micro general guía 2011 de tp

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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
MICROBIOLOGÍA GENERAL
ÁREA MICOLOGÍA
AÑO 2011
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TRABAJO PRÁCTICO N° 1
Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micología
Técnicas de siembra y aislamiento.
Objetivos
Aislar hongos por los siguientes métodos: siembra espontánea,
agotamiento en superficie, técnica del anzuelo queratinoso, diluciones
sucesivas y plaqueo directo de granos.
Materiales
Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos,
papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V,
Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Driglasky.
Tubos de ensayo estériles.
Tubos de centrífuga estériles.
Pipetas estériles.
Agua destilada y solución fisiológica estériles.
Tween 80 estéril.
Cloranfenicol (5% P/V en alcohol etílico).
Rosa de bengala (1/150).
Embudo y gasa.
Acido cítrico al 10%.
Ansa calibrada.
Pelos de caballo estériles.
Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna.
Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna.
Erlenmeyers estériles.
Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna.
Placas de Petri estériles.
Granos, materia fecal, tierra.
Técnicas
1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontánea:
Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan
las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las
placas y se incuban a 28°C durante una semana. Obse rvar. Efectuar una
resiembra (repique) de las colonias de interés en tubos con agar inclinado para
obtener un cultivo puro.
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2) Aislamiento y recuento de levaduras por agotamiento en superficie:
Se siembran 10µl de orina completa, previamente agitada, en la superficie
de placas conteniendo medios de Sabouraud-glucosa y Sabouraud-glucosacloranfenicol. Se incuba a 28°C durante una semana, realizando el recuento de
colonias y el aislamiento para la posterior identificación de las cepas de interés.
Factor para recuento: 100
3) Aislamiento de hongos queratinofílicos por la técnica del anzuelo
queratinoso:
En una placa de Petri estéril se coloca una capa gruesa de la tierra en
estudio, sobre ella se depositan pelos de caballo estériles y se humecta. Se
incuba a 28°C durante 15 a 30 días, aislándose lueg o los hongos de interés.
4) Aislamiento y recuento de hongos de suelo y alimentos por diluciones
sucesivas:
Se colocan 10 g de suelo cuya población fúngica se desea estudiar en un
erlenmeyer estéril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo
luego una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000).
En placas de petri estériles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de
bengala y 0,1 ml de cloranfenicol y se deja solidificar. Sobre las mismas se
siembran 0,1 ml de las diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersándolas
con espátula de Driglasky. Se incuba a 28°C durante una semana. Se realiza el
recuento de colonias (en aquellas placas que contengan entre 30 y 300
colonias) y el aislamiento de las cepas de interés.
Esta técnica puede emplearse también para alimento finamente molido
sembrando las diluciones correspondientes en medio DRBC y DG18.
5) Plaqueo directo de alimentos particulados:
Para el aislamiento de cepas fúngicas a partir de alimentos particulados
(granos, semillas, trozos de alimentos) se emplea la técnica de plaqueo directo.
Los granos son desinfectados superficialmente sumergiéndolos 2 minutos en
una solución de hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo – dilución 1/10 de
lavandina de uso doméstico). Después de escurrirlas, las partículas son
colocadas utilizando una pinza estéril, a razón de 8-10 granos por placa,
directamente sobre placas de medio DRBC (diclorán-rosa de bengalacloranfenicol-agar) y DG18 (diclorán 18 %-cloranfenicol-agar) que se incuban a
25 ºC durante 5 días.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 2
Tema: Macromorfología de las colonias fúngicas
Micromorfología del desarrollo fúngico vegetativo
Técnicas de siembra de cepas fúngicas
Objetivos
Describir macromorfológicamente las colonias fúngicas.
Sembrar hongos para obtener colonias adultas, repicar cepas como parte
del estudio taxonómico.
Identificar estructuras micromorfológicas básicas del desarrollo fúngico.
Aplicar la técnica de cultivo de adhesión.
Materiales
Caja de trabajo.
Placas de Petri con desarrollos de hongos filamentosos y levaduriformes
crecidos en distintos medios de cultivo sólido.
Placas de Petri estériles.
Placas de Petri con medio de cultivo Sabouraud.
Soportes en V.
Agua destilada estéril.
Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o
líquido de montar para observación de su micromorfología.
Técnicas
1) Siembra de cepas fúngicas para obtención de colonias adultas:
Preparar placas de Petri con medio Agar Papa Dextrosa u otros medios
adecuados. Sembrar por un toque en el centro de la placa la cepa fúngica (a
partir de un cultivo puro). Incubar a 28°C entre 5 – 7 días. Observar. Describir.
2) Descripción macromorfológica de colonias fúngicas:
Observar distintas colonias fúngicas ya desarrolladas en los medios de
cultivo apropiados. Describir sus características macromorfológicas como color,
forma, aspecto, consistencia, velocidad de crecimiento, etc. como parte del
estudio taxonómico de un hongo.
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3) Observación microscópica de desarrollos fúngicos:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones
montadas con Gueguén o líquido de montar de desarrollos vegetativos de
hongos levaduriformes y filamentosos (tabicados y no tabicados) hialinos y
dematiáceos. Relacionar las características micromofológicas con la
macromorfología que presentan las colonias fúngicas.
2) Cultivo de adhesión:
En una placa de petri estéril, colocar un soporte en V y un portaobjetos
previamente flameados. Depositar sobre el portaobjetos 3 cuadrados de 1 cm
de lado de un medio de cultivo apropiado. Sembrar los medios con el hongo en
estudio y cubrir con cubreobjetos previamente flameados y enfriados. Colocar
sobre la base de la caja de Petri agua destilada estéril e incubar a 28°C el
tiempo necesario. Para su observación retirar el cubreobjetos y colocarlo sobre
un portaobjetos limpio en el que previamente se ha depositado una gota del
líquido de montaje adecuado.
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CARACTERÍSTICAS MACROMORFOLOGICAS DE COLONIAS FÚNGICAS
COLOR
•
•
ANVERSO
REVERSO
producción de pigmento difusible
SUPERFICIE
•
•
•
•
•
•
LISA
ACUMINADA
CRATERIFORME
RADIADA
UMBILICADA
CEREBRIFORME
BORDE
•
•
•
•
LISO
RADIADO
FESTONEADO
LOBULADO
CONSISTENCIA
•
•
•
•
BLANDA
FILANTE
ADHERENTE
LEÑOSA
ASPECTO
•
•
•
•
•
•
CREMOSO
YESOSO
CEREBRIFORME
ALGODONOSO
AFELPADO
ATERCIOPELADO
DESARROLLO
•
•
•
.
POBRE
REGULAR
ABUNDANTE
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TRABAJO PRÁCTICO N° 3
Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis tálica.
Objetivos
Reconocer micromorfológicamente las formaciones de esporas asexuales y
conidios más comunes de la reproducción asexuada tálica
Observar la micromorfología de levaduras utilizando el medio de agar
harina de maíz.
Materiales
Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz).
Caja de trabajo.
Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o
líquido de montar para observación de su micromorfología.
Técnicas
1) Observación microscópica de elementos de conidiación tálica:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones
montadas con Gueguén o líquido de montar de esporas asexuales y elementos
de reproducción tálica: clamidoconidios, macroconidios, microconidios,
artroconidios (holo y enteroártricas), tratando de caracterizar los elementos
observados de acuerdo a los criterios de clasificación.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 4
Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis blástica.
Objetivos
Reconocer micromorfológicamente las formaciones de conidios más
comunes de la reproducción asexuada blástica.
Materiales
Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz)
Caja de trabajo
Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o
líquido de montar para observación de su micromorfología
Técnicas
1) Observación microscópica de elementos de conidiación blástica:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones
montadas con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción
blástica: holo o enteroblásticas a partir de células conidiogénicas determinadas
o indeterminadas, tratando de caracterizar los elementos observados de
acuerdo a los criterios de clasificación.
2) Siembra de levaduras en AHM:
Dividir una placa de Petri conteniendo medio de cultivo AHM en cuatro
secciones. En cada cuadrante sembrar con ansa una levadura a partir de un
cultivo puro. Efectuar la siembra realizando tres estrías paralelas, con una
separación de 5mm aproximadamente y con un largo mayor a 20 mm. Colocar
sobre ellas un cubreobjetos previamente flameado y enfriado. A las 48 hs.
observar las caracteristicas micromorfológicas del desarrollo.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 5
Tema: Reproducción sexuada.
Objetivos
Reconocer
sexuada
micromorfológicamente
las
estructuras
de
reproducción
Materiales
Caja de trabajo
Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o
líquido de montar para observación de su micromorfología
Técnicas
1) Observación microscópica de elementos de reproducción sexuada:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones
montadas con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción
sexuada: cleistotecios, peritecios, apotecios, ascos desnudos.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 6
Tema: Dimorfismo fúngico
Objetivos
Reconocer las características macro y micromorfológicas de algunas
hongos dimórficos.
Materiales
Caja de trabajo
Tubos de hemólisis con suero estéril
Colonias y preparados de cultivos de diferentes hongos dimórficos
Técnicas
1) Producción de tubos germinativos
Inocular 0,5 ml de suero estéril con una pequeña cantidad de levadura con
aguja. Incubar a 37°C, observar microscópicamente u na gota de la suspensión
cada 30 minutos, hasta las 3 horas. La presencia de tubos germinativos
permite la identificación rápida de Candida albicans y Candida dubliniensis.
2) Observación macro y micromorfológica de cultivos de hongos
dimórficos:
Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum
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LÍQUIDOS DE MONTAJE DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS
COLORANTE GUEGUÉN (Azul de algodón)
Ácido láctico.............................................100 g
Sudán III..................................................0.10 g
Azul de algodón.......................................0.10 g
Solución alcohólica de Yodo..............10-20 gotas.
LÍQUIDO DE MONTAR
Glicerina....................................................40 g
Ácido láctico..............................................20 g
Fenol cristalizado......................................20 g
Agua destilada..........................................20 ml
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR SABOURAUD GLUCOSA
Medio utilizado para el aislamiento, identificación y mantenimiento de la gran
mayoría de los hongos patógenos
Peptona......................................................10 g
Glucosa......................................................20 g
Agar-agar...................................................20 g
Agua destilada........................................1000 ml
Ajustar el pH a 5.6. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.
Para preparar Sabouraud Glucosa Cloranfenicol agregar a la preparación
anterior 100 ml de solución de cloromicetina (cloranfenicol) 0.5 %P/V (en
etanol) antes de esterilizar.
AGAR PAPA DEXTROSA
Extracto de papa......................................500 ml
Glucosa......................................................20 g
Carbonato de calcio..................................0.2 g
Sulfato de magnesio heptahidratado........0.2 g
Agar-agar...................................................15 g
Agua destilada.........................................500 ml
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Extracto de papa: Pelar la papa y cortarla en trozos pequeños. Poner a hervir
con 500 ml de agua destilada. Filtrar a través de una gasa y reponer el volumen
anterior. Añadir los otros componentes. Disolver por calentamiento. Esterilizar
durante 15 minutos a 121°C.
DICLORAN – ROSA DE BENGALA – CLORANFENICOL – AGAR (DRBC)
Glucosa.....................................................10 g
Peptona.......................................................5 g
KH2PO4...................................................…..1 g
MgSO4.7H2O.............................................0.5 g
Agar-agar…................................................15 g
Rosa de Bengala......................................25 mg
(soluc. 5% p/v en agua, 0.5 ml)
Diclorán.......................................................2 mg
(soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml)
Cloranfenicol............................................100 mg
Agua destilada..............................................1 l
Después de agregar todos los ingredientes, esterilizar por autoclavado a 121
°C durante 15 minutos. PH final entre 5.5 – 5.8. Al macenar el medio ya
preparado lejos de la luz ya que fotoproductos del rosa de bengala son
altamente inhibitorios de algunos hongos, especialmente levaduras. En la
oscuridad el medio es estable por más de un mes a 1-4 °C. Las soluciones
stock de rosa de bengala y cloranfenicol no necesitan esterilización y también
son estables por largos períodos.
DICLORAN 18% GLICEROL AGAR (DG18)
Glucosa.....................................................10 g
Peptona.......................................................5 g
KH2PO4...................................................…..1 g
MgSO4.7H2O.............................................0.5 g
Agar-agar…................................................15 g
Glicerol......................................................220 g
Diclorán.......................................................2 mg
(soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml)
Cloranfenicol............................................100 mg
Agua destilada..............................................1 l
Agregar los componentes minoritarios y el agar a aproximadamente 800 ml de
agua destilada. Calentar para disolver el agar y completar a 1 litro con agua
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destilada. Agregar el glicerol. Notar que la concentración final del glicerol es
18% p/p. Esterilizar por autoclavado a 121 °C duran te 15 minutos. PH final 5.5
– 5.8, Aw: 0.955.
AGAR HARINA DE MAÍZ
Harina de maíz amarillo.............................40 g
Agar-agar...................................................15 g
Agua destilada........................................1000 ml
Disolver la harina de maíz en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta
disolución completa. Filtrar a través de gasa y reconstituir el volumen anterior.
Añadir el agar disuelto en los 500 ml de agua destilada restantes. Volver a
calentar hasta disolver todos los componentes. Filtrar hasta obtener un líquido
transparente. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.
AGAR SEMILLAS DE GIRASOL
Extracto de semillas de girasol...............200 ml
Glucosa.....................................................10 g
Agar-agar..................................................20 g
Agua destilada........................................800 ml
Autoclavar 15 minutos a 121 °C.
Preparación de extracto de semillas de girasol: Moler a polvo 70 g de semillas
de girasol con cáscara, agregar 350 ml de agua destilada. Autoclavar 15
minutos a 121 °C y filtrar a través de gasa estéril .
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