitación requerida • Confiable: sensitivo, no hay riesgo de contaminación • Control incorporado en cada prueba Ensayos de (receptores) sustitución y competencia • CHARM I y II (14C y tritio, H3) • Parallux (sust. fluorecentes) Principio Utiliza la especificidad de los sitios de fijación de cada antibiótico (atb) para unirse a ciertas proteínas. El atb “problema” competirá con un atb “marcado” por el sitio de fijación Los marcadores en general son enzimas, que frente al sustrato adecuado, producen desarrollo de color. (visualmente o con espectrofotómetro) CHARM (I y II) los marcadores son Carbono 14 (14C) o Tritio (H3) Ventaja: Rapidez con que se realiza (10 a 15 minutos) Desventaja: Espectro reducido de detección. (CHARM I). Solo grupo de ß-lactamicos (Penicilina, Ceftiofur, Cloxacilina, Amoxicilina, Ampicilina, Cephapirina) CHARM II (modificación del CHARM I): Mayor espectro de acción. Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l) GRUPO PEN AMP AMX CLX CEFT DHI OXI SULFA CHARM II 4.8 8 10 40 4.5 50 19 10 Adaptado y modificado de González, O. (2000) Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l)