Clase 2 - Seminario

Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología
Diagnóstico bacteriológico
En general, el diagnóstico bacteriológico sigue el siguiente esquema, con pequeñas
variaciones dependiendo del tipo de muestra o bacteria a estudiar.
Toma de muestra
Observación en fresco (400X)
Observación de Coloraciones (1000X)
Siembra para aislamiento primario en medios generales, selectivos y/o diferenciales
Incubación en atmósfera, temperatura y tiempo adecuados
Observación de las Colonias
Identificación bioquímica y/o serológica
Pruebas de sensibilidad antimicrobiana
MEDIOS PARA AISLAMIENTO PRIMARIO
Permiten recuperar colonias aisladas de bacterias a partir de muestras clínicas (Primer
postulado de Koch) y su composición es muy variada según el uso que se les quiera dar.
En las colonias que desarrollan debe observarse las características de las mismas (color,
textura, tamaño, brillo) y los cambios producidos en el medio de cultivo (cambios de color,
difusión de pigmentos, hemólisis, etc).
A continuación se describen algunos de los medios de cultivos para aislamiento primario más
utilizados en bacteriología médica.
Agar sangre
Consiste en un agar usado como base al cual se le agrega un 5% de sangre humana, de
caballo o de carnero para transformarlo en un medio enriquecido que permite el crecimiento de
la mayoría de las bacterias causantes de enfermedades en el hombre. Sin embargo, su
principal uso se basa en que en ellos se puede detestar el tipo de hemólisis que producen las
bacterias alrededor de las colonias.
La hemólisis puede ser total o transparente (betahemólisis), parcial o verdosa (alfahemólisis) o
estar ausente (gammahemólisis).
Beta hemólisis
Alfa hemólisis
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Medio EMB (Eosina-azul de metileno)
Es un medio selectivo que permite el crecimiento de bacilos gramnegativos, principalmente de
la Familia Enterobacteriaceae, inhibiendo el crecimiento de las bacterias grampositivas.
También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración de las colonias si
los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa.
Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira dando lugar a
la aparición de colonias oscuras, de color rosado a verde brillante (Ej: Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter). Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras o
transparentes (Ej: Salmonella, Proteus, Pseudomonas).
Lactosa
positiva
Lactosa
negativa
Medio CLDE (Cisteína Lactosa Deficiente en Electrolitos)
Es un medio diferencial de aislamiento primario que permite el crecimiento de la mayoría de las
bacterias productoras de infecciones urinarias. Es diferencial porque aquellas bacterias que
utilizan la lactosa producen colonias amarillas (imagen de la izquierda) mientras que aquellas
que no utilizan la lactosa producen colonias incoloras (imagen de la derecha).
Lactosa
positiva
Lactosa
negativa
Medio TCBS (Tiosulfato Citrato Sales Biliares)
Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de bacilos gram negativos de la
familia Vibrionaceae, en concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios. Las colonias de Vibrio son
grandes, de color amarillo. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la Familia
Enterobacteriaceae.
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Medio de Chapman o agar manitol salado
Es un medio selectivo para estafilococos. Posee manitol y ClNa en altas concentraciones.
Permite detectar el uso del manitol como fuente de carbono ya que este metabolismo se
manifiesta como un cambio de color del medio de naranja a amarillo, mientras que las bacterias
que crecen en ClNa pero no fermentan el manitol no producen cambios en el medio de cultivo.
Neg
Pos
PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN
Son muy numerosas y su aplicación depende del tipo de bacteria a identificar. La selección de
cada una de ellas se realiza en base a la morfología colonial y la coloración de Gram de la
bacteria.
A continuación se mencionan algunas de las más utilizadas.
Prueba de la catalasa
Permite detectar la producción de la enzima catalasa que
desdobla al agua oxigenada en agua y oxígeno. Esta
actividad se pone de manifiesto cuando al enfrentar una
colonia bacteriana con una gota de agua oxigenada se
evidencia la formación de burbujas. Permite diferenciar
estafilococos (prueba positiva) de estreptococos (prueba
negativa).
-
Prueba de la Oxidasa
+
Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. Para
ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema
citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando
un producto coloreado fácilmente apreciable. Si el disco se pone de color rosado
oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo, Ej: Vibrio, Pseudomonas. Las
bacterias oxidasa negativas no producen cambios de color, Ej: Escherichia,
Proteus, Klebsiella, Salmonella, Citrobacter.
Test del triple azúcar-hierro
En este test se utiliza el medio de cultivo TSI y proporciona varios datos fisiológicos
importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la glucosa, la lactosa o
la sacarosa y si produce gas o ácido sulfhídrico. Pueden obtenerse los siguientes resultados:
a) Fermentación de glucosa. Los microorganismos capaces de fermentar la glucosa darán
lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio, haciendo que el fondo del tubo
aparezca de color amarillo y el pico de color rojo. Ej: Shigella.
b) Fermentación de glucosa y lactosa (o sacarosa). Los microorganismos capaces de
fermentar ambos azúcares darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH de todo el
medio, haciendo que tanto el fondo como el pico del tubo aparezca de color amarillo. Ej:
Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Vibrio.
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c) Incapacidad de fermentación de glucosa. Los microorganismos incapaces de fermentar
la glucosa no darán lugar a la formación de ácidos que bajen el pH pero utilizarán las
proteínas presentes bajando el pH por formación de aminas haciendo que el pico del tubo
aparezca de color rojo. Ej: Pseudomonas.
d) Producción de ácido sulfhídrico: Los microorganismos capaces de formar SH2 se
manifiestan por la aparición de un color negro en fondo del tubo debido a la formación de
sulfuro ferroso. Ej: Salmonella, Proteus, Citrobacter.
e) Producción de gas: Los microorganismos capaces de formar gas producen la aparición
de burbujas y/o la ruptura del medio de cultivo. Ej: Escherichia.
Glu+, Lac+ Gas+
Glu+, Lac-
Glu+, Lac-, SH2
Glu-, Lac-
+
-
Prueba de Bilis-Esculina
+
Esta prueba permite estudiar la capacidad de crecimiento de la bacteria en
presencia de sales biliares y la hidrólisis de la esculina, sustancia que al
hidrolizarse se une al hierro presente en el medio produciendo un color negro.
(Ej: Enterococcus) mientras que las bacterias incapaces e crecer en bilis o de
hidrolizar la esculina no producen cambios (Ej: Streptococcus agalactaiae)
Producción de pigmentos
Numerosas bacterias son capaces de producir sustancias que le confieren color a las colonias.
Por ejemplo: Staphylococcus aureus – amarillo; Pseudomonas – verdoso; Serratia - rojo
S. aureus
Pseudomonas
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Serratia