Clonación de DNA ¿Cómo clonar el genoma humano?
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Clonación de DNA • Cualquier fragmento de DNA lineal puede clonarse en un plásmido si los extremos son compatibles • Creación de nuevas moléculas: plásmido + DNA foráneo DNA genómico Vector Enzima (s) de restricción DNA ligasa ¿Cómo clonar el genoma humano? • Objetivo: obtener una colección de fragmentos de todo el DNA humano (Genoteca genómica) • Material: • DNA humano • Plásmido • Enzima de restricción y DNA ligasa • Bacterias y placas con antibiótico Clonación: digestión • • El DNA humano se corta con un enzima de restricción (ej.: EcoRI)) El DNA plasmídico se corta con el mismo enzima (EcoRI) DNA humano Plásmidos + EcoRI + EcoRI Fragmentos de DNA humano con extremos EcoRI Clonación: ligación • Los fragmentos de DNA humano y las moléculas de plásmido tienen extremos compatibles (EcoRI): ligación con DNA ligasa • Mezcla de plásmidos con DNA humano AATTCNNN AATTCNNNNNNNNNNNNNNNNG NNNG GNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAA NNNCTTAA + DNA ligasa Plásmido con fragmento 2 Plásmido con fragmento 1 Plásmido con fragmento 4 Plásmido con fragmento 3 Plásmido con fragmento 5 Clonación: transformación y amplificación • Los plásmidos pueden replicarse en el interior de las b t i y titienen genes d bacterias de resistencia i t i a antibióticos: tibióti amplificación y selección Vector recombinante E. coli Antibiótico Antibiótico Plásmidos con inserto idénticos al original: CLONES E. coli sin plásmido no crece Clonación: genoteca • Cada colonia contiene un solo tipo de plásmido con un trozo de genoma • Colección de clones: genoteca Pasos de la clonación 1. Aislar DNA • Tipos de vectores de clonación: 2. Usar enzimas de restricción para generar fragmentos de DNA Vector Vector linearizado Nuevo huésped p 3. Separar los fragmentos de DNA y usarlos para generar moléculas recombinantes 4. Introducción de la molécula recombinante p en un nuevo huésped • Plásmidos (inserto < 10 Kb) • Bacteriófagos (inserto < 20 Kb) • PACs (inserto ~100 Kb) • BACs (inserto ~200 Kb) • YACs ((inserto < 2 Mb)) ((sólo en levaduras) Identificación de genes con genotecas • La g gangrena g provoca la destrucción del tejido. j Clostridium perfringens produce un enzima que degrada colágeno • Problema: Identificar el gen que codifica ese enzima Negativo Positivo Uso de las genotecas • • Obtención de DNA de C. perfringens y construcción de g genoteca • Tamaño genoma: ~3.000.000 pb • Corte con EcoRI: ~750 fragmentos g de ~4.000 p pb Transformación de los plásmidos en E. coli y selección de colonias Gen colagenasa + EcoRI + EcoRI Genoma Clostridium 3 Mb ~750 fragmentos ~750 plásmidos Uso de las genotecas • Problema: ¿qué colonia de E. coli tiene el gen de la colagenasa? g • Análisis funcional: la colonia que tenga actividad colagenasa Colonias Degradación de colágeno Aplicaciones p tecnología g del DNA recombinante • La clonación L l ió d de un gen permite it obtener bt iinformación f ió acerca del gen, y desarrollar aplicaciones Tamaño del gen Presencia en otras especies S Secuencia i d de DNA Producción de proteína Métodos de diagnóstico Sistema del doble híbrido • Permite P it analizar li millones ill d de proteínas t í para id identificar tifi proteínas que interaccionen con la nuestra • Se basa en el uso de factores de transcripción con dos dominios en células de levadura • Expresión de cebo como fusión con dominio de unión al DNA • Expresión de la presa como fusión con dominio de activación Sistema del doble híbrido cebo AD DNA-BD presa gen de selección GAL UAS Análisis de una genoteca clones que expresan proteínas que interaccionan transformación plásmido cebo + plásmidos genoteca (3x106 clones) selección aislar plásmido presa secuenciar Interacción y función Determinación de rutas de señalización por doble híbrido • • Screening >presa >screening Problemas del doble híbrido • Detección de interacciones débiles o transitorias • Modificaciones M difi i post-traduccionales tt d i l no di disponibles ibl en levaduras • Proteínas de membrana Validación de interacciones • Transferencia f de proteínas a vectores y validación epítopo cDNA AD Vector presa Expresión levaduras Vector cebo Expresión levaduras V t cebo Vector b Expresión mamíferos/plantas V t presa Vector Expresión mamíferos/plantas Transfección Expresión mamíferos/plantas Co-inmunoprecipitación epítopo-1 Western blot epítopo epítopo-2 2 Biología de sistemas: Interactómica • Clonación de todos los genes de un organismo en vectores C de doble híbrido (como cebo y como presa) • Análisis de las interacciones de todos los genes • Determinación de rutas, genes de conexión entre rutas, actividad de nuevos genes Interactoma de C. elegans Interactoma Evolución molecular in vitro • ¿Cómo C mejorar las propiedades de un enzima natural? ? • DNA shuffling h ffli + selección l ió Quimeras génicas: nuevas propiedades Creación de enzimas con nuevas propiedades
