ENRAIZAMIENTO IN VITRO EN PRESENCIA DEL ANTIBIÓTICO KANAMICINA COMO MÉTODO DE SELECCIÓN EFICIENTE EN LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE GIRASOL. Radonic L., Zimmermann J., Zavallo D., López N., López Bilbao M. Instituto de Biotecnología, INTA-Castelar, De los Reseros y Las Cabañas s/n (1712) Castelar. E-mail: mlopezbilbao@cicv.inta.gov.ar Como parte del proceso de la transformación genética de los vegetales es necesario incorporar un gen que otorgue una ventaja selectiva a aquellas células que han sido transformadas frente a las que no lo han sido. En la transformación de girasol, a pesar de las publicaciones existentes (Hewezi et al., 2002), no existe hasta el momento un protocolo de transformación eficiente y reproducible, y en parte se debe a que presentan un alto número de escapes, demostrando que el método de selección no es efectivo. El objetivo de este trabajo es establecer el uso del antibiótico kanamicina como agente selectivo, buscando relacionar la presencia del transgén con un comportamiento diferencial in vitro. Se transformaron tejidos meristemáticos de semillas en germinación del genotipo HA89 utilizando la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens. Se utilizó como vector de transformación un plásmido conteniendo GUS-intrón bajo el promotor CaMV35S y el gen de resistencia a kanamicina nptII bajo el promotor nos (Vancanneyt et al., 1990). Se utilizó el protocolo de transformación desarrollado en el Instituto de Biotecnología. La selección se realizó a partir del tercer medio de regeneración (Re3) utilizando 50mg/l de kanamicina. La expresión del gen indicador se evidenció mediante ensayos de tinción histoquímica (Jefferson et al., 1987) y la presencia del transgén se analizó mediante la amplificación de un fragmento del gen GUS-intrón por PCR. Para analizar la respuesta in vitro de los cultivos frente al antibiótico se compararon 4 situaciones: Controles no agroinfectados (C), Controles tratados con kanamicina (C-Km), Agroinfectados (A) y Agroinfectados con Km (A-Km). Los parámetros analizados para determinar si existían respuestas diferenciales fueron: color/aspecto y altura de las plántulas, formación de botón floral y de raíces in vitro. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (test 2-Chi cuadrado) entre las 4 situaciones para ninguno de los parámetros estudiados. En el caso de la formación de raíz in vitro se observó que este fenómeno fue fuertemente afectado por la presencia del antibiótico ya que ningún C-Km fue capaz de enraizar in vitro mientras que 2 plántulas A-Km enraizaron. Estas 2 plántulas fueron transferidas al invernáculo y se obtuvo descendencia de una de ellas (6 semillas) posibilitando el análisis de la T1. Para el análisis molecular se extrajo ADN de: a) plántulas enteras obtenidas in vitro, b) hojas de las plántulas A-Km que enraizaron in vitro y c) hojas de las 6 plantas correspondientes a la T1 crecidas en invernáculo ( a y b corresponden a quimeras T0). La relación entre los resultados obtenidos en el análisis molecular y la respuesta observada in vitro se logró cruzando los resultados para las plántulas A-Km en su respuesta durante el cultivo de tejidos para los 4 parámetros analizados con los datos de presencia o ausencia del transgén evaluada por PCR. El análisis estadístico ( 2 ) muestra que no existe relación entre la presencia del transgén con el color/aspecto y la altura de los brotes o la aparición de botón floral ya que hay plántulas tanto positivas como negativas en idénticas proporciones para cada carácter estudiado. En lo que se refiere a la formación de raíces in vitro, al ser sólo 2 las plántulas que enraizaron en presencia de Km no se observa una diferencia significativa pero cabe destacar que ambas tuvieron un resultado positivo, así como que ninguna de las C-Km fue capaz de enraizar. En el análisis de la T1 se obtuvieron resultados positivos para las 6 plantas mediante las técnicas de PCR, tinción histoquímica de GUS y RT PCR. La eficiencia de transformación con este método de selección fue del 0,7%. Todas las publicaciones existentes en transformación de girasol realizan la selección en Km teniendo en cuenta sólo el color/aspecto de las plántulas, sin embargo estos trabajos presentan niveles de escapes elevados (10-79%). El enraizamiento en Km no se utilizó en ninguna de las publicaciones como método selectivo. Las conclusiones obtenidas de este trabajo son: i- La selección por formación de raíces en presencia de kanamicina sería un método exitoso ya que no se obtuvieron escapes y la eficiencia de transformación con este método selectivo fue el 0,7% y ii- La coloración de los explantos no debería ser tomada como criterio de selección ante el antibiótico Km. Bibliografía Hewezi T et al (2002) Plant Mol Biol Rep 20:335-345 Jefferson RA, et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907. Vancanneyt G, et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245-250.