Comportamiento del tejido hemopoyético normal tratado con

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Comportamiento del tejido hemopoyético normal tratado con Ciclofosfamida
o en combinacion con un citoprotector (ETHYOL
)
Carmuega, Roxana - Aguirre, María Victoria - Romero, Margarita
Juaristi, Julián - Alvarez, Mirta - Zaninovich, Karina - Casco, Rafael
Piñeyro, Shirley - Testi, Julio - Brandan, Nora
Cátedra Bioquímica - INBIFAR - Facultad de Medicina - UNNE.
Moreno 1240 - (3400) Corrientes - Argentina.
E-mail: nbrandan@med.unne.edu.ar
INTRODUCCION
La rápida velocidad de renovación hace al sistema hematopoyético el principal blanco de la toxicidad
xenobiótica (1,2). Los xenobióticos pueden interferir con la capacidad proliferativa hematopoyetica y con el
complejo mecanismo de regulación de dicho sistema. Como consecuencia de ello, la toxicidad sobre la
hematopoyesis es limitante en los regímenes con radiaciones ionizantes o drogas citotóxicas (3). Actualmente
se disponen de drogas que ofrecen protección selectiva sobre los tres linajes hematopoyéticos: eritroideos,
mieloideos y linfoideos, de acuerdo a estudios preclínicos oncológicos ( 4, 5, 6). El amifostine es un aminotiol
fosforilado que ofrece protección a los tejidos normales de los efectos citotóxicos acumulativos de la
quimioterapia con preservación de los efectos citotóxicos sobre el tumor (7). Sin embargo, muy poco se sabe
respecto del efecto de este tipo de drogas protectoras en la cinética de las celulas progenitoras medulares
normales.
OBJETIVO
En este estudio se evaluó el efecto citoprotector de amifostine sobre los progenitores tardíos (CFU-E) de
médula ósea y bazo tratados con un citotóxico: Ciclofosfamida.
MATERIALES Y METODOS
Animales: Ratones isogénicos de la cepa swiss CF1 (26-28 gr , 8-10 animales/lote).
Agente citotóxico: Endoxan Asta (Labinca) ciclofosfamida 1 gr.
Agente citoprotector: Amifostine ETHYOL, WR2721, 25 mg (SIGMA Co).
Esquema de tratamiento: Ciclofosfamida (CYP) fue administrada en una única dosis vía intraperitoneal (200
mg/Kg), paralelamente en otro lote de animales se inyectó Amifostine 154 mg/kg (910 mg /m2) 30 minutos
previos a la inyección de CYP. Se obtuvieron células de médula ósea (MO) y bazo (Bz) a 0, 2, 5, 7, 10, 14, y
20 días posteriores a los respectivos tratamientos para los ensayos de clonación y corridas electroforéticas.
Clonación de progenitores hematopoyéticos : Células de médula ósea y bazo post tratamiento con CYP o
Amifostine/CYP fueron ensayadas para la formación de colonias hematopoyéticas. Para ello, 4 x105
células/ml se dispensaron en cápsulas de cultivo estéril con 1 ml del medio Dulbecco modificado por Iscove
(IMDM , SIGMA CO) conteniendo 0,8 % de metilcelulosa (SIGMA Co), 10% de suero fetal bovino (FBSFlow Lab) 1% albúmina (BSA SIGMA CO), 2-mercaptoetanol, transferrina- hierro a 37 °C en atmósfera
húmeda con 5% de CO2 (8), identificándose las colonias de CFU-E (> 8 cel) a las 48 hs.
Los ensayos se realizaron por triplicado con cultivos controles a cada día del esquema experimental. Los
resultados se expresan como la media (± SD).
Estudio electroforético en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE):
Para el análisis cualitativo de los perfiles proteicos intracelulares, 2 x 106 cel/ml de MO y Bz de pooles
celulares de los lotes con CYP o Amifostine/CYP fueron tratadas con buffer de lisis (TRIS-ClH 0.5 M, pH
6.8, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol al 10%) hervida durante 5 minutos.
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Las concentraciones proteicas se determinaron por el método de Bradford (9) . Se sembraron 20-25 µg de
proteínas en geles de poliacrilamida SDS-PAGE al 8%, corriendo simultáneamente proteínas de peso
molecular conocido (BIORAD USA) en un sistema de electroforesis horizontal tipo MINIPROTEIN II
ELECTROPHORESIS CELL BIORAD (USA), a 100 V durante 1 hora aproximadamente (10). Los geles se
tiñeron según el metodo standard con Azul Coomassie R-250, se decoloraron hasta visualización óptima de
las bandas con una mezcla de metanol, ácido acético, agua (3:1:3) y una vez secados fueron scaneados para
registro.
Cálculos estadísticos:
Los resultados fueron analizados utilizando el software INSTAT y PRISM Versión 2.0 (Graph Pad Software,
San Diego, CA, U.S.A.), considerando significativo un p<.05.
RESULTADOS
Cultivos de progenitores:
Se cuantificaron los progenitores eritroides maduros (CFU-E) en células de MO obtenidas post- tratamiento
in vivo con CYP, evidenciándose a los 5 días una disminución significativa del 63% respecto al control
(p<.001). a los 7 días se observo un aumento significativo por encima de los valores normales (p<.01)
disminuyendo carce a los valores control al día 14 post-tratamiento.
Cuando se trató con Amifostine 30 minutos antes de CYP, los progenitores tardíos (CFU-E) mostraron un
patrón diferente de respuesta en los tiempos intermedios; la máxima respuesta se evidencia a los 5 días (720 ±
31) sobre el control (118 ± 14), comenzando a disminuir drásticamente a partir del séptimo día, llegando a
valores por debajo del normal a los 10 días post-tratamiento. (Fig. 1).
Las CFU-E provenientes de Bz pretratados con CYP, no sufrieron modificaciones estadísticamente
significativas respecto al control hasta los5 días post-tratamiento en donde se observa un aumento respecto
del control (p<.01), con el tratamiento previo con Amifostine el numero de CFU-E se incrementó
gradualmente hasta alcanzar un máximo a los 7 días (651.16 ± 48.51 versus control 183.33 ± 12.05)
retornando a valores normales a los 10 días 108,66 ± 3,67. (Fig. 2).
Análisis de los perfiles electroforéticos
Se analizaron los perfiles de la expresión de proteínas en lisados celulares de MO y Bz tratados con CYP y
Amifostine/CYP a lo largo de 20 días.
En células de MO pretratadas con CYP; se observaron a los 2 y 5 días bandas nítidas de PM 14,3 kD y 43 kD,
en tanto una banda con PM de 68 kD fue identificada entre los 10 y 14 días, proteína que se encontró
débilmente expresada en el control (Fig. 3).
En el Bz se observaron 3 bandas de PM mayor a 92,5 kD en el control que no se reestablecen sino hasta el día
20, una banda con 43 kD de PM se expresó en todas las muestras pero fué mas intensa al segundo día (Fig.
4).
El análisis cualitativo de las corridas SDS-PAGE de lisados de médula ósea con Amifostine/CYP exhibieron
la expresión de varias bandas proteicas entre los PM 43 y 68 kD que se intensifican especialmente al día 2 y
5, al igual que proteínas de PM < a 14,3 kD que se debilitaron a los 10 días. En el rango del marcador de 20,1
kD se observó una banda al día 2 cuya expresión desapareció al día 5 (Fig 6).
En el lisado de los bazos con Amifostine/CYP se observaron varias bandas entre los PM 20,1 y 29 kD que se
expresaron al día 0, desaparecieron al día 2 y comenzaron a recuperarse al día 7, llegando a los 20 días como
al inicio de la experiencia. En el control se evidenció una proteína de 43 kD que aparecio nuevamente al día
20. Adicionalmente, un set de bandas próximas a 68 kD fueron evidentes al séptimo día (Fig. 7).
CONCLUSIONES
La administración de Amifostine previa a la del citotóxico induce protección de los progenitores eritroideos
en médula ósea, particularmente evidente con el aumento significativo a los 5 días de los progenitores
eritroideos tardíos (CFU-E).
Por el contrario, la falta del citoprotector coincide con la mayor depresión de los precursores eritroideos
tardíos a los mismos tiempos.
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En las células esplénicas el tratamiento con Amifostine previo a la CYP; incrementa drásticamente los
progenitores eritroideos maduros (CFU-E) 7 días después del tratamiento, permaneciendo luego cerca de los
valores normales; esto se explicaria por la migración de progenitores de MO a través del torrente sanguíneo
hacia Bz para su localización en un microambiente favorable para la hematopoyesis compensatoria.
En el análisis cualitativo de las SDS_PAGE Amifostine promueve la expresión de un set de proteínas tanto
en médula ósea como en tejido esplénico que no se evidencian cuando estos tejidos hematopoyéticos son
expuestos solo a la CYP. Estos resultados permiten presumir que Amifostine inhibiría la apoptosis en los
tejidos hematopoyéticos normales probablemente por inducción de la expresión transitoria de los factores de
transcripción NF-kB/Rel (68 KD).
Por lo expuesto, se infiere que Amifostine es un potente citoprotector en MO y tejido esplénico cuando son
tratados con una droga citotóxica promoviendo el aumento significativo de progenitores eritroideos tardíos
(CFU-E).
BIBLIOGRAFIA
1- Parchment R.E., Huang M., Erickson-Miller C.L. (1993) Roles for in vitro myelotoxicity tests in
preclinical drug development and clinical trial planning. Toxicologic Pathology 21, 214-250.
2- Deldar A. (1994) . Drug-induced blood disorders: review of phatogenetic mechanisms and utilization
of bone marrow cell culture technology as an investigative approach. Current Topics in Veterinary
Research 1, 83-101.
3- Deldar A., Sevens C.E. (1993). Development and application of in vitro models of hematopoiesis to
drug development. Toxicologic Phatology 21, 231-240.
4- Capizzi R (1996) A preclinical basis for broad-spectrum selective citoprotection of normal tissues
from cytotoxic therapies. Semin. Oncol. 23 (4 suppl 8): 2-17.
5- Foster N J. A, Siden R. (1997) Amifostine for protection for antineoplastic drug toxicity.
Am.J.Health Syst. Pharm. 54 (7) 787-800.
6- Glick J. (1994) Amifostine (WR2721) a selective systemic protector .Cancer Invest. 12 (suppl 1)
:20-1.
7- Capizzi R.L., Scheffler B.J., Schem P.S. (1993). Amifostine-mediated protection of normal bone
marrow from cytotoxic chemotherapy. Cancer 72 (suppl 11): 3495-3501.
8- Brandan N., Aguirre V., Carmuega R., Alvarez M., Juaristri J. (1997). Proliferative and maturative
behaviour patterns on murine bone marrow and spleen erythropoiesis along hypoxia. Acta Physiol
pharmacol et Therapeutica Latinoam, 2: 125-135.
9- Scopes R.K. Protein purification.Principles and practice. Second edition. Springer Verlag (1988).
10- Laemmli E.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227: 680 (1970).
Efecto de amifostine sobre CFU-E medular post-CPA
Efecto de amifostine sobre CFU-E esplenica post-CPA
800
***
700
N de CFU-E / 2 x 20 cel.
400
Bz (CPA)
Bz (CPA + AMI)
600
5
5
N de CFU-E / 2 x 10 cel.
MO (CPA)
MO (CPA+AMI)
***
500
***
300
***
**
200
400
300
**
200
***
100
500
**
**
100
0
0
2
5
7
10
Días post-tratamiento
Figura 1: Efecto citoprotector de Amifostine (200 mg/kg) sobre la cinética de recuperación
de progenitores eritroideos tardíos de Médula Osea. A los 2, 5, 7, 10 días post-inyección de CPA
(200 mg/kg). Los resultados expresan la media ± SD de 3 ensayos en lotes de 3 animales.
***p<.001
**p<.01
0
0
2
5
7
10
Días post-tratamiento
Figura 2: Efecto citoprotector de Amifostine (200 mg/kg) sobre la cinética de recuperación
de progenitores eritroideos tardíos de Bazo. A los 2, 5, 7, 10 días post-inyección de CPA
(200 mg/kg). Los resultados expresan la media ± SD de 3 ensayos en lotes de 3 animales.
***p<.001
**p<.01
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