Revista Mexicana de Micología vol. 42: 1-7 2015 Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación de formas especiales de Fusarium oxysporum Classical molecular techniques for differentiation of special forms of Fusarium oxysporium 1 Iobana Alanis-Martínez, 2Carmen Medina-Mendoza, 1Nahum Marbán-Mendoza, 2Ernestina Valadez-Moctezuma Departamento de Parasitología Agrícola y Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, Estado de México 1 2 Resumen La caracterización y diferenciación de formas especiales de Fusarium oxysporum mediante análisis de polimorfismos genéticos es más apropiado que solo considerar caracteres morfológicos o fisiológicos. Actualmente se han desarrollado técnicas moleculares sofisticadas para estimar variación genética, diferenciar o identificar microorganismos, tales como las basadas en secuenciación de segunda generación, pero éstas aún tienen altos costos y no son accesibles para muchos laboratorios que requieren diagnosticar o diferenciar a un determinado fitopatógeno. En este trabajo se compararon tres técnicas moleculares clásicas: RAPD, MP-PCR y RAMPnr con la finalidad de diferenciar aislamientos de F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici y F. oxysporum f. sp coffeae. Estas técnicas detectaron polimorfismos entre las formas especiales de Fusarium e incluso entre los genotipos de F. o. f. sp. lycopersici. Los agrupamientos representados en los dendrogramas, indican que F. oxysporum es muy diverso y que las formas especiales analizadas son genéticamente diferentes. Estas técnicas proporcionan un procedimiento simple, rápido y de bajo costo para la caracterización y posterior identificación rutinaria de patógenos. Palabras clave: MP-PCR, RAMPnr, RAPD, patógeno, polimorfismo. Abstract The characterization and differentiation of special forms of Fusarium oxysporum by analysis of DNA polymorphisms are more appropriate than just considering morphological or physiological characteristics. Currently, they have developed sophisticated molecular techniques to estimate genetic variation, differentiate or identify microorganisms, such as those based on second-generation sequencing, but they still have high costs and are not accessible to many laboratories that require diagnose or differentiate a particular plant pathogen. In this paper, three classical molecular techniques were compared: RAPD, MP-PCR and RAMPnr in order to differentiate isolates of F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and F. oxysporum f. sp coffeae. These techniques detected polymorphisms between the special forms of Fusarium and even between genotypes of F. o f. sp. lycopersici. The groups represented in dendrograms indicate that F. oxysporum is very diverse and that special forms analyzed are genetically different. These techniques provide a simple, fast and inexpensive routine procedure for the characterization and subsequent pathogen’s identification Keywords: MP-PCR, RAMPnr, RAPD, pathogen, polymorphism. Recibido / Received: 27/02/ 2014 Aceptado / Accepted: 28/10/2015 Autor para correspondencia / Corresponding author: Ernestina Valadez-Moctezuma evaladez@correo.chapingo.mx 1 Alanis-Martínez et al. Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación... Introducción ORIGINAL Materiales y métodos Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr es un complejo de especies económicamente importante, porque causa daños a una amplia Aislamientos variedad de cultivos agrícolas (Baayen et al., 2000). Se han descrito Se emplearon cuatro aislamientos por duplicado de formas espe- más de 150 formas especiales que se caracterizan por presentar ciales de Fusarium oxysporum: dos cepas (f. sp. lycopersici y f. sp. propiedades fisiológicas que le otorgan la especialización patogé- radicis-lycopersici.) procedentes de la colección de hongos fitopa- nica a determinadas especies, géneros o grupos de plantas (Arbe- tógenos del Colegio de Postgraduados (Montecillos), Estado de láez, 2000; Baayen et al., 2000); por lo que se ha asumido que México. La f. sp. ciceris se aisló de plantas de garbanzo con sín- están altamente relacionadas y presentan morfología similar aún tomas de marchitez de la zona del Bajío y la f. sp. coffeae se aisló cuando pertenecen a diferentes grupos biológicos (Kistler, 1997). de plantas de café con corchosis en la raíz, procedentes del estado Los marcadores moleculares han sido eficientes en el estudio de Veracruz. Los hongos se cultivaron en medio PDA (150g de de la diversidad genética de fitopatógenos (Baysal, 2013) y en la papa, 10g de dextrosa, 18g de agar y 4 gotas de ácido láctico identificación de formas especiales (Baysal, 2009). Algunas técni- (25%, MERCK); se desarrollaron cultivos monósporicos, los cas utilizadas para determinar la diversidad genética del género cuales fueron cultivados en medio líquido Czapeck-Dox (30g de Fusarium son RAPD (Random Amplified Polymorphyc DNA), sacarosa, 2g NaNO3, 0.1g K 2HPO4, 0.5g MgS04 7H 2O, 0.5g RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Bentley, KCL, 0.01g FeSO4 7H 2O) para extracción de ADN. 1998), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) y actualmente la secuenciación de por- Extracción de ADN ciones o genes completos (Wulff et al., 2010; Geiser et al., 2004; Se utilizó el método reportado por Kelly et al. (1994). La calidad Kristensen et al., 2005). La técnica RAPD ha sido empleada para de la molécula se determinó mediante electroforesis en gel de el estudio de formas especiales, razas y aislamientos con diferen- agarosa 0.8% y se cuantificó mediante espectrofotometría. Por tes patotipos de Fusarium oxysporum (Kelly et al., 1998, Luna et cada forma especial se emplearon dos genotipos procedentes del al., 2004), ya que reduce el tiempo necesario para la caracteriza- mismo aislamiento, pero de conidio diferente: Fusarium oxys- ción y proveé información genética. La tecnica MP-PCR (Micro- porum f. sp. coffeae A, coffeae B, ciceris A, ciceris B, radicis- satellite Primed-PCR) y RAMPnr (non radioactive Random lyco A, radicis-lyco B, lycopersici A, lycopersici B y una planta Amplified Microsatellite Polymorphism) fueron utilizadas por de garbanzo como grupo comparativo. Valadez et al. (2005) como una opción para la detección de perfiles de ADN más abundantes e informativos, ofreciendo mayor RAPD estabilidad y cantidad de huellas. Actualmente existen técnicas Para el análisis de huellas aleatorias de ADN, se seleccionaron sofisticadas basadas en secuenciación de segunda generación para siete iniciadores de la serie C (05, 08, 09, 14, 16, 18 y 19) de la el estudio de la diversidad genética de Fusarium y de otros orga- Casa comercial Carl Roth GMBH. La reacción de PCR se llevó a nismos, pero éstas aún tienen altos costos. Es por ello que este cabo en un volumen final de 25 µL con 80 ng de DNA, 20 pmoles trabajo tuvo como objetivo utilizar técnicas moleculares clásicas de iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 µM de dNTPs, para diferenciar de forma rápida cuatro formas especiales de 1.5 mM de MgCl y 2U Taq ADN polimerasa. La amplificación Fusarium oxysporum: f. sp. ciceris, f. sp. radicis-lycopersici, f. sp. se llevó a cabo con las siguientes condiciones: 94 °C, 1min, 38 lycopersici y f. sp. coffeae, los cuales pertenecen a un género de ciclos [94 °C, 30 s; 35 °C, 30 s; 72 °C , 1.5 min] y 72 °C, 2.5 min hongos fitopatógenos que morfológicamente no es posible distin- de extensión final en un termociclador Perkin Elmer 480. 2 guir. El conocimiento de las diferencias entre este tipo de patógenos es importante para su adecuado control, además de que estas MP-PCR técnicas consumen poco tiempo, proporcionan resultados confia- Para esta técnica se emplearon cinco iniciadores complementa- bles y son de bajo costo. rios a microsatélite: [GGAT]4, [GACA]4, [GATA]4, [CT]8 y [CA]8 2 Revista Mexicana de Micología vol. 42: 1-7 2015 de Gibco-BRL. La mezcla de reacción de 25 µL contenía 50 ng lycopersici presentó micelio escaso a diferencia de las formas de ADN; 20 pg del iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 especiales restantes. µM dNTPs, 3 mM MgCl y 1.5 U Taq ADN polimerasa. Las 2 condiciones de termociclaje fueron las siguientes: 93 °C, 1 min; Análisis molecular 40 ciclos [93 °C, 2 s; 40 °C, 1 min para [GATA]4 y 48 °C 1 min para [GGAT]4, [GACA]4, [CT]8 y [CA]8); 72 °C, 20 s] y 72 °C RAPD por 6 min de extensión final. El ADN obtenido con la técnica empleada fue de buena calidad y de cantidad adecuada para el análisis molecular propuesto. RAMPnr Las huellas genómicas obtenidas con los distintos iniciadores Esta técnica consiste en la combinación de dos tipos de iniciado- RAPDs presentaron polimorfismos entre las formas especiales y res en cada reacción, uno para microsatélites y otro aleatorio, entre los genotipos de la f. sp. lycopersici (Figura 1). En el den- ambos sin marcaje (Valadez et al., 2005). Se utilizaron seis pares dograma se conformaron seis grupos con un coeficiente de simi- de iniciadores: [GACA]4+C05; [GACA]4+C19; [GATA]4+C05; litud de 0.7 (Figura 5). La técnica considera idénticos a los [GATA]4+C19; [CT]8+C05 y (CT)8+C19. El volumen final de genotipos de la f. sp. coffeae con una confiabilidad del 100% al reacción también fue de 25 µL y contenía 80 ng de ADN, 10 pg igual que a la f. sp. ciceris. Para en el caso de la f. sp. radicis- de cada iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 µM lycopersici, los dos aislamientos no se mantienen juntos como se dNTPs, 3 mM MgCl 2 y 1.5 U Taq ADN polimerasa. Los pro- esperaba; lo que sugiere contaminación en los aislamientos ini- ductos de amplificación para las tres técnicas utilizadas se sepa- ciales. El genotipo lycopersici A se relaciona con los genotipos raron en geles de agarosa Ultra PureTM de GIBCO BRL 1.2, 1.4 de la f. sp. radicis-lycopersici a una distancia aproximadamente y 2 % respectivamente, se tiñeron con bromuro de etidio 10 min de 0.57 y confiabilidad del 99.9%. El genotipo lycopersici B se y se documentaron con la cámara Kodak Digital Science 1D mantiene fuera del agrupamiento, relacionándose con las otras 2.0. formas especiales a una distancia de 0.05 y una confiabilidad del 98.4%, lo que indica que este genotipo presenta un nivel de Análisis estadístico asociación muy bajo. El garbanzo se mantiene fuera del agrupa- Las huellas de ADN obtenidas se codificaron en una matriz miento de Fusarium. El valor del coeficiente de correlación cofe- binaria, a partir de la cual se construyó una matriz de similitud nética fue de r = 0.98, lo que indica muy buen ajuste. con el programa NTSyS pc.2.0 y el coeficiente de similitud Dice. Para el análisis de conglomerados se utilizó el método del promedio aritmético de pares no ponderados (UPGMA). Se obtuvieron los valores de correlación cofenética y por último se utilizó el programa WinBoot para obtener los valores del Boostraping con 5000 replicaciones. En el análisis se incluyó al garbanzo con el fin de contrastar los agrupamientos. Resultados Características morfológicas Las formas especiales de F. oxysporum cultivadas en medio Figura 1. Huellas de ADN de F. oxysporum f. sp. cofeae (1 y 2), F. o. f. sp. ciceris (3 y 4), F. o. f. sp. radicis-lycopersici (5 y 6), F. o. f. sp. PDA desarrollaron abundante micelio de distintas tonalidades lycopersici (7 y 8) y 9 (garbanzo) amplificadas con la técnica RAPD con que van desde violeta tenue hasta rojo intenso, lo cual ha sido los iniciadores ROTH-C05 y ROTH-C-19. El Marcador de peso reportado previamente por Seifert (2001). La forma especial molecular es de 1kb. 3 Alanis-Martínez et al. Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación... ORIGINAL MP-PCR cuatro formas especiales y entre los genotipos de f. sp. lycoper- Con esta técnica se detectaron pocos datos y también pocos sici con los seis pares de iniciadores utilizados (Figuras 3 y 4). El polimorfismos; pero abundantes barridos (caracterísitica propia dendograma se construyó con 150 datos, identificando a seis de la técnica) entre las cuatro formas especiales. El iniciador grupos con un coeficiente de 0.99 (Figura 7). Esta técnica consi- [GGAT]4 detectó cambios a nivel de ADN entre los genotipos de deró a los genotipos coffeae A-coffeae B, así como a ciceris A– la f. sp. radicis-lycopersici (Figura 2) y [GACA]4 mostró ciceris B como idénticos con una confiabilidad del 100%. A los diferencias entre los genotipos de la f. sp. Coffeae (datos no mostrados). Con el dendrograma generado a partir de la codificación de 35 datos, se identificaron cinco grupos a una distancia de 0.67 (Figura 6). La técnica consideró como idénticos a los genotipos de la f. sp. ciceris con una confiabilidad del 94.4%. Los genotipos de la f. sp. coffeae se relacionaron con una distancia de 0.77 y confiabilidad de 98.5%. El genotipo lycopersici A se agrupó con los dos genotipos de la f. sp. radicis-lycopersici. El genotipo lycopersici B se relaciona con el resto de las formas especiales a una distancia de 0.04 y confiabilidad del 52.2%. El garbanzo se asocia con el resto de los genotipos a una distancia de 0.06 y confiabilidad de 46.5%. El valor de correlación cofenética fue de r = 0.95, valor que indica muy buen ajuste. RAMPnr Con esta técnica las huellas de ADN obtenidas fueron más abundantes y definidas con respecto a las dos técnicas anterior- Figura 3. Huellas de ADN de F. oxysporum f. sp. cofeae (1 y 2), F. o. f. sp. ciceris (3 y 4), F. o. f. sp. radicis-lycopersici (5 y 6), F. o. f. sp. lycopersici (7 y 8) y garbanzo (9) amplificadas con la técnica RAMPnr con los pares de iniciadores [GATA]4 más C-05 y [GATA]4 más C-19 . El Marcador de peso molecular es de 1kb. mente descritas. También detectaron polimorfismos entre las Figura 2. Huellas de ADN de Fusarium oxysporum f. sp. cofeae (1 y 2), Figura 4. Huellas de ADN de Fusarium oxysporum f. sp. cofeae (1 y 2), F. o. f. sp. ciceris (3 y 4), F. o. f. sp. radicis-lycopersici (5 y 6), F. o. f. sp. F. o. f. sp. ciceris (3 y 4), F. o. f. sp. radicis-lycopersici (5 y 6), F. o. f. sp. lycopersici (7 y 8) y garbanzo (9) obtenidas con la técnica MP-PCR con lycopersici (7 y 8) y garbanzo (9) amplificadas con la técnica RAMPnr los iniciadores [GATA]4 y [GGAT]4. El Marcador de peso molecular es con los pares de iniciadores [GACA]4 más C-05 y [GACA]4 más C-19 . de 1kb. El Marcador de peso molecular es de 1kb. 4 Revista Mexicana de Micología vol. 42: 1-7 2015 Figura 5. Relación genómica de Fusarium oxysporum f. sp. cofeae, F. o. f. sp. ciceris, F. o. f. sp. radicis-lycopersici y F. o. f. sp. lycopersici determinada con huellas de ADN tipo RAPD. El dendograma se construyó con el programa NTSYS 2.0, con el coeficiente Dice y el método de agrupamiento UPGMA con 118 datos obtenidos con 7 iniciadores aleatorios. Los números sobre los nodos representan porcentaje de distancia determinado con Bootstrapping con 5000 repeticiones. Figura 6. Relación genómica de Fusarium oxysporum f. sp. coffeae, F. o. f. sp. ciceris, F. o. f. sp. radicis-lycopersici y F. o. f. sp. lycopersici determinada con huellas de ADN tipo MP-PCR. El dendograma se construyó con el programa NTSYS 2.0, con el coeficiente Dice y el método de agrupamiento UPGMA con 35 datos obtenidos con 5 iniciadores para MP-PCR. Los números sobre los nodos representan porcentaje de distancia determinado con Bootstrapping con 5000 repeticiones. dos genotipos de la f. sp. radicis-lycopersici los relaciona a una Discusión distancia de 0.99 y confiabilidad del 100% y a su vez se relacio- Con las técnicas moleculares utilizadas y comparadas RAPD, nan con el genotipo lycopersici A a una distancia 0.66 con una MP-PCR y RAMPnr, se observaron diferencias claras en los confiabilidad del 82.4%. El genotipo lycopersici B se relaciona patrones de bandas de las cuatro formas especiales: F. oxyspo- con el resto de los genotipos a una distancia de 0.08 con una rum f. sp. coffeae, F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. confiabilidad de 97.2% lo que indica, una menor relación con el sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, lo cual resto de las formas especiales (Figura 9). El garbanzo se man- indica que existen diferencias genéticas. Estos resultados con- tiene fuera del agrupamiento. El valor de correlación cofenética cuerdan con lo reportado por Vakalounakis y Fragkiadakis fue de r=0.99198 que representa un buen ajuste. (1999) quienes establecieron diferencias genéticas por medio de 5 Alanis-Martínez et al. Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación... ORIGINAL Figura 7. Relación genómica de Fusarium oxysporum f. sp. cofeae, F. o. f. sp. ciceris, F. o. f. sp. radicis-lycopersici y F. o. f. sp. lycopersici obtenida con la técnica RAMPnr. El dendograma se construyó con el programa NTSYS 2.0, con el coeficiente Dice y el método de agrupamiento UPGMA con 150 datos moleculares. Los números sobre los nodos representan porcentaje de distancia determinado con Bootstrapping con 5000 repeticiones. RAPD entre las formas especiales: cucumerinum y radicis- F. oxysporum con RAPD, además de que la resolución fue mejor cucumerinum. comparada con isoenzimas; por otro lado, Manulis et al. (1994) Al comparar los agrupamientos de las tres técnicas, los indicaron que RAPD es un procedimiento simple, rápido y resultados se muestran similares, pero los genotipos lycopersici reproducible comparado con otras técnicas. MP-PCR también se mantienen separados entre si, lo que sugiere que existe varia- detectó polimorfismos entre las cuatro forma especiales, sin bilidad genética entre la misma forma especial, o que posible- embargo, éstos no fueron lo suficientemente claros en este estu- mente está contaminada desde su aislamiento original, que es lo dio debido a que hay presencia de barridos originados por una más probable. También se observa la separación entre el geno- gran cantidad de fragmentos amplificados por la secuencia de tipo lycopersici B y los dos genotipos de radicis-lycopersici, lo los iniciadores utilizados, característica propia de la técnica que cual puede deberse a variación molecular a nivel de ADN entre indica la gran cantidad de amplicones; pero que debido a su estas formas especiales (Kistler et al. 1987, Kuninaga y Yoko- cercanía en pesos moleculares, no se aprecian en esta clase de sawa 1989). Los polimorfismos detectados en este tipo de hon- geles. Barve et al. (2001) identificaron diferencias con este tipo gos indican que existen fuentes de variabilidad genética entre sí, de marcadores en cuatro razas de F. oxysporum f. sp. ciceris y debido a que tienen un origen polifilético (O´Donell, et al., Bogale et al. (2005) mostraron que los polimorfismos detecta- 1998; Baayen et al., 2000). Por otro lado, el genotipo lycopersici dos son suficientes para el estudio de la diversidad genética en A se agrupa con los dos genotipos de radicis-lycopersici, lo que aislamientos de F. oxysporum. sugiere que existen similitudes genéticas entre estas dos formas especiales, tal como lo han reportado Van Putten et al. (2003). La técnica RAMPnr detectó alta variabilidad genética a través de perfiles abundantes y mayor número de polimorfismos Los análisis con marcadores moleculares permiten identifi- claramente nítidos. Según Barve et al. (2001) señalan que los car diferencias a nivel de ADN y en este estudio las tres técnicas marcadores basados en microsatélites son los mejores para el lo evidenciaron sobre las cuatro formas especiales utilizadas. estudio de F. oxysporum, debido a que son marcadores versáti- RAPD detectó polimorfismos entre los genotipos: coffeae, cice- les particularmente útiles para el análisis de poblaciones. Por ris, radicis-lycopersici y lycopersici, e incluso variación entre los otro lado, Hancock y Simon (2005) mencionan que este tipo de genotipos lycopersici; esta técnica ha sido ampliamente usada marcadores son capaces de diferenciar especies altamente rela- para estimación de la diversidad genética de especies y razas de cionadas y de acuerdo a Esselman et al. (1999) también detectan Fusarium (Chandra et al., 2008). Por otra parte Paavanen et al. mayor cantidad de polimorfismos, por lo que se han utilizado (1999) detectaron alta variabilidad genética en aislamientos de ampliamente para el análisis de poblaciones de hongos (Chan- 6 Revista Mexicana de Micología vol. 42: 1-7 2015 dra et al. 2008). El análisis filogenético hace posible la identificación de formas especiales y razas de patógenos, este tipo de comparaciones es necesario para la identificación de estos organismos, en donde las medidas de control pueden resultar poco efectivas si no se identifica correctamente al organismo causal, sobre todo cuando no existe diferencia a nivel morfológico. Las tres técnicas utilizadas fueron capaces de diferenciar de manera rápida e inequívoca a cada forma especial de Fusarium oxysporum, además de proporcionar datos con los cuales es posible diferenciar organismos de una misma especie tan compleja como es el caso de F. oxysporum. Literatura citada Arbelaéz, T.G., 2000. Algunos aspectos de los hongos del género Fusarium y de la especie Fusarium oxysporum. Agronomía Colombiana 17: 11-22. Baayen, R.P., K. O’Donnell, P.J.M. Bonants, E. Cigelnik, L.P.N.M. Kroon, E.J.A. Roebroeck, C. Waalwijk, 2000. 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