Moduladores de la fermentación ruminal II (5/6)

Microorganismos ruminales nativos:
búsqueda de probióticos con
potencial aplicación productiva
Mag. Martín Fraga
Departamento de Microbiología,
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable
PARA
RECORDAR
Clasificación de los microorganismos
5 reinos (Whittaker, 1969)
3 dominios (Woese,
1970)
Monera
Protista
Hongos
Animales
Plantas
procariotas
eucariotas
Bacteria procariotas
Archaea
Eucarya
eucariotas
EN EL RUMEN
• Eucariotas
• Procariotas
– Arqueobacterias
– Bacterias
Condiciones
• Características de cultivo continuo
• “Gran fermentador estable”
– Ambiente reducido, anaerobio
– Temperatura
– pH
– Fase gaseosa compuesta de CO2, Metano y
Nitrógeno
¿Qué papel juega la microbiota nativa en
los rumiantes?
•Herbívoros (Pasturas y forrajes)
• No pueden degradar los enlaces β 1-4 de la
celulosa, componente mayoritario de la fibra
vegetal, mayor reservorio de C del planeta
• La microbiota simbionte es capaz de realizar la
fermentación de la fibra
•Importancia productiva
Carne
Leche
Derivados
Fuente de energía
Rumen
Fibra
Epitelio
ruminal
70
60
50
40
Bacterias
30
20
Ácidos
Acético
Propiónico
Butírico
10
Ácidos grasos
+
Biomasa microbiana
Abomaso
0
Ácidos acético, propiónico y
butírico representan el 95% del
total de AGV en el rumen
Pérdidas de energía y
carbono como Metano,
Dióxido de carbono e
Hidrógeno molecular
Proteína de buena calidad
Van Soest 1994
Ambientes ruminales
• En la Fase líquida… Fluido ruminal
Los microorganismos están libres nutriéndose de proteínas y
carbohidratos solubles
25 % de la Biomasa microbiana
Tasas de crecimiento rápido
Son los que fluyen desde el rumen hacia porciones
posteriores del tracto gastrointestinal
En
la Fase sólida… Material particulado
Los microorganismos están asociados o adheridos a
partículas alimenticias.
Más del 70% de la Biomasa microbiana
Pueden “permitirse” tasas de crecimiento más lento
Microorganismos adheridos a
partículas de alimentos.
Adheridos
al epitelio ruminal
Los microorganismos están en
contacto con el epitelio
5% de la biomasa bacteriana
Son anaerobios facultativos
En general la biota ruminal es
anaerobia estricta, esto es, no
usan y no tienen mecanismos de
detoxificación de especies
radicales del O2.
Microbiota bacteriana asociada a
la fibrólisis
Ruminococcus albus
Ruminococcus flavefaciens
Fibrobacter succinogenes
Butyrivibrio fibrisolvens
Eubacterium celulosolvens
Prevotella spp.
Pseudobutyrivibrio spp.
(Hungate 1950, Montomery et al. 1988, Stewart et al. 1988, Schoep 2004, Shinkai et al. 2010)
Microbiota ruminal: modulación
•Aumentar el rendimiento productivo
•Prevenir trastornos digestivos en rumiantes
•Aumentar la degradación de la fibra
•Aumentar la producción de AGV
•Disminuir la producción de metano y otros gases
•Controlar la concentración de lactato y el pH ruminal
(Calsamiglia et al. 2005)
Probióticos
• Cultivo vivo de microorganismos que al
administrarse en cantidades suficientes confieren
beneficios al huésped
• Características
-Permanencia
-Producción de antimicrobianos
-Ser seguros
-Nativos
(FAO/WHO 2001)
Desarrollo de una estrategia de
selección de probióticos ruminales para
modular la fermentación ruminal
Aislamiento de microorganismos
Selección de cepas
Crecimiento
Identidad
Campo Exp. Nº2,
Libertad. Facultad
de Veterinaria
Efecto antimicrobiano
Ensayos en fermentadores
in vitro
Ensayos in vivo
Ambiente ruminal (AGV ,NH3, pH)
Microbiota
Metano
Digestibiidad
Cinética de producción de
gas
AGV
Microbiota
Metano
Técnica de “Rolling Tube”
Alternativa al uso de placas para la determinación de mo
viables y el aislamiento de microorganismos anaerobios
Termostatizado
45 ºC
ARN ribosómico: clave para la
identificación de
microorganismos
21
Proteínas
16S ARNr
Subunidad
30S
Ribosoma
Subunidad
50S
5S ARNr
Escherichia coli
ARNr 16S
34 Proteínas
23S ARNr
17
Secuenciación del ADNr 16S de los
aislamientos
Extracción de ADN genómico
Amplificación del ADNr utilizando primers
universales
Secuenciación de aproximadamente 1500pb
Edición (BioEdit)
Comparación con las bases de datos del genebank
NCBI y RDP
Aislamiento, caracterización
e identificación de cepas
bacterianas nativas
Pseudobutyrivibrio
Pseudobutyrivibrio ruminis
Prevotella bryantii
Oribacterium
Butyrivibrio hungatei
Butyrivibrio fibrisolvens
Eubacterium cellulosolvens
Selenomas ruminantium
Succinivibrio dextrinosolvens
Butyrivibrio
Oribacterium sp.
Lachnospiraceae
•Todos organismos anaerobios y
asociados al rumen
Fraga et al. 2013
Efecto antimicrobiano
Cultivo “spot”
de la cepa
Anaeróbico
24-48 h,
39ºC
Agregado de
medio de cultivo
inoculado con E.
coli o S. bovis
Observación
de la
inhibición
24 h,
37ºC
E. coli
2%
Sin efecto
61%
S. bovis
26%
Ambos
indicadores
11%
Experimentos en fermentadores in vitro
39ºC,
96h
sustrato
+
saliva artificial
4ºC, 18h
Fluido
ruminal
fresco
Cepa a ensayar
(106 cél/mL)
•Cinética de producción
de gas
•pH
•AGV
•Análisis de
microbiota
•CH4
-Presión
-Producción de Metano
Cinética de fermentación con distintos
sustratos
Celulosa microcristalina
80
Volumen acumulado (mL/g)
90
3C20C
70
4C50C
60
4C55C
50
4C60C
40
3F21C
3F22C
30
4C62C
20
4C50c+4C62C
10
Control
0
0
20
40
60
80
80
3C20C
70
4C50C
60
4C55C
50
4C60C
40
3F21C
30
3F22C
20
4C62C
10
450C+4C62C
Control
0
0
100
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Xilano de avena
100
Volumen acumulado (mL/g)
Volumen acumulado (mL/g)
Paja de trigo
90
3C20C
80
4C50C
70
4C55C
60
4C60C
50
40
3F21C
30
3F22C
20
4C62C
10
450C+4C62C
0
Control
0
20
40
60
Tiempo (h)
80
100
Ajuste a modelos
matemáticos
Modelo logístico bicompartimental
Vol=
Vfr
2+4kdr( L−T )
1+e
+
Vfl
1+e2+4kdl( L−T )
Vfr: Volumen de gas producido en la fase rápida
Vfl: Volumen de gas producido en la fase lenta
Kdr, Kdl: tasas de fermentación
L: Fase Lag
Vt: Vfr+Vfl
Parámetros de fermentación
Vfr
(mL/g)
Kdr
(h-1)
Vfl (mL/g)
Kdl
(h-1)
L (h)
Vt (mL/g)
Control
34,17ab
1,48
16,49a
27,85b
0,020a
62,03b
3C20C
39,15a
0,18
15,10a
34,76b
0,022a
37,45b
4C50C
33,14ab
0,11
13,37a
31,90b
0,020a
65,04b
4C55C
30,28ab
0,13
13,17a
25,16b
0,017a
55,43b
4C60C
28,09b
0,09
8,83b
26,36b
0,015ab
54,45b
3F21C
31,58ab
0,07
9,94b
26,83b
0,011ab
58,41b
3F22C
32,02ab
0,10
12,49a
29,36b
0,011ab
61,38b
1,76
0,58
1,05
4,63
0,002
8,91
0,0211
0,0126
0,001
0,0002
0,0017
0,0098
ESM
P
AGV: Paja de trigo
Paja de trigo
C on cen tración de AG V totales (m M)
100
a
Acético
Butírico
Propiónico
Control
41,2ab
0,2c
13,9a
90 A/P
5,80ab 80 2,97bc
3C20
20C
C
44,1a
16,6a
15,1a
5,83ab
4C50
50C
C
44,3a
16,2a
15,0a
5,49bc
4C55
55C
C
30,6c
8,0b
9,2b
5,87ab
4C60
60C
C
32,6bc
11,9ab
9,6b
3F21
21C
C
43,9a
16,9a
14,7a
5,88ab 50 3,40ab
5,82ab 40 2,98bc
3F22
22C
C
41,8ab
13,3ab
12,0ab
5,88ab 30 3,49a
4C62
62C
C
35,9abc
11,6ab
12,1ab
4C50
50C+
C+4
4C62
62C
C
35,5abc
11,3ab
12,0ab
1,87
1,12
0,61
5,92a 20 2,99bc
5,37c
2,95bc
10
0,0004
<0,0001
<0,0001
ESM
P
a
a
Paja de trigo
pH
0,08
60
bc
2,94bc
3,33abc
0,09
0,0009 0 0,0011
C ontrol
4C 55C
3F22C
C on cen tración de AG V totales (m M)
70
2,92c
abc
100
a
90
a
a
abc
abc
abc
80
70
abc
abc
abc
bc
c
c
60
50
40
30
20
10
0
C ontrol
4C 55C
3F22C
3C 20C
4C 60C
4C 62C
3C 20C
4C 60C
4C 62C
4C 50C
3F21C
4C 50C +4C 62C
4C 50C
3F21C
4C 50C +4C 62C
abc
Metano
No se detectaron diferencias entre los distintos tratamientos ni en la
concentración de metano ni en la cantidad de metanogenas (RT-PCR)
Comunidad microbiana en los
fermentadores
Se amplificó la
región V1-V2
del ARN 16S y
se
realizó
pirosecuenciac
ión
(454
Roche)
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
16Control
17 18 344C63C
35 36 523F21C
53 54 704C50C
71 72 884C56C
89 90 106
107 108 1244C58C
125 126 142
143 144
4C79CA
4C55C
Cuatro cepas aumentaron la frecuencia de aparición de OTUs afiliados a
bacteroidetes
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
16Control
17 18 344C63C
35 36 523F21C
53 54 704C50C
71 72 884C56C
89 90 106
107 108 1244C58C
125 126 142
143 144
4C79CA
4C55C
Aislmiento e identificación:
Se conformó una colección de aislamientos nativos, anaerobios que se
afiliaron a distintas especies asociadas al ambiente ruminal.
In vitro:
•La adición de cepas bacterianas en cantidades de entre 100 y
1000 veces menos al del contenido ruminal provoca cambios en:
La cinética de fermentación disminuyendo el volumen total de
gas y la colonización de la fibra
Producción de ácidos grasos volátiles particularmente induciendo
la formación del ácido butírico
•No se afectó la producción de metano
•Se modificó la comunidad bacteriana
Administración in vivo
Muestreo
19 días de a dapatacióna la dieta
8 AM
Tratamiento cada 48h
• 1010 células de
P. ruminis 50C
x5
• 1010 células de P.
bryantii 3C5
x5
• Control
x5
8 PM
Dieta: fardo de alfalfa
ad libitum y maíz (1%
del peso metabólico)
•Borregos canulados
•Jaulas metabólicas
•Condiciones
controladas
AGV, pH, Microbiota
ruminal, NH3
Consumo
Digestibilidad
Evolución del pH, AGV, NH3
Ambiente ruminal:AGV
•No hubo diferencias en la concentración total de AGV
Ambiente ruminal:AGV
•Tratados con Prevotella
tienen mayor concentración
que el control
•En ambos tratamientos la
concentración de Ác butírico
fue mayor que el control
•El grupo tratado con P.
ruminis 50C mostró
concentraciones de ác
propiónico inferiores al
control
Ambiente ruminal: pH
La administración de Prevotella bryantii 3C5 induce una
disminución de pH sin llegar a valores acodóticos
Ambiente ruminal: Amoniáco
control
60
50C
3C5
50
NH3(m
g/dL)
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
T (h)
Se registró una mayor concentración de NH3 en el grupo
tratado con Prevotella bryantii 3C5.
20
Microbiota ruminal
100%
90%
Se extrajo ADN total de
muestras de fluido ruminal de
todos lo animales y se
amplificó la región V1-V2 del
ARN
16S
y
se
realizó
pirosecuenciación
(454
Roche)
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1
Los animales tratados
con Prevotella bryantii
tuvieron una
composición similar a
la del control.
Los animales tratados
con Pseudobutyrivibrio
ruminis presentaron
una mayor abundancia
del género Prevotella.
P.
50C
5 ruminis
15
24
25
2
Control
8
7
13
17
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
4
18
19
P.Bryantii
20
3C5
26
2
7
8
Control
13
17
Síntesis
•La adminstración de bacterias nativas en
baja cantidad comparada con la carga
microbiana del rumen genera cambios en el
ambiente ruminal que pueden ser
detectados
•Estos cambios podrían ser explicados por
la modulación de la microbiota ruminal
•Se pudieron ver los mismos cambios tanto
in vitro como in vivo lo que refuerza el
modelo de screening in vitro
• Departamento de Microbiología,
IIBCE
Pablo Zunino
Sofía Fernández
MUCHAS GRACIAS