INVESTIGACIÓN SOBRE LA ETIOLOGIA, MANEJO Y CONTROL INTEGRADO DE HONGOS FITOPATÓGENOS DEL SUELO QUE LIMITAN LA PRODUCCIÓN DE MELÓN EN COLIMA INTRODUCCIÓN LA MARCHITEZ DEL MELóN (CUCUMIS MELO L.) FUE DESCRITA POR PRIMERA VEZ EN AMéRICA DEL NORTE POR LEACH Y CURRENCE EN 1938, IDENTIFICáNDOSE A FUSARIUM OXYSPORUM F. SP. MELONIS , COMO EL AGENTE CAUSAL DE ESTA ENFERMEDAD (SNYDER Y HANSSEN, 1940). EL PATóGENO SUELE PROVOCAR GRAVES EFECTOS SOBRE EL CULTIVO Y SI BIEN EXISTE RESISTENCIA VARIETAL BASADA EN DOS GENES, éSTA ES PARCIAL PUESTO QUE SE HA RECONOCIDO LA EXISTENCIA DE POR LO MENOS CUATRO RAZAS DEL PATóGENO (RISSER ET AL., 1976), LO QUE HA DETERMINADO LA CONSTANTE BúSQUEDA DE NUEVAS FUENTES DE RESISTENCIA COMO ESTRATEGIAS DE CONTROL. DENTRO DE ESTE CONTEXTO, EL CONOCIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS DE LAS POBLACIONES DEL PATóGENO, ES DECIR, EL CONOCIMIENTO DE SU DIVERSIDAD GENéTICA Y FENOTíPICA, Y SUS CAMBIOS EN EL TIEMPO Y ESPACIO, SON ELEMENTOS DE RECONOCIDA IMPORTANCIA PARA UN MANEJO EFICIENTE DE LA ENFERMEDAD. ANTECEDENTES COLIMA ES UNO DE LOS PRINCIPALES PRODUCTORES DE MELON CON 50 TON/HA, EN LOS QUE RECIENTEMENTE SE HA VISTO AFECTADA SU PRODUCCIóN DEBIDO A PROBLEMAS DEL SUELO OCASIONADOS POR EL COMPLEJO DE FUSARIUM OXYSPORUM. LA NECEDIDAD DE NUEVAS TECNICAS DE CULTIVO MAS AMIGABLES CON ELMEDIO AMBIENTE Y LA POSIBILIDAD DE INCREMENTAR LA COMPETITIVIDAD EN LA EXPORTACIóN DEL MELóN, MEDIANTE LA PALICACIóN DE INGERTOS Y EL CONTROL Y MANEJO DE ENFERMEDADES RADICULARES MEDIANTE LA APLICACION DE CONTROLADORES BIOLóGICOS REPRESENTA UN IMPORTANTE RETO PARA POSICIONAR A COLIMA COMO LIDER EN LA PRODUCCION Y EXPORTACION DE MELON EN MéXICO. PROBLEMÁTICA UNA PRIMERA CONDICIóN EN ESTUDIOS EPIDEMIOLóGICOS O DE POBLACIONES, ES LA CORRECTA IDENTIFICACIóN DEL PATóGENO AISLADO. PARA IDENTIFICAR ESPECIES DEL GéNERO FUSARIUM SE HAN PROPUESTO DIFERENTES SISTEMAS TAXONóMICOS, LOS CUALES SE BASAN PRINCIPALMENTE EN CARACTERES MORFOLóGICOS, TALES COMO TAMAñO Y FORMA DE MACROCONIDIAS; TAMAñO, PRESENCIA O AUSENCIA DE MICROCONIDIAS; FORMACIóN DE CLAMIDOSPORAS Y ESTRUCTURA DE CONIDIóFOROS ( WINDELS, 1992). SIN EMBARGO, MUCHAS VECES, ESPECIES MUY RELACIONADAS ENTRE Sí DIFIEREN EN UN SOLO CARáCTER, FORMA DE LA CONIDIA O CONIDIóFORO, POR EJEMPLO, LO QUE PUEDE INDUCIR A UNA MALA IDENTIFICACIóN. POR OTRA PARTE, LA APLICACIóN DE ESTA TéCNICA TRADICIONAL ES LABORIOSA Y REQUIERE DE GRAN CANTIDAD DE MATERIAL, LO QUE DIFICULTA LA IDENTIFICACIóN DE UN GRAN NúMERO DE MUESTRAS A LA VEZ QUE REQUIERE DE GRAN EXPERIENCIA TAXONóMICA PARA OBTENER RESULTADOS CORRECTOS. ESTA LABOR PODRíA COMPLICARSE DEBIDO A LA ALTA VARIABILIDAD MORFOLóGICA QUE PRESENTAN AISLAMIENTOS DE FUSARIUM EN CULTIVOS DE LABORATORIO. OBJETIVOS 1. AISLAR UN COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS QUE AFECTEN EL CULTIVO DE MELÓN EN LOS MUNICIPIOS DE COLIMA, IXTLAHUACÁN, TECOMÁN, ARMERÍA, COMALA Y VILLA DE ÁLVAREZ. 2. IDENTIFICAR TAXONOMÍA Y DIVERSIDAD MOLECULAR DEL COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS. 3. EVALUAR VARIEDADES DE MELÓN RESISTENTES Y SUSCEPTIBLES AL COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS. 4. UTILIZAR INJERTOS Y CONTROL BIOLÓGICO COMO ALTERNATIVAS DE RESISTENCIA AL COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS. 5. TRANSFERIR LA TECNOLOGÍA A LOS PRODUCTORES DE MELÓN EN COLIMA. JUSTIFICACIÓN LAS TéCNICAS MOLECULARES, PRINCIPALMENTE AQUELLAS BASADAS EN ANáLISIS DE DNA, CORRESPONDEN A METODOLOGíAS MáS RáPIDAS, PRECISAS, OBJETIVAS Y APLICABLES A UN GRAN NúMERO DE MUESTRAS. ESTE TIPO DE METODOLOGíAS PERMITE DIFERENCIAR GENOTIPOS Y DE ESTA FORMA ESTABLECER LA VARIABILIDAD GENéTICA EXISTENTE DENTRO DE UNA POBLACIóN. UNA METODOLOGíA DE ANáLISIS DE ADN DENOMINADA RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA, WILLIAMS ET AL., 1990) GENERA PATRONES DE BANDAS QUE CORRESPONDEN A FRAGMENTOS DE ADN, ALGUNOS DE LOS CUALES SON COMPARTIDOS POR UN GRUPO DE GENOTIPOS, ESTANDO AUSENTES EN OTROS. ESTE TIPO DE POLIMORFISMO GENéTICO PERMITE DESARROLLAR MARCADORES MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIóN DE INDIVIDUOS, REALIZAR MAPEO GENóMICO Y REALIZAR ESTUDIOS DE GENéTICA DE POBLACIONES (EDEL ET AL., 1995; MACDONALD, 1997). EN EL CASO DEL GéNERO FUSARIUM SE HA UTILIZADO LA METODOLOGíA DE RAPD PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE POBLACIONES DE DIVERSAS FORMAS ESPECIALES. ESTA METODOLOGíA HA PERMITIDO ENCONTRAR MARCADORES MOLECULARES PARA IDENTIFICAR ESPECIES TALES COMO F. AVENACEUM, F. CULMORUM, F. GRAMINEARUM (SCHILLING ET AL., 1996), F. POAE (PARRY Y NICHOLSON, 1996) Y AISLAMIENTOS PERTENECIENTES A LA RAZA 2 DE F. OXYSPORUM F. SP. DIANTHI (MANULIS ET AL., 1994). EL OBJETIVO ESPECíFICO DE ESTE ESTUDIO SERA EVALUAR LA METODOLOGíA DE RAPD PARA LA IDENTIFICACIóN DE ESPECIES DE FUSARIUM PATóGENAS PARA MELóN (CUCUMIS MELO L.) Y COMPARAR SUS RESULTADOS CON LA METODOLOGíA TRADICIONALMENTE EMPLEADA, BASADA EN CARACTERES MORFOLóGICOS. ADICIONALMENTE A ESTO, SE EVALUARA LA DIVERSIDAD GENéTICA EXISTENTE EN UN GRUPO DE AISLAMIENTOS IDENTIFICADOS COMO F. OXYSPORUM F. SP. MELONIS MATERIALES Y MÉTODOS EL MATERIAL EXPERIMENTAL SERá COLECTADO EN LOS CULTIVOS COMERCIALES DE MELóN ESTABLECIDOS EN LOCALIDADES DE TECOMAN, IXTLAHUACAN. EL MATERIAL COLECTADO SERA A TEJIDO RADICULAR FINO, TEJIDO RADICULAR GRUESO Y TEJIDO DE VASOS CONDUCTORES (CUELLO, CORONA Y TALLO), CON SíNTOMAS DE INFECCIóN. AISLAMIENTO Y MANTENCIóN DEL PATóGENO. LOS PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA EL AISLAMIENTO DE FUSARIUM SP. SE REALIZARAN DE ACUERDO A LA METODOLOGíA DESARROLLADA Y UTILIZADA POR EL FUSARIUM RESEARCH CENTER DE LA UNIVERSIDAD DE PENNSYLVANIA (NELSON ET AL., 1983; BURGESS ET AL., 1994). EL TEJIDO RADICULAR FINO DE PLANTAS DE MELóN SERá ESTERILIZADO PARCIALMENTE CON HIPLOCLORITO DE NA AL 2%, MEDIANTE LAVADO CONTINUO EN AGUA CORRIENTE, ENJUAGADO EN AGUA ESTéRIL TRES VECES Y SECADO EN FLUJO LAMINAR DE AIRE ESTéRIL. EL TEJIDO RADICULAR MáS GRUESO Y EL MATERIAL PROVENIENTE DE CUELLO, CORONA Y TALLO FUE ESTERILIZADO SUPERFICIALMENTE EN UNA SOLUCIóN DE ETANOL POR 1 MIN, PARA POSTERIORMENTE SER TRATADO EN UNA SOLUCIóN DE HIPOCLORITO DE SODIO AL 5 %, ENJUAGADO 3 VECES EN AGUA ESTéRIL PARA SECAR POSTERIORMENTE EN FLUJO DE AIRE LAMINAR ESTéRIL. UNA VEZ DESINFECTADOS, PEQUEñOS TROZOS DE TEJIDO RADICULAR (CON O SIN CORTEX) Y SEGMENTOS DE TEJIDO CONDUCTOR OBTENIDO A NIVEL DE CUELLO Y TALLO, SERAN SEMBRADOS SOBRE MEDIO DE CULTIVO AGAR PAPA DEXTROSA (APD) E INCUBADOS A 25°C DURANTE 7 DíAS. DESDE CADA UNA DE LAS COLONIAS OBTENIDAS SE REALIZARON CULTIVOS MONOSPóRICOS. PARA ESTO, SE UTILIZó MEDIO DE CULTIVO AGAR AGUA AL 1,5%, ADICIONADOCON SULFATO DE ESTREPTOMICINA (0,5 G L-1), SOBRE EL CUAL SE COLOCARON 6 GOTAS DE AGUA ESTéRIL EN LAS QUE SE HA DISGREGADO Y HOMOGENEIZADO MICELIO DEL PATóGENO. DESPUéS DE UN PERíODO DE INCUBACIóN DE 24 H A 25°C, SE DETERMINó PRESENCIA DE CONIDIOS GERMINADOS BAJO LUPA ESTEREOSCóPICA (40X). MEDIANTE EL USO DE AGUJA HISTOLóGICA, UN CONIDIO FUE TRANSFERIDO A UN TUBO DE ENSAYO CONTENIENDO MEDIO DE CULTIVO AGAR CLAVEL Y GUARDADO EN REFRIGERADOR A 5°C HASTA SU UTILIZACIóN EN PRUEBAS DE PATOGENICIDAD E IDENTIFICACIóN. PARA ALMACENAMIENTOS PROLONGADOS, LOS AISLAMIENTOS SERAN GUARDADOS COMO SUSPENSIóN DE ESPORAS EN 20% DE GLICEROL A -20°C. IDENTIFICACIóN TAXONóMICA DE LOS AISLAMIENTOS DE FUSARIUM PARA LA IDENTIFICACIóN TAXONóMICA DE LOS AISLAMIENTOS SE EMPLEARA COMO BASE METODOLOGíAS Y CLAVES DE IDENTIFICACIóN ELABORADAS POR NELSON ET AL. (1983), LAS CUALES CONSIDERAN LA OBSERVACIóN DE CARACTERíSTICAS MICROSCóPICAS, MEDIANTE LA TéCNICA DE MICROCULTIVO EN CáMARA HúMEDA. EN CADA PLACA PETRI SE COLOCA UN DISCO DE PAPEL FILTRO, UNA VARILLA DE VIDRIO EN FORMA DE U Y UN PORTAOBJETO. UN TROZO DE AGAR CLAVEL SóLIDO DE 1 CM2 X 2 MM DE ESPESOR, LOS CUALES SE COLOCARAN EN EL CENTRO DEL PORTAOBJETO APOYADO EN LA VARILLA DE VIDRIO. SE INOCULARON LOS 4 LADOS DEL BLOQUE DE AGAR CLAVEL CON MATERIAL PROVENIENTE DE CULTIVO MONOSPóRICO DE CADA UNO DE LOS AISLAMIENTOS A IDENTIFICAR Y SE CUBRIó CON UN CUBRE OBJETO DE MAYOR TAMAñO QUE EL TROZO DE AGAR. SOBRE EL PAPEL FILTRO SE AGREGAAN 2 ML DE AGUA DESTILADA Y SE INCUBARON A 25°C. DIARIAMENTE SE REALIZARON OBSERVACIONES BAJO MICROSCOPIO CON EL OBJETO DE DETERMINAR PRESENCIA DE CADENAS DE MICROCONIDIOS, TIPO DE FIáLIDES Y PRESENCIA O AUSENCIA DE CLAMIDOSPORAS. PARA OBSERVAR CARACTERíSTICAS MORFOLóGICAS DE CADA COLONIA, DESDE CULTIVO MONOSPóRICO SE INOCULARON PLACAS CONTENIENDO PDA Y SE INCUBAN A 25°C. IDENTIFICACIóN DE F. OXYSPORUM F. SP. MELONIS. PARA DETERMINAR LA FORMA ESPECIAL DEL PATóGENO SE UTILIZó LA METODOLOGíA PROPUESTA POR JACOBSON Y GORDON (1988). PARA ESTO, SE INOCULóA UNA SUSPENSION DE CONIDIAS 1X10 6 EN LOS SIGUIENTES HOSPEDEROS: (CUCURBITA. MOSCHATA) (C. PEPO), SANDíA (C. LANNATUS), PEPINO (C. SATIVUS ) MELóN (C. MELO ). EL MATERIAL SE MANTIENE BAJO INVERNADERO EN CONDICIONES CONTROLADAS DE TEMPERATURA Y HUMEDAD RELATIVA (25°C Y 85% DE HR) Y SE OBSERVA LA PRESENCIA DE MARCHITES EN CADA CASO. EN LAS PLANTAS CON SINTOMAS SE REAISLARA EL PATOGENO PARA COMPROBAR LOS POSTULADOS DE KOCH. OBTENCIóN DEL DNA FUNGICO. CADA AISLAMIENTO SERA CULTIVADO POR 3 DíAS EN MEDIO LíQUIDO EN AGITACION A 200 RPM Y 23ºC. LOS CULTIVOS SE REALIZARON EN MATRACES ERLENMEYER DE 100 ML CONTENIENDO 40 ML DEL SIGUIENTE MEDIO DE CULTIVO: GLUCOSA 3%, KH2PO4 0,3%, MGSO4 0,03%, CASOAMINOáCIDOS 0,5%, EXTRACTO DE LEVADURA 0,1% Y EXTRACTO DE MALTA 0,1%. CADA MATRAZ SERA INOCULADO CON MICELIO Y ESPORAS DEL HONGO PREVIAMENTE CULTIVADO EN AGAR CLAVEL Y COLECTADOS CON UN ASA BACTERIOLóGICA. EL MICELIO OBTENIDO SE COLECTA POR FILTRACIóN, LSE LAVA CON AGUA EN NITROGENO LIQUIDO Y EL DNA GENóMICO SE EXTRAíDO UTILIZANDO EL MéTODO DESCRITO POR LEE Y TAYLOR (1990). LA CALIDAD DEL ADN OBTENIDO SERá ANALIZA ELECTROFORéTICAMENTE EN GELES DE AGAROSA AL 0,8% EN SB Y CUANTIFICADO ESPECTROFOTOMéTRICAMENTE A 260 NM (SAMBROOK ET AL., 1989). SE AMPLIFICARA LA REGION ITS DE CADA AISLAMIENTO, EL PRODUCTO DE AMPLIFICACION SERá LIGADO AL VECTOR PGEM-T Y CLONADO EN E. COLI. EL PLASMIDO PURIFICADO SERA SECUENCIADO Y CADA SECUENCIA SERá DEPOSITDA EN EL GENEBANK. CONDICIONES DE LAS REACCIONES DE RAPD. LOS INICIADORES SERáN ADQUIRIDOS EN LA EMPRESA OPERON TECHNOLOGIES INC. (ALAMEDA, CALIFORNIA, USA),SE PROBARAN LAS SERIE OPA Y OPB. LAS REACCIONES DE AMPLIFICACIóN (EN UN VOLUMEN DE 25 M L),CONSTARA DE 20 NG DE DNA Y 2 U DE TAQ DNAPOL. SE EMPLEARA UN TERMOCICLADOR TECHNE PROGRAMADO A 35 CICLOS DE 1 MIN A 94 OC, 1 MIN A 36 OC Y 2 MIN A 72 OC ANáLISIS DE LAS BANDAS POLIMóRFICAS. EL PERFIL DE BANDAS QUE GENERE CADA INICIADOR FUE ANALIZADO PARA CADA AISLAMIENTO MEDIANTE EL REGISTRO PARA PRESENCIA ("1") O AUSENCIA ("0") DE BANDAS DE DNA DE TAMAñO SIMILAR. EL CRITERIO UTILIZADO PARA IDENTIFICAR UNA BANDA COMO POLIMóRFICA FUE SU PRESENCIA O AUSENCIA EN FORMA CONSISTENTE EN DOS AMPLIFICACIONES INDEPENDIENTES. ESTOS RESULTADOS PERMITIRAN CONSTRUIR UNA MATRIZ BINARIA QUE COMBINE TODOS LOS POLIMORFISMOS DETECTADOS EN LOS AISLAMIENTOS EN ESTUDIO. ESTA MATRIZ SERá ANALIZADA UTILIZANDO EL SOFTWARE COMPUTACIONAL NTSYS 2.0 (ROHLF, 1996). PARA CADA PAR DE AISLAMIENTOS SE DETERMINó EL GRADO DE SIMILITUD UTILIZANDO EL COEFICIENTE DE SIMILITUD DE JACCARD, DICE O PARA LUEGO CONSTRUIR UN DENDROGRAMA MEDIANTE EL ALGORITMO UPGMA. IMPACTO AMBIENTAL MEDIANTE EL USO DE INJERTOS O CONTROL BIOLÓGICO SE ELIMINARÁ EL USO DE BROMURO DE METILO EN LOS CULTIVOS, EL CUAL ES ALTAMENTE TÓXICO PARA EL SER HUMANO, ADEMÁS DE FLORA Y FAUNA. TAMBIÉN SE DISMINUIRÁ EL USO DE PESTICIDAS O FUNGICIDAS QUE DAÑAN LA FLORA MICROBIANA DEL SUELO. IMPACTO ECONÓMICO LOS COSTOS POR EL USO DE BROMURO DE METILO SE ELIMINARÁN, Y SE DISMINUIRÁ EL COSTO DEL USO DE PESTICIDAS, AMBOS SE UTILIZAN EN LA ACTUALIDAD PARA COMBATIR LA PRESENCIA DE HONGOS FITOPATÓGENOS. IMPACTO SOCIAL MAYOR CONFIANZA Y SEGURIDAD DE LOS TRABAJADORES DE CAMPO POR LA AUSENCIA DE BROMURO DE METILO Y PESTICIDAS. VENTA DE MELÓN SIN RESIDUOS DE BROMURO O PESTICIDAS. IMPACTO TECNOLÓGICO DESARROLLAR METODOLOGÍA PARA AISLAR E IDENTIFICAR HONGOS FITOPATÓGENOS DEL MELÓN DE FORMA MOLECULAR TRANSFERIR TECNOLOGÍA EN EL USO DE INJERTOS Y CONTROL BIOLÓGICO EN EL CULTIVO DE MELÓN. BIBLIOGRAFÍA NELSON, P.E., T.A. TOUSSOUN, AND W.F.O. MARASAS. 1983. FUSARIUM SPECIES: AN ILLUSTRATION MANUAL FOR IDENTIFICATION. 193 P. UNIVERSITY PARK, PENNSYLVANIA STATE UNIVERSITY PRESS, PENNSYLVANIA, USA. PARRY, D.W., AND P. NICHOLSON. 1996. DEVELOPMENT OF A PCR ASSAY TO DETECT FUSARIUM POAE IN WHEAT. PLANT PATHOL. 45: 383391. PRASAD, M.M., A.K. ROY, K. ANJAN, AND A. KRISHNA. 1988. BIOCHEMICAL CHANGES IN MUSKMELON FRUITS BY FRUIT-ROT FUNGI. INDIAN PHYTOPATHOL. 41: 641-643. PUHALLA, J.E. 1985. CLASSIFICATION OF STRAINS OF FUSARIUM OXYSPORUM ON THE BASIS OF VEGETATIVE COMPATIBILITY. CAN. J. BOT. 63: 179-183. RISSER, G., Z. BANIHASHEMI, AND D.W. DAVIS. 1976. A PROPOSED NOMENCLATURE OF FUSARIUM OXYSPORUM F. SP. MELONIS RACES AND RESISTANCE GENES IN CUCUMIS MELO. 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