Puesta a punto de un protocolo de agroinfección en Calibrachoa

Puesta a punto de un protocolo de agroinfección en Calibrachoa excellens.
El uso de Agrobacterium rhizogenes como una herramienta para el
mejoramiento en ornamentales.
Gennarelli M. C. 1, Ríos W. 1, Alvarez M. A. 2, Escandón A. S.1
1
Instituto de Floricultura INTA-Castelar. De los Reseros y Nicolas Reppetto s/n, Hurlingham.
2
Fundación Pablo Cassará. Saladillo 2452. Capital.
Email: macrigen@yahoo.com.ar
Introducción
El género Calibrachoa (Solanaceae) comprende 24 especies. En la Argentina existen 12
especies nativas de este género. Entre ellas C. excellens tiene hábito de crecimiento
arbustivo o subarbustivo decumbente, es nativa de las provincias de Corrientes y Misiones,
en Argentina, y Brasil , encontrándose distribuida hasta los 500 metros de altitud. La planta
en su hábitat natural no posee ramificaciones en la base, presenta entrenudos largos y
posee una flor muy bonita de tamaño interesante y color fucsia llamativo.
A. rhizogenes es una bacteria patógena que habita en el suelo y provoca la enfermedad
denominada: raíces en cabellera o "hairy roots", con proliferación de raíces en el sitio de
infección. Se produce por la transferencia de un T-DNA del plásmido Ri de la bacteria al
genoma de la planta. El T-DNA contiene genes que codifican para la síntesis de opinas, que
a su vez codifican para la síntesis de hormonas vegetales y su metabolismo, y los
denominados oncogenes, que estimulan la división celular en el sitio de infección. En
muchas especies es posible regenerar plantas de las raíces sujetas a la agroinfección, las
cuales muestran características fenotípicas particulares. Las alteraciones producidas en las
plantas infectadas pueden ser atractivas desde el punto de vista ornamental. Se ha
observado: enanismo, ruptura de dominancia apical tanto en tallos como raíces, alteración
de la forma de las flores y las hojas, mayor capacidad de enraizamiento, disminución en la
producción de polen y semillas y esterilidad en algunos casos. Los genes responsables de
estas alteraciones fenotípicas se denominan rol y se los conoce como A, B, C y D. Reportes
previos demuestran que A. rhizogenes es una poderosa herramienta alternativa para ser
aplicada en el mejoramiento de ornamentales (para revisión ver Casanova et al, 2005). En
este contexto, la aplicación A. rhizogenes ofrece ventajas que merecen ser destacadas:
1) no precisa de genes selectivos ni reporteros de la transformación genética, 2) la aparición
y el desarrollo de las raíces a partir de los explantos blanco, como señal indicativa de la
ocurrencia de un potencial evento positivo de transformación y, 3) en razón que se trata de
la aplicación de organismos salvajes para la obtención de transgénicos, estos productos no
caen bajo la normativa reguladora de los organismos vegetales genéticamente modificados
(OVGMs) (Burachic, com. personal)
Objetivo
El objetivo del presente trabajo es la puesta a punto de un protocolo de transformación de C.
excellens a través del empleo de Agrobacterium rhizogenes.
Materiales y Métodos
 Material vegetal
Segmentos nodales de ejemplares de Calibrachoa excellens cultivados bajo condiciones de
invernáculo, fueron esterilizados por método estándar de Etanol/lavandina (70% y 9.35g/l de
Cl2 activo), respectivamente. Los explantos se cultivaron en medio MS (Murashige and
Skoog, 1962) sólido (7g/l de agar Sigma), con 30% de sacarosa y pH 5,7, que fue
esterilizado en autoclave a 121ºC 1 atm, por 15 min. La cámara de cultivo se mantuvo a 23 ±
2 ºC y 16 horas luz. Las plantas obtenidas se multiplicaron in vitro y fueron utilizadas como
fuente de explantos blanco de Agrobacterium rhizogenes (hojas y porciones de entrenudo
libres de la yema axilar).
 Cepas bacterianas
Las cepas de A. rhizogenes LBA 15834, LBA 8490, LMG 155 y A13 fueron usadas para
inducir la formación de raíces. Se hicieron crecer (24 hs) en medio YEB (5g/l extracto de
carne, 1g/l extracto de levadura, 5g/l peptona, 5g/l sacarosa, 2mM sulfato de magnesio)
suplementado con el antibiótico Rifampicina (50 µg/ml) para la cepa LBA 15834 y sin
antibiótico para las otras cepas, durante 48 horas a 23±2º C en agitador rotatorio (120rpm).
 Producción de raíces transformadas
La agroinfección se llevó a cabo provocando heridas en los explantos (“n”= 30 por
tratamiento) con una aguja embebida en la suspensión de agrobacterias. Para el cocultivo,
los explantos tratados y los controles fueron sembrados en placas de Petri conteniendo
medio MS sólido diluido al medio e incubados durante 5 días a 23±2ºC en condiciones de
oscuridad. Luego se subcultivaron al mismo medio, pero con el agregado de 500 µg/ml de
antibiótico Cefotaxima (Duncan®). El ensayo de transformación fue repetido dos veces.
 Multiplicación de raíces
Se seleccionaron las raíces putativamente transformadas en base a su crecimiento activo y
con formación de ramificaciones laterales. Se subcultivaron cada 10 días al mismo medio
base, la concentración de Cefotaxima se redujo a la mitad cada 3 semanas hasta su
completa eliminación del medio de cultivo. Para la propagación de las raíces tratadas y sus
controles, ápices de 5 mm de longitud fueron escindidos y cultivados en el mismo medio
(MS 0,5X) con y sin el agregado de agar Sigma (7, 0 g/l) y libre de reguladores del
crecimiento y Cefotaxima. El cultivo se llevó a cabo en frascos tipo erlenmeyer de 150 ml de
capacidad, conteniendo 70 ml de medio. Por su parte, los ápices de raíces cultivados en
medio sólido fueron mantenidos en placas de Petri. Las condiciones de cultivo para ambos
tratamientos fueron las mismas que se indicaron anteriormente.
Resultados y Discusión
La Tabla 1 sintetiza los resultados obtenidos, en los que se observan diferencias en las
respuestas, tanto entre los explantos utilizados como en la virulencia de las cepas de
Agrobacterium probadas; los entrenudos de Calibrachoa excellens no desarrollaron callos ni
raíces con ninguna de las cepas evaluadas y fueron descartados por falta de respuesta. Las
diferentes cepas de Agrobacterium probadas no mostraron el mismo grado de virulencia, en
efecto, las porciones de hojas tratadas con las cepas LMG 155 y LBA 8490 no desarrollaron
callos ni raíces y los cultivos fueron descartados entre los 60 y 90 días.
Tabla1. Respuesta rizogénica de los explantos de C. excellens frente a distintas cepas de A.
rhizogenes. +) Indica la presencia de raíces y su abundancia. -) Ausencia. NE: no ensayado.
Cepas
LBA 15834
A13
LBA 8490
LMG 155
Exp. Resp. callos raíces callos raíces callos raíces callos raíces
Hojas
++++
++++
++
+
-
-
++
-
Entrenudos
-
-
-
-
NE
NE
NE
NE
La cepa A13, considerada de gran virulencia por otros autores (Godo et al, 1997) indujo el
desarrollo de callos y de una raíz sin ramificaciones y de crecimiento lento, por lo que se
infiere que se trató de un falso positivo. Con relación a la cepa LBA15834, a las tres
semanas post infección, las hojas tratadas con esta cepa presentaron el desarrollo de callos
y raíces cortas y con abundante desarrollo pilífero. La Figura 1 muestra la evolución de las
hojas tratadas con la cepa LBA 15834. La Figura 1a, muestra el aspecto inicial de los
explantos agroinfectados, donde se observa el desarrollo incipiente de callos, pelos y raíces.
La Figura 1b, muestra una raíz aislada del explanto original en una etapa temprana del
subcultivo. En la Figura 1c se observa el desarrollo de una raíz agroinfectada con relación al
control no tratado luego de 20 días de cultivo, ambas en un medio libre de antibiótico. Por
último la Figura 1d muestra el cultivo en medio líquido de una raíz tratada.
Se recuperaron 20 eventos putativos de transformación, con una eficiencia, medida como la
cantidad de eventos de transformación recuperados con relación al número de explantos
agroinfectados, de 20/60. Estos resultados estarían indicando una selectividad respecto a la
infección en las cepas de Agrobacterium. En efecto, si bien las cepas LMG 155 y la A13 se
mostraron aptas para la agroinfección en rosa (Vereecke, C., com. personal) y Antirrhinum
majus (Hoschino et al, 1998), bajo las condiciones de este experimento C. excellens mostró
ser refractaria a la infección de las cepas en cuestión.
Una de las características del fenotipo de C. excellens es su hábito de crecimiento
decumbente; el uso de la tecnología de A. rhizogenes permitiría la obtención de nuevas
variedades de C. excellens de mayor compacidad, a lo que se le sumaría la posibilidad de
obtener fenotipos con diferentes formas de hojas y flores.
a
b
c
d
Figura 1. Evolución del cultivo de las hojas de C. excellens tratadas con la cepa LBA 15834
de A. rhizogenes. a) Etapa temprana del cultivo de una hoja agroinfectada, las flechas
indican raíces originadas en diferentes eventos de transformación. b) Raíz aislada del
explanto original, cultivada en medio sólido. c) Comparación de los desarrollos, luego de 20
días de cultivo, de una raíz agroinfectada y de una control. d) Cultivo líquido de raíces
tratadas.
Conclusiones
-En nuestro país este es el primer trabajo donde se aplica A. rhizogenes en especies de
potencial ornamental.
-En el presente ensayo la cepa LBA 15834 de A. rhizogenes mostró ser la más virulenta.
-Si bien falta la confirmación por medio de un análisis molecular, las raíces recuperadas
muestran el típico aspecto de la enfermedad de raíces en cabellera, observándose una
ausencia de dominancia apical, gran vigor en el crecimiento y plagiotropismo.
-Los resultados obtenidos han demostrado ser muy promisorios para futuros ensayos de
transformación.
Bibliografía
Casanova E, et al. Influence of rol genes in floriculture. Biotechnol Adv. 2005. 23 (1): 3-39.
Godo T, et al. Fertile transgenic plants of Nierembergia Scoparia Sendtner obtained by a mikimopine
type strain of Agrobacterium rhizogenes. Sci. Hortic.1997; 68:101–11.
Hoschino Y, Türkan I, Mii M. Transgenic bialaphos-resistant snapdragon (Antirrhinum majus L.)
Produced by Agrobacterium rhizogenes transformation. Sci Hortic 1998;76:37-57.
Murashige T, Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiol. Plant. 1962. 15: 473-497.
Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: Sexual
transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 1984; 37:959– 67.