Resistencia a Enfermedades y plagas. Mejoramiento de la resistencia
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UNER FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS CÁTEDRA GENÉTICA Y MEJORAMIENTO VEGETAL Y ANIMAL UNIDAD TEMÁTICA 5 TEMA 5.8. Mejoramiento de la resistencia a enfermedades, plagas y factores ambientales adversos. Tipos de resistencia. Genética de la interacción hospedante-patógeno. Fuentes de resistencia y evaluación de la misma. Obtención de cultivares resistentes. Variedades multilíneas. Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. Las plantas están continuamente expuestas a un gran número de microorganismos, la presencia de la pared celular actúa como un mecanismo de defensa, pero también existen características genéticas, propias de cada especie y genotipo, que otorgan algunas formas de tolerancia o resistencia a determinados patógenos. Las enfermedades y plagas causan pérdidas considerables de las producciones agrícolas a nivel mundial, la cual se estima corresponde a un 12% a nivel mundial, con años en los cuales se ven perdidas mayores por la aparición de epifitias, principalmente en los monocultivos intensivos donde la propagación de enfermedades y plagas es más fácil. Las plantas tienen un sistema inmunitario capaz de hacerlas resistentes a hongos, bacterias y virus patógenos. Muchas veces, ante la presencia de un agente patógeno, la respuesta de la planta es tan rápida que se da lo que se conoce como respuesta de hipersensibilidad, que se manifiesta como una necrosis de la zona adyacente a la entrada del patógeno, el cual queda aislado y así se evita su avance por tejidos sanos de la planta. Consecuente a esa respuesta hipersensible se producen una serie de señales, que determinan la síntesis de las llamadas proteínas relacionadas con la patogénesis, las cuales son activas contra el organismo desencadenante de la enfermedad. También esa reacción de hipersensibilidad da lugar a la síntesis de radicales libres de oxígeno, que provocan la muerte celular y necrosis de los tejidos vecinos al punto de ataque, así como al endurecimiento de las paredes de las células limítrofes. Para que ocurra esta respuesta se requiere que entre el patógeno y el hospedador se establezca un cruce de señales que se da cuando tanto el patógeno como la planta llevan los genes necesarios para ello. Genes de avirulencia en el primero y genes de resistencia en la segunda. Este hecho, conocido como sistema gen a gen y descubierto hace casi 50 años, va a permitir la construcción de plantas resistentes a patógenos haciendo innecesaria la utilización de productos químicos para el tratamiento de enfermedades tan importantes como las podredumbres, royas, mosaicos, etc. El hallazgo y estudio de los genes de resistencia en las plantas ha sido considerado como uno de los descubrimientos más importantes en biología vegetal, luego del descubrimiento de la fotosíntesis. HERENCIA DE LA RESISTENCIA A ENFERMEDADES ENFERMEDAD Se define como una alteración del metabolismo normal de una planta y de su productividad potencial debido a la presencia de un patógeno que interfiere en los procesos fisiológicos relacionados con el crecimiento y desarrollo reproductivo. Es decir que la enfermedad es el resultado de una interacción entre la planta hospedante y el patógeno en determinadas condiciones ambientales y en un tiempo. Dentro de la Patogénesis podemos diferenciar: Fase de penetración: - Contacto - Penetración Fase de propagación: - Infección - Invasión - Reproducción del patógeno Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 2 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. La Resistencia a los patógenos puede clasificarse en: A la penetración: - Escape: consiste en la no coincidencia de los ciclos del hospedante y el patógeno. Ej: en girasol para la “podredumbre del capítulo” causada por el hongo Esclerotinia esclerotiorum, se aconsejan siembras tempranas, pues el hongo ataca en otoño. - Barreras: son barreras u obstáculos de distintos tipos que impiden la entrada del patógeno. Como por ejemplo el grosor y la densidad de la capa cuticular, el número de estomas por cm2, el tiempo durante el cual los estomas permanecen abiertos, la presencia de exudados químicos, el tiempo durante el cual las flores permanecen abiertas, etc. Como ejemplo se puede citar en cebolla (Allium cepa), la resistencia al "tizón de la cebolla" producido por Coletotricum circimans. Las cebollas con catáfilas pigmentadas, presentan resistencia. Se conoce que la pigmentación está controlada por 3 (tres) loci, 2 (dos) de de los cuales son epistáticos. El locus I, presenta dos alelos posibles I e i; siendo el genotipo II epistáticos. El locus C, presenta dos alelos posibles C y c y el genotipo cc es inhibidor. Por último el locus R, también presenta dos alelos posibles R y r. Los genotipos y fenotipos posibles son (cuadro 1): Genotipo Fenotipo para color de catáfilas ii C-R- rojo Ii C- rr Amarillo Ii C- R- Rosado Ii C- rr crema Otros genotipos blanco Resistencia a tizón resistentes medianamente resistentes susceptible Cuadro 1. Sistema genético de Allium cepa para los caracteres pigmentación de las catáfilas externas y resistencia a Tizón. La base química de la resistencia está relacionada con las sustancias responsables de la síntesis del pigmento. El mismo sistema genético rige el carácter pigmentación de la escama externa de la cebolla y resistencia a Tizón. A la propagación: - Aislamiento por proliferación celular - Aislamiento por muerte de células en la zona de entrada del patógeno (hipersensibilidad). Tolerancia: la planta es capaz de mantener un rendimiento adecuado a pesar de exhibir los síntomas de un huésped susceptible. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 3 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 4 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. TIPOS DE RESISTENCIA Se pueden mencionar en general dos tipos de resistencia: - Resistencia NO ESPECÍFICA: también llamada resistencia horizontal, cuantitativa, a campo, general o poligénica. En este caso el patógeno no muestra diferencias genéticas en cuanto a virulencia. El huésped puede presentar distintos grados de resistencia según su genotipo. La protección es parcial y generalmente la herencia es de tipo poligénica. - Resistencia ESPECÍFICA: también llamada resistencia vertical o cualitativa. En este caso el patógeno sí muestra variabilidad genética para virulencia y en el hospedante se presenta variabilidad genética para la resistencia. La variabilidad genética en los patógenos genera RAZAS FISIOLÓGICAS, que están constituidas por conjuntos de individuos dentro de una especie morfológica que se diferencian de otros grupos por alguna característica fisiológica, principalmente la virulencia. TEORÍA DE FLOR Flor (1956) trabajó con el sistema lino-roya (Melampsora lini) y postuló que por cada gen capaz de mutar en el hospedante para darle resistencia, existe un gen en el patógeno capaz de mutar para vencer esa resistencia. El resultado de la interacción se denomina TIPO DE INFECCIÓN y puede ser leve (L) o incompatible o grave (G) o compatible. En general los genes de resistencia en el hospedante se comportan como dominantes y los genes de virulencia en el patógeno como recesivos. Flor postuló que cuando se da esta especialización entre el genotipo del parásito y del hospedante, se establece una relación gen a gen. Para un par de genes en el hospedante y un par en el patógeno, las interacciones posibles pueden representarse mediante el siguiente cuadro (cuadro 2): Patógeno Hospedante R- (resistente) rr (no resistente) V(avirulento) L G vv (virulento) G G Cuadro 2. Interacción entre un locus para resistencia en el hospedante y un locus para virulencia en el patógeno. Cuando en el hospedante no hay resistencia (rr), la infección es SIEMPRE GRAVE, sin importar cual es el genotipo del patógeno. En la mayoría de los casos, en las relaciones gen a gen, intervienen múltiples loci de ambos organismos. Así, cuando existan 2 (dos) loci que interactúan, por ejemplo R1; r1 y R2; r2 será (cuadro 3): Hospedante Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 5 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. R1-R2- R1-r2r2 r1r1R2- r1r1 r2r2 V1- v2v2 L L L L L G G G v1v1V2- L G L G v1v1 v2v2 G G G G Patógeno V1-V2- Cuadro 3. Interacción entre dos loci para resistencia en el hospedante y dos loci para virulencia en el patógeno. Para este caso se analizan las relaciones gen a gen, y el resultado final de la interacción surge de considerar que basta un solo gen de resistencia (R-) en el hospedante que no sea anulado por su correspondiente gen de virulencia en el patógeno para que la infección sea LEVE o la interacción incompatible. En la última columna del cuadro 3, vemos que si el hospedante no tienen ningún gen de resistencia (R), cualquiera sea el genotipo del patógeno la infección es grave. En la última fila del cuadro 3 se puede observar que si el patógeno tiene todos los genes de virulencia, sin importar el genotipo del hospedante la infección es grave. En la columna 2 del hospedante (R1-r2r2) y fila 2 del patógeno (V1- v2v2), el gen de resistencia R1 no es vencido por un gen de virulencia (ya que el patógeno es V1), entonces con esta sola interacción tipo 3 en la que no se vence la resistencia, finalmente la interacción resulta LEVE. Aquí aparecen dos nuevas categorías de interacciones génicas (las de clase 3 y clase 4). Conocíamos las interacciones intralélicas (dominancia y sus variaciones) y las interacciones interalélicas (epistasis) y ahora se observan dos nuevos tipos de interacciones: -Interacción clase 3 (tres) o interacción gen a gen entre loci correspondientes a dos organismos diferentes. Interactúan los genes R1; r1 del hospedante con los V1, v1 del patógeno. -Interacción clase 4 (cuatro) que seria una interacción entre las interacciones de clase 3; en donde una sola interacción de clase 3 que diera infección leve determina que la interacción resulta incompatible y la infección LEVE. La interacción de clase 4 determina el tipo de infección (LEVE O GRAVE). Para clasificar a un sistema hospedante-patógeno como un sistema gen a gen, se deben evaluar por lo menos 2 genotipos de hospedantes con 2 genotipos del patógeno y obtener una reacción cruzada como la que se observa en la parte central del Cuadro 3. Se han determinado interacciones gen a gen en numerosos sistemas hospedante patógenos entre vegetales y hongos, virus, bacterias, nemátodos, e insectos. Ejemplos: En trigo (Triticum aestivum): - Puccinia graminis (roya negra) - Puccinia recondita roya anaranjada) - Puccinia stríiformis (roya amarilla) - Ustilago tritici (carbón volador) - Tilletia caries (carie) Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 6 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. - Erysiphe graminís (oidio) -Mayetiola destructor (mosca de Hess) insecto de importancia en el Hemisferio Norte. En cebada (Hordeum vulgare): - carbón - roya - oidios En girasol (Helianthus annus): - roya En lino (Linun usitatissimum): -Melampsora lini (roya del lino). Con este complejo hospedante patógeno trabajó Flor. En plantas se lino se determinó la presencia de 5 loci con alelos múltiples. El locus K con 2 alelos posibles; el locus L con 11 alelos; el locus M con 6 alelos; el locus N con 3 alelos y el locus P con 4 alelos. Se conoce además que los loci M y P están ligados y se encuentran a 26 UM. En papa (Solanum tuberosum): -Virus X -Phytophtora infestans -Heterodera rontochiensis (nemátode) En lechuga (Lactuca sativa): -Mildiu En general se observa que en el hospedante los loci involucrados en la resistencia presentan alelos múltiples (y a veces ligamientos) y en el patógeno cada locus presenta solo dos alelos posibles y no se han observado ligamentos. Esto tiene importancia pues es prácticamente imposible reunir en un hospedante todos los genes de resistencia, mientras que en el patógeno sí podrían reunirse todos los genes de virulencia posibles. Se supone que esto ha surgido en la naturaleza través de la evolución simultánea de hospedantes y patógenos tendiente a la supervivencia de ambos. En poblaciones naturales donde habría distintos genotipos del hospedante también existirían distintos genotipos del patógeno con diferentes grados de virulencia y se llegaría a un equilibrio. Al aumentar la superficie cultivada por el hombre con determinadas especies, y a su vez, de estas especies ciertos genotipos seleccionados, los patógenos sufren una presión de selección a favor del desarrollo de razas más virulentas. Luego se seleccionan cultivares resistentes que se difunden y producen un cambio en la población del patógeno y estos mismos cultivares resistentes se tornan susceptibles luego de algunas generaciones, por el cambio producido en el patógeno. Esto se hace más grave en regiones favorables para el desarrollo de epifítias (zonas subtropicales). Es por esto que la resistencia específica se conoce como no durable. Sin embargo se ha observado una correlación negativa entre virulencia y agresividad del patógeno. Al aumentar la virulencia generalmente disminuye la habilidad competitiva con otras razas y la vitalidad del patógeno. Es decir que disminuye la agresividad. Esto da lugar a que dentro de una reacción compatible se den infecciones más o menos graves. A veces se observa también infección heterogénea o sea distintos grados de infecciones considerando un mismo órgano. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 7 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. Por ejemplo, en trigo-roya se observa una escala de 0 a 4 para determinar el grado de infección (cuadro 4). Escala 0 1–2 3–4 4 Grado de infección inmune infección leve infección grave altamente susceptible Cuadro 4. Escala empleada para evaluar grado de infección en el complejo trigo roya. En cuanto al desarrollo de estos sistemas de genes correlativos se supone que surgieron por mutaciones y duplicaciones y se plantean dos modelos: Modelo 1 (cuadro 5) Huésped Patógeno Interacción r V Grave R V Leve R R1 R1 R2 R2 v v v1 v1 v2 Grave Leve Grave Leve Grave En un principio no habría virulencia en el patógeno ni resistencia en el hospedante Surge por mutación un gen de resistencia y la infección se hace leve Continúa así hasta que se establece un equilibrio Cuadro 5. Modelo 1 para el desarrollo de sistemas de genes correlativos. Modelo 2: supone más de 1 locus (cuadro 6) Huésped Patógeno Interacción r1r1r2r2r3r3 V1- V2- V3- Grave R1- r2r2r3r3 V1- V2- V3- Leve R1- r2r2r3r3 v1v1 V2- V3- Grave r1r1 R2- r3r3 v1v1 V2- V3- Leve r1r1 R2- r3r3 r1r1 r2r2 R3- V1- v2v2 V3V1- v2v2 V3- Grave Leve r1r1 r2r2 R3- V1- V2- v3v3 Grave No habría virulencia en el patógeno ni resistencia en el hospedante Surge por mutación un gen de resistencia y la infección se hace leve R1 pasa a r1 pues los genes R1 en ausencia del patógeno no tienen ventaja selectiva pues afectan al metabolismo Continúa así hasta que se establece un equilibrio Cuadro 6. Modelo 2 para el desarrollo de sistemas de genes correlativos. Por duplicación el modelo 1 se puede convertir en el modelo 2. Los genes r y los V serían los genes normales para el hospedante y el patógeno respectivamente, y los genes de resistencia y de virulencia, si bien tienen una ventaja selectiva, en ciertas condiciones afectarían el metabolismo normal, entonces, en ausencia del gen de virulencia, volvería a predominar el de no resistencia. En poblaciones naturales, se encontrarían en equilibrio los distintos genotipos del hospedante y el patógeno, pero en zonas de cultivos con baja variabilidad genética, se induciría el incremento de la frecuencia de ciertas razas con virulencia para el genotipo predominante. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 8 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. El investigador Loegering (1978), definió el concepto de AEGRICORPUS (cuerpoenfermedad). AEGRICORPUS: es la manifestación viviente de las interacciones entre hospedante y patógeno en un determinado ambiente. Se puede graficar de la siguiente manera (Figura 1): PLANTA (huesped) ENFERMEDAD AEGRICORPUS AMBIENTE PATÓGENO Figura 1. Esquema del Aegricorpus y sus interacciones. MEJORAMIENTO DE LA RESISTENCIA A ENFERMEDADES Resistencia NO ESPECÍFICA (horizontal, cuantitativa, a campo, general o poligénica). La mejora para este tipo de resistencia se considera muy importante para el control de enfermedades y plagas. Su mejora es dificultosa ya que involucra a poligenes y los métodos que se emplean son similares a los utilizados para mejorar otros caracteres, como por ejemplo el rendimiento (carácter determinado también por poligenes). Normalmente se utiliza SELECCIÓN RECURRENTE, a fin de lograr la mayor frecuencia en la población de genes para resistencia. La protección que otorga este tipo de resistencia es parcial, las plantas cuentan con cierto nivel de resistencia a muchas razas del patógeno, no se da una resistencia elevada, pero presenta la ventaja de que es durable en el tiempo. Resistencia ESPECÍFICA (también llamada resistencia vertical o cualitativa). En este caso se dan interacciones gen a gen. Entonces para el mejoramiento deben incorporarse a los cultivares genes mayores de resistencia que no sean vencidos por los genes de virulencia presentes en las razas del patógeno de la región en cuestión. Para realizar la introducción de un gen simple en un genotipo, el método más empleado es la RETROCRUZA (Figura 1). Se cuenta con un genotipo seleccionado, con características agronómicas destacadas y deseables, pero que no presenta un determinado gen de resistencia, por ejemplo, este genotipo es r1r1 y la resistencia está dada por R1. El gen de interés R1, está presente en una población, una línea pura, con baja aptitud agronómica, que se emplea como DONANTE del gen R1. Se realiza entonces una primera cruza entre el genotipo de interés agronómico (RECURRENTE, r1r1) y el DONANTE (R1R1) (Figura 2), para luego retrocruzar la descendencia que porta el gen R1 con el recurrente durante varias generaciones, hasta alcanzar la homocigosis práctica, momento en el cual se considera recuperado la mayor parte del genoma del genotipo recurrente. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 9 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. Esquema explicativo de la técnica de retrocruza para incorporar un gen dominante Donante R1R1 Recurrente r1r1 x R1r1 F = 0,5 Se retrocruzan las Plantas R1r1 por el padre RECURRENTE Todas las plantas presentan 50% del genoma del Recurrente y 50% del genoma del Donante (1º Retrocruza) R1r1 x r1r1 (Recurrente) ½ R1r1 x ½ r1r1 F = 0,75 Se descartan las plantas r1r1 (susceptibles) Se retrocruzan las Plantas R1r1 por el padre RECURRENTE Todas las plantas presentan 75% del genoma del Recurrente y 25% del genoma del Donante (2º Retrocruza) R1r1 x r1r1 (Recurrente) ½ R1r1 x ½ r1r1 F = 0, 875 Se descartan las plantas r1r1 (susceptibles) Se retrocruzan las Plantas R1r1 por el padre RECURRENTE Todas las plantas presentan 87,5% del genoma del Recurrente y 12,5% del genoma del Donante (3º Retrocruza) R1r1 x r1r1 (Recurrente) ½ R1r1 x ½ r1r1 F = 0, 9375 Se descartan las plantas r1r1 (susceptibles) Se retrocruzan las Plantas R1r1 por el padre RECURRENTE Todas las plantas presentan 93,75% del genoma del Recurrente y 6,25% del genoma del Donante (4º Retrocruza) R1r1 x r1r1 (Recurrente) ½ R1r1 x ½ r1r1 Se autofecundan F = 0, 9687 Se descartan las plantas r1r1 (susceptibles) Todas las plantas presentan 96,875% del genoma del Recurrente y 3,125% del genoma del Donante Descendencia ¼ R1R1 ½ R1r1 ¼ r1r1 Se descartan las plantas r1r1 (susceptibles) La descendencia de la autofecundación de estas plantas NO segrega, se seleccionan como la línea Recurrente mejorada. La descendencia de la autofecundación de estas plantas SI segrega, se descarta. Con este valor de F (0,9687), se puede considerar homocigosis práctica, y que la parte principal del genoma del recurrente se ha recuperado. Se concluye con las generaciones de retrocruza y se autofecunda para obtener los homocigotas R1R1 con un alto porcentaje del genoma del genotipo Recurrente. Figura 2. Esquema de retrocruza para la adición, a un genotipo de interés, de un gen dominante. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 9 Cátedra Genética y Mejoramiento Vegetal y Animal Unidad Temática 5: Mejoramiento Vegetal y Animal. Actualmente el método de retrocruza puede optimizarse enormemente mediante el empleo de algunos marcadores moleculares de ADN, que se han venido desarrollando a fin de poder detectar la presencia de los genes de resistencia sin necesidad de realizar continuas pruebas de inoculaciones con el patógeno a campo. Existen actualmente varios marcadores moleculares y se continúa trabajando para el desarrollado de otros nuevos, que permiten la identificación en laboratorio y en un corto tiempo, de la presencia de los genes de resistencia en la población de plantas provenientes de las retrocruzas. Una vez incorporados los genes mayores (o cualitativos) por retrocruza se puede realizar la mejora por: - Método Piramidal: consiste en reunir en un mismo genotipo un gran número de genes de resistencia, incluso se pueden agregar genes de resistencia a razas que aún no han aparecido en la zona. Este método presenta desventajas que limitan su uso, por una parte se requiere de gran cantidad de tiempo y esfuerzo para incorporar todos los genes en un genotipo, por otro lado, normalmente los padres donantes pueden presentan limitaciones agronómicas que hacen engorroso su empleo. Otra posible desventaja es que al lograr la piramidalización completa, el genotipo recurrente puede haber sido superado por nuevos genotipos con mejores características agronómicas. - Producción de Variedades multilíneas: consiste en incorporar genes de resistencia individuales a una misma línea. Luego se realiza una mezcla del material que estará formado por un grupo de isolíneas cada una de las cuales posee algún gen de resistencia. Por ejemplo a un mismo genotipo se incorpora mediante retrocruza y simultáneamente, el gen R1 por un lado; el gen R2 a otras plantas, el R3 a otras y el R4 a otras. Para obtener el cultivar multilínea se combinan en partes iguales las cuatro isolíneas generadas. Por este método es menor el tiempo requerido para obtener un cultivar mejorado, si lo comparamos con el método piramidal. Tiene la ventaja de que genera una mejor interacción entre hospedante y razas del patógeno, ya que provoca una menor presión de selección sobre el patógeno y reduce las posibilidades de dispersión. De todos modos requiere un gran trabajo y varios años para su obtención. - Empleo de ingeniería genética para incorporar genes de resistencia: este método permite generar plantas transgénicas a las que se les han incorporado genes de otras especies, que ellas son capaces de transcribir y traducir, y que les otorgan resistencia. Un caso muy conocido es el del maíz Bt, a este maíz se le incorporó un gen proveniente de una bacteria (Bacillus thuringiensis) que genera una proteína que resulta tóxica para un gran número de insectos Lepidópteros. Así cuando los gusanos comienzan a comer el tallo del maíz, mueren. Con esto se ha logrado disminuir el empleo de insecticidas sistémicos para el control de Diatraea saccharalis, plaga muy común en nuestra región. El mismo gen se incorporó en algodón, permitiendo reducir significativamente la cantidad de aplicaciones de insecticidas. BIBLIOGRAFÍA: 1- Allard, R.W. 1978. Principios de la mejora genética de las plantas. Omega, Barcelona. 2- Flor, H.H. 1956. The complementary genic Systems in flax and flax rust. Adv. Genet. 8:29-54. 3- Frey, K.J. 1982. Multiline breeding. Plant improvement and somatic cell genetic. Acad. Press. New York. 10: 43-71. 4- Grierson, D.; Covey, S.N. 1991. Biología Molecular de las Plantas. Acribia. Zaragoza. 5- Loegering, W Q. 1978. Current Concepts in Interorganismal Genetics. Annual Review of Phytopathology. 16: 309-320. 6- Márquez Sánchez. 1998. Genotécnia Vegetal. AGT Méjico. 3 Tomos. Elaborado por Ing. Agr. Adriana M. Bretón 10
