1 GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS BIOTECNOLOGIA DE HONGOS AÑO 2011 2 TRABAJO PRÁCTICO N° 1 a) Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micología Técnicas de siembra y aislamiento. Objetivos Aislar hongos por los siguientes métodos: siembra espontánea, técnica del anzuelo queratinoso, diluciones sucesivas y plaqueo directo a partir de diferentes muestras Materiales Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Driglasky. Tubos de ensayo estériles. Tubos de centrífuga estériles. Pipetas estériles. Agua destilada y solución fisiológica estériles. Tween 80 estéril. Cloranfenicol (5% P/V en alcohol etílico). Rosa de bengala (1/150). Embudo y gasa. Acido cítrico al 10%. Ansa calibrada. Pelos de caballo estériles. Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna. Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna. Erlenmeyers estériles. Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna. Placas de Petri estériles. Granos, materia fecal, tierra. Técnicas 1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontánea: Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las placas y se incuban a 28°C durante una semana. Observar. Efectuar una resiembra (repique) de las colonias de interés en tubos con agar inclinado para obtener un cultivo puro. 3 2) Aislamiento de hongos queratinofílicos por la técnica del anzuelo queratinoso: En una placa de Petri estéril se coloca una capa gruesa de la tierra en estudio, sobre ella se depositan pelos de caballo estériles y se humecta. Se incuba a 28°C durante 15 a 30 días, aislándose luego los hongos de interés. 3) Aislamiento y recuento de hongos de suelo y alimentos por diluciones sucesivas: Se colocan 10 g de suelo cuya población fúngica se desea estudiar en un erlenmeyer estéril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo luego una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000). En placas de petri estériles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de bengala y 0,1 ml de cloranfenicol y se deja solidificar. Sobre las mismas se siembran 0,1 ml de las diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersándolas con espátula de Driglasky. Se incuba a 28°C durante una semana. Se realiza el recuento de colonias (en aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias) y el aislamiento de las cepas de interés. Esta técnica puede emplearse también para alimento finamente molido sembrando las diluciones correspondientes en medio DRBC y DG18. 4) Plaqueo directo de alimentos particulados: Para el aislamiento de cepas fúngicas a partir de alimentos particulados (granos, semillas, trozos de alimentos) se emplea la técnica de plaqueo directo. Los granos son desinfectados superficialmente sumergiéndolos 2 minutos en una solución de hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo – dilución 1/10 de lavandina de uso doméstico). Después de escurrirlas, las partículas son colocadas utilizando una pinza estéril, a razón de 8-10 granos por placa, directamente sobre placas de medio DRBC (diclorán-rosa de bengala-cloranfenicol-agar) y DG18 (diclorán 18 %-cloranfenicolagar) que se incuban a 25 ºC durante 5 días. 4 b) Tema: Macromorfología de las colonias fúngicas Micromorfología del desarrollo fúngico vegetativo Técnicas de siembra de cepas fúngicas Objetivos Describir macromorfológicamente las colonias fúngicas. Identificar estructuras micromorfológicas básicas del desarrollo vegetativo de un hongo. Materiales Caja de trabajo. Placas de Petri con desarrollos de hongos filamentosos y levaduriformes crecidos en distintos medios de cultivo sólido. Placas de Petri estériles. Placas de Petri con medio de cultivo Sabouraud. Soportes en V. Agua destilada estéril. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología. Técnicas 1) Descripción macromorfológica de colonias fúngicas: Observar distintas colonias fúngicas ya desarrolladas en los medios de cultivo apropiados. Describir sus características macromorfológicas como color, forma, aspecto, consistencia, velocidad de crecimiento, etc. como parte del estudio taxonómico de un hongo. 2) Observación microscópica de desarrollos fúngicos: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de desarrollos vegetativos de hongos levaduriformes y filamentosos (tabicados y no tabicados) hialinos y dematiáceos. Relacionar las características micromofológicas con la macromorfología que presentan las colonias fúngicas. 5 CARACTERÍSTICAS MACROMORFOLOGICAS DE COLONIAS FÚNGICAS COLOR ANVERSO REVERSO producción de pigmento difusible SUPERFICIE LISA ACUMINADA CRATERIFORME RADIADA UMBILICADA CEREBRIFORME BORDE LISO RADIADO FESTONEADO LOBULADO CONSISTENCIA BLANDA FILANTE ADHERENTE LEÑOSA ASPECTO CREMOSO YESOSO CEREBRIFORME ALGODONOSO AFELPADO ATERCIOPELADO DESARROLLO . POBRE REGULAR ABUNDANTE 6 TRABAJO PRÁCTICO N° 2 Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis tálica y blástica. Reproducción sexual. Objetivos Reconocer micromorfológicamente las formaciones de esporas asexuales y conidios más comunes de la reproducción asexuada tálica y blástica y las estructuras producto de una reproducción sexual. Materiales Caja de trabajo. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de montar para observación de su micromorfología. Técnicas 1) Observación microscópica de elementos de conidiación tálica y blástica: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de esporas asexuales y elementos de reproducción tálica: clamidoconidios, macroconidios, microconidios, artroconidios (holo y enteroártricas) y elementos de reproducción blástica: holo o enteroblásticas a partir de células conidiogénicas determinadas o indeterminadas, tratando de caracterizar los elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificación. 2) Observación microscópica de elementos de reproducción sexuada: Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción sexuada: cleistotecios, peritecios, apotecios, ascos desnudos, zigosporas, etc. 7 TRABAJO PRÁCTICO N° 3 a) Tema: Dimorfismo fúngico Objetivos Reconocer las características macro y micromorfológicas de algunos hongos dimórficos. Observar la micromorfología de levaduras utilizando el medio de agar harina de maíz. Materiales Caja de trabajo Tubos de hemólisis con suero estéril Colonias y preparados de cultivos de diferentes hongos dimórficos Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz). Técnicas 1) Producción de tubos germinativos Inocular 0,5 ml de suero estéril con una pequeña cantidad de levadura con aguja. Incubar a 37°C, observar microscópicamente una gota de la suspensión cada 30 minutos, hasta las 3 horas. La presencia de tubos germinativos permite la identificación rápida de Candida albicans y Candida dubliniensis. 2) Observación macro y micromorfológica de cultivos de hongos dimórficos: Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum 3) Siembra de levaduras en AHM: Dividir una placa de Petri conteniendo medio de cultivo AHM en cuatro secciones. En cada cuadrante sembrar con ansa una levadura a partir de un cultivo puro. Efectuar la siembra realizando tres estrías paralelas, con una separación de 5mm aproximadamente y con un largo mayor a 20 mm. Colocar sobre ellas un cubreobjetos previamente flameado y enfriado. A las 48 hs. observar las caracteristicas micromorfológicas del desarrollo. 8 b) Tema: .Pruebas bioquímicas Objetivos Interpretar pruebas bioquímicas útiles para la identificación de hongos. Materiales Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza Técnicas 1) Interpretación de pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de cepas fúngicas Asimilación de hidratos de carbono y sustancias nitrogenadas (auxonograma) Fermentación de sustancias hidrocarbonadas (zimograma) Desarrollo de levaduras en medio CHROMagar Candida Desarrollo de levaduras en medio Agar Semillas de Girasol Equipo API 20C para identificación de levaduras. Determinación de la producción de ureasa en medio de Christensen Tests nutricionales para la diferenciación de especies del género Trichophyton Crecimiento en medio con Agar Púrpura de Bromocresol – leche - glucosa. 9 LÍQUIDOS DE MONTAJE DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS COLORANTE GUEGUÉN (Azul de algodón) Ácido láctico.............................................100 g Sudán III..................................................0.10 g Azul de algodón.......................................0.10 g Solución alcohólica de Yodo..............10-20 gotas. LÍQUIDO DE MONTAR Glicerina....................................................40 g Ácido láctico..............................................20 g Fenol cristalizado......................................20 g Agua destilada..........................................20 ml MEDIOS DE CULTIVO AGAR SABOURAUD GLUCOSA Medio utilizado para el aislamiento, identificación y mantenimiento de la gran mayoría de los hongos patógenos Peptona......................................................10 g Glucosa......................................................20 g Agar-agar...................................................20 g Agua destilada........................................1000 ml Ajustar el pH a 5.6. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. Para preparar Sabouraud Glucosa Cloranfenicol agregar a la preparación anterior 100 ml de solución de cloromicetina (cloranfenicol) 0.5 %P/V (en etanol) antes de esterilizar. AGAR PAPA DEXTROSA Extracto de papa......................................500 ml Glucosa......................................................20 g Carbonato de calcio..................................0.2 g Sulfato de magnesio heptahidratado........0.2 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada.........................................500 ml 10 Extracto de papa: Pelar la papa y cortarla en trozos pequeños. Poner a hervir con 500 ml de agua destilada. Filtrar a través de una gasa y reponer el volumen anterior. Añadir los otros componentes. Disolver por calentamiento. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. DICLORAN – ROSA DE BENGALA – CLORANFENICOL – AGAR (DRBC) Glucosa.....................................................10 g Peptona.......................................................5 g KH2PO4...................................................…..1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar…................................................15 g Rosa de Bengala......................................25 mg (soluc. 5% p/v en agua, 0.5 ml) Diclorán.......................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol............................................100 mg Agua destilada..............................................1 l Después de agregar todos los ingredientes, esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. PH final entre 5.5 – 5.8. Almacenar el medio ya preparado lejos de la luz ya que fotoproductos del rosa de bengala son altamente inhibitorios de algunos hongos, especialmente levaduras. En la oscuridad el medio es estable por más de un mes a 1-4 °C. Las soluciones stock de rosa de bengala y cloranfenicol no necesitan esterilización y también son estables por largos períodos. DICLORAN 18% GLICEROL AGAR (DG18) Glucosa......................................................10 g Peptona........................................................5 g KH2PO4...................................................…..1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar…................................................15 g Glicerol.....................................................220 g Diclorán.....................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol..........................................100 mg Agua destilada...............................................1 l Agregar los componentes minoritarios y el agar a aproximadamente 800 ml de agua destilada. Calentar para disolver el agar y completar a 1 litro con agua destilada. 11 Agregar el glicerol. Notar que la concentración final del glicerol es 18% p/p. Esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. PH final 5.5 – 5.8, Aw: 0.955. AGAR HARINA DE MAÍZ Harina de maíz amarillo.............................40 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada........................................1000 ml Disolver la harina de maíz en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta disolución completa. Filtrar a través de gasa y reconstituir el volumen anterior. Añadir el agar disuelto en los 500 ml de agua destilada restantes. Volver a calentar hasta disolver todos los componentes. Filtrar hasta obtener un líquido transparente. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. AGAR SEMILLAS DE GIRASOL Extracto de semillas de girasol...............200 ml Glucosa.....................................................10 g Agar-agar..................................................20 g Agua destilada........................................800 ml Autoclavar 15 minutos a 121 °C. Preparación de extracto de semillas de girasol: Moler a polvo 70 g de semillas de girasol con cáscara, agregar 350 ml de agua destilada. Autoclavar 15 minutos a 121 °C y filtrar a través de gasa estéril. AGAR PÚRPURA DE BROMOCRESOL – LECHE – GLUCOSA Solución A Leche en polvo descremada……………….20 g Soluc. Alcohólica de PBC………………….0.5 ml Agua destilada..........................................250 ml Disolver todos los componentes Solución PBC Púrpura de Bromocresol……………………1.6 g Alcohol………...........................................100 ml Solución B 12 Glucosa………………………………………10 g Agua destilada............................................50 ml Disolver todos los componentes Solución C Agar…………………………………………..7.5 g Agua destilada...........................................200 ml Ajustar el pH a 6.6 Una vez disueltos todos los componentes esterilizar por separado y luego mezclar todas las soluciones en una.