Algunas técnicas de transformación:

TRANSFERENCIA GÉNICA EN ANIMALES
Por:
Patricia Narbón Fernández
Trabajo Final
Experto Universitario de Biotecnología Aplicada a los Alimentos
UNED
Profesoras Guía:
Dra. Estrella Cortés Rubio. Profesora Titular de Universidad. Área: Bioquímica y
Biología Molecular.
Dra. Gloria Morcillo Ortega. Profesora Titular de Universidad. Área: Biología
Celular.
Junio, 14 del 2008
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INDICE
1. Introducción, pag.3
2. Transferencia de ADN a células animales, pag.5
3. Vectores de transferencia génica, pag.5
4. Transfección de células somáticas animales, pag.8
5. Transgénesis en animales, pag.9
6. Transferencia génica por microinyección, pag.11
7. Transferencia génica con trasposones, pag.16
8. Transferencia génica con vectores virales, pag.19
9. Transferencia génica mediada por semen, pag.22
10. Transplante de núcleos y clones, pag.24
10.1. Clonación, pag.24
10.2. Métodos de clonación, pag.24
10.3. Clonación de la oveja Dolly, pag.30
10.4. Transferencia nuclear de células trasfectadas diploides fetales,
pag.31
10.5. Transferencia nuclear Honolulu, pag.32
10.6. Aplicaciones de la clonación mediante la técnica de transferencia
nuclear, pag. 33
11. Generación de animales knockout, pag.40
11.1. Generación de ratones knockout, pag.40
11.2. Condicional knockout, pag.42
11.3. Aplicaciones de las técnicas knockout, pag.43
12. Modelos de animales transgénicos, pag.45
12.1. Animales transgénicos como fábricas de proteínas: Vaca transgéncia
productora de hormona del crecimiento, pag.45
12.2. Animales transgénicos resistentes a mastitis: Vaca resistente a la
infección intramamaria, pag.48
13. Bibliografía, pag.52
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Introducción
Después de algunos problemas iniciales, el desarrollo y comercialización de
cultivos modificados genéticamente registró un crecimiento considerable, pero
los productos derivados de animales de granja modificados genéticamente no
han llegado a los principales sistemas de producción de alimentos. Aunque se
han insertado experimentalmente más de 50 transgenes diferentes en
animales de granja, estas iniciativas requieren todavía unos conocimientos
técnicos considerables y no son tan habituales como en el caso de las plantas.
Las investigaciones iniciales en la obtención de animales transgénicos de
granja han ido acompañadas también de perturbaciones manifiestas en la
fisiología, incluidas deficiencias en el proceso reproductivo. Estas experiencias
han suscitado problemas éticos en cuanto al bienestar de los animales y han
reducido ulteriormente el interés de los consumidores.
Hasta el momento, la perspectiva de alimentos obtenidos de animales
transgénicos de granja no ha sido bien recibida por los consumidores. Las
encuestas indican sistemáticamente que el público acepta de mejor grado las
plantas transgénicas que los animales transgénicos. La experimentación con
animales y su alteración es menos aceptable y tiene repercusiones más
amplias. Diversas culturas y religiones limitan o prohíben el consumo de
ciertos alimentos derivados de animales. Sin embargo, la ingestión o inyección
de ciertos productos farmacéuticos derivados de animales transgénicos parece
más aceptable para el público.
Se han llevado a cabo investigaciones con resultados muy satisfactorios sobre
peces modificados genéticamente, pero ninguno de estos peces es objeto de
comercio. En la mayoría de los casos se trata de especies utilizadas en
acuicultura en las que se han insertado los genes que regulan la producción
de hormonas del crecimiento con objeto de aumentar la tasa de crecimiento y
el rendimiento de los peces cultivados. Se han planteado cuestiones éticas
relativas al bienestar y a los efectos ambientales de estos peces modificados
genéticamente, pero también se ha sostenido que los peces modificados
genéticamente comparten muchos atributos de especies y genotipos de peces
exóticos seleccionados por medios convencionales, y que ambos casos
constituyen medios comprobados y aceptados de aumentar la producción en el
entorno acuático.
Dado que uno de los principales problemas para la obtención de animales
manipulados genéticamente viables y seguros radica en las técnicas de
transformación génica empleadas, este trabajo se ha centrado en el estudio de
las técnicas disponibles y su aplicación. Actualmente siguen presentándose
problemas en los animales manipulados genéticamente, algunos de los cuales
se citan a continuación:
-
Integración múltiple del transgen
Lugar de integración indeterminado
Mutilación y falta de expresión
3
-
Mosaicismo (germinal y somático)
Expresión específica/ectópica
Expresión variable
Expresión variable dentro de líneas (variegación)
Elevada mortalidad durante el desarrollo embrional inicial y tasas de
éxito de sólo el 1-3 por ciento.
De los animales transgénicos nacidos, es posible que los genes
insertados no funcionen como se esperaba, lo que frecuentemente da
lugar a anormalidades anatómicas, fisiológicas y de comportamiento.
En la medida en que se vayan perfeccionando las técnicas de transferencia
génica en animales, junto con otras técnicas del proceso igualmente
importantes (mejoramiento de los constructos), se podrán obtener mayores y
más seguras aplicaciones en las diferentes áreas en las que se ha venido
trabajando los últimos años:
-
-
Mejora de caracteres productivos
Resistencia a enfermedades
Modelos animales de enfermedades humanas (ratones knockout)
Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de las
proteínas de alto valor (proteínas terapéuticas): granjas farmacéuticas o
granjas moleculares
Donación de órganos a partir de animales transgénicos:
Xenotransplantes
Producción de alimentos más saludables a partir de animales
transgénicos en los que se varía la composición nutricional de los
animales y/o los productos que generan
Modificación genética de insectos vectores de enfermedades
Producción animal más limpia para el medioambiente: que puedan
digerir ciertas formas de fósforo vegetal (fitatos) que les permite crecer
más con raciones de menor calidad y con una eliminación menor de
fósforo en sus excretas (lo que representa menor contaminación
hídrica).
Controladores biológicos modificados: consiste en la mejora mediante
ingeniería genética de invertebrados depredadores o parasitoides que
han sido tradicionalmente usados como agentes de control biológico.
Otras aplicaciones: Corresponden a propósitos ornamentales o
estéticos. Se han incorporado proteínas fluorescentes de medusa en
peces de acuario o incluso en conejos, para hacerlos más atractivos o
generar hechos artísticos (“arte transgénico”).
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Transferencia de ADN a células animales
Las células animales pueden incorporar ADN por distintos métodos como
microinyección directa, electroporación, encapsulación de ADN en membranas
artificiales (liposomas) seguido de su fusión con membranas celulares,
vectores basados en virus, YAC o mediada por células germinales. En general,
el ADN introducido por cualquiera de estos métodos se integra en el genoma
del hospedador.
La transferencia de genes depende de la introducción de secuencias de ADN
en el núcleo de una célula somática, germinal, célula huevo fecundada o una
célula madre embrionaria, seguido de la integración del ADN en un sitio del
cromosoma.
Vectores de transferencia génica
Un vector de transferencia génica es el vehículo empleado para introducir ADN
en una célula u organismo.
Existen dos grandes grupos de vectores, virales y no virales. Los primeros
incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus tratando de
eliminar sus características patológicas y de adaptarlos a su nueva función
como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden aprovechar
la ventaja que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido
procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para optimizar
la función de introductores de material genético en las células que invaden.
Los vectores no virales siguen una estrategia de síntesis en lugar de
modificación. Parten de estructuras sencillas conocidas e intentan reconstruir
desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el transporte
efectivo de genes en el interior de la célula. Existen también vectores
biológicos no virales (bacterianos) como portadores de genes terapéuticos, pero
son los menos estudiados.
Fig1. Tipo de vectores y proceso esquematizado de obtención.
5
Las características de un vector ideal para poder adaptarlo luego a situaciones
concretas serían las siguientes:
-
Que sea reproducible
Que sea estable
Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño
Que alcance concentraciones elevadas (> 108 partículas/ml)
Que permita la transducción tanto de células en división como
quiescentes
Que posibilite la integración específica de gen
Que reconozca y actúe sobre células específicas
Que la expresión del gen pueda ser regulada
Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune
Que pueda ser caracterizado completamente
Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios
Que sea fácil de producir y almacenar a coste razonable
El vector es una parte importante en el sistema de transferencia génica, pero
el sistema consta de dos componentes: el vector (vehículo de transporte) y el
cargo (material a ser transportado). El cargo a su vez se subdivide en: el
efector (gen a introducir) y el soporte (los elementos que condicionan su
expresión).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmídico (ADN bicatenario y
circular), aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un
simple oligonucleótido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar
una cantidad elevada de material genético con capacidad de perpetuación en
el tiempo.
El efector que se utilice dependerá del efecto que se persiga. Si se pretende
compensar, sustituir o reparar un gen dañado, el efector debe ser una copia
del gen intacto o un elemento que permita su reparación. Si se pretende
inducir un efecto biológico concreto (eliminar específicamente un tipo de
células, bloquear la expresión de un virus, inducir una respuesta inmune…),
se pueden introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que
originen nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido.
El soporte es la base para el control de la expresión del transgen e incluye
distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el
promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de
transcripción. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulación de
la expresión génica. Se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
promotores específicos, que sólo son activos en un tipo celular concreto. De la
misma manera se pueden emplear promotores inducibles, que requieren la
presencia de un elemento concreto para ejercer su función. Éste puede ser un
agente de adicción exógena (control externo) o un agente determinado por
características fisiológicas especiales (como por ejemplo promotores activos
ante situaciones de hipoxia). Otros elementos del soporte que pueden ser
importantes dependiendo de la funcionalidad perseguida son los potenciadotes
y represores de los promotores, secuencias de aislamiento (insulators) que
impiden las influencias de secuencias reguladoras próximas, secuencias de
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integración (para permitir la inclusión del material exógeno dentro del genoma
de la célula hospedadora), secuencias de recombinación homóloga (para
permitir el intercambio de material genético con el genoma hospedador con
una región específica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el
material genético en el interior de un vector viral), secuencias
inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas
que sirven como coadyuvantes en las vacunas de ADN)
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material
genético transportado y de vencer todas las barreras biológicas hasta alcanzar
su destino final, el núcleo de la célula diana, donde tiene lugar la regulación
génica. También de ellos va a depender la vía de administración a utilizar.
En los casos de transferencia génica en individuos postnatales, el vector ha de
solventar barreras en su camino hacia su destino funcional. Entre estas
barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su
degradación y eliminación), el reconocimiento de la célula diana (generalmente
mediante un receptor específico), su unión a la membrana, su internalización
en la célula (normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como
la endocitosis), el escape de los sistemas de degradación intracelular
(lisosomas) y su entrada final al núcleo, donde debe desmantelarse para
permitir que el material genético que transporta gane acceso a su ubicación
final y a la maquinaria de transcripción.
Fig2. Puntos clave para regular la eficacia de un vector de transferencia génica
que se introduce en el individuo
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Transfección de células somáticas animales
La transfección de células somáticas es útil para el cuidado medico y
veterinario de enfermedades genéticas, y para otros propósitos terapéuticos o
de mejoramiento de animales.
La transferencia de genes a células somáticas puede hacerse en el laboratorio
(ex vivo) o directamente a las células en el cuerpo (in vivo). En la forma ex vivo,
se extraen células del individuo para ser transformadas (proceso por el cual se
transfiere exitosamente un gen a una célula) con el vector que contiene la
versión normal del gen. Este método tiene la ventaja de que la transferencia de
genes es más eficiente y permite la propagación de las células transformadas
para generar grandes cantidades. La desventaja es que sólo es utilizable para
el individuo específico del cual se extrajeron esas células, además de ser
costoso por la gran manipulación y control de calidad requeridos. En el
método in vivo se administra el vector (que contiene el gen normal) a los
individuos. Este método puede utilizarse con muchos individuos, lo que
disminuye su costo y la infraestructura necesaria, pero resulta complicado de
controlar y la eficiencia es mucho menor.
Fig. 1. Sistemas para transferir genes a células somáticas en individuos
Los vectores son los vehículos microscópicos que se utilizan para transferir
genes a las células, a continuación se exponen sus características y su
relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales, no virales y físicos.
Virales: El método más eficaz para llevar genes “sanos” a las células dañadas
es por medio de virus que han sido adaptados como vectores. Los virus son
útiles ya que pueden penetrar naturalmente las células, insertando en ellas su
material genético.
8
Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para
eliminar los genes virales que les permiten replicarse y causar enfermedad. A
estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y entre los más
utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus
adeno-asociados. También se han desarrollado poxvirus (especialmente el
virus de la vaccinia) para vacunas y terapias génicas. Actualmente, los
vectores virales son los más eficientes para transformar células, aunque no
carecen de desventajas: son de manufactura costosa, hay límites a la cantidad
de genes (es decir, la longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser
insertados en los vectores y que pueden llegar a desencadenar una respuesta
inmune (inmunogenicidad).
No virales: Básicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que
contiene el gen de interés directamente a las células o empacado dentro de
otras moléculas como son los liposomas (pequeñas vesículas de grasa que
pueden transportar sustancias al interior de las células). Los vectores no
virales son menos eficientes para transformar células, pero no tienen limites
para el tamaño del inserto (el tamaño del ADN que se va a inyectar), son
menos inmunogénicos y más fáciles de elaborar.
Físicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporación. Los
inyectores sin aguja utilizan alta presión para insertar el ADN en células de la
piel o en células en cultivo, mientras que la electroporación utiliza pulsos
eléctricos que abren temporalmente “agujeros” en las membranas de las
células, permitiendo insertar el ADN. Los métodos físicos aún son ineficientes
en la transformación y tienen un rango limitado de aplicación.
Los riesgos de la terapia génica continúan siendo difíciles de cuantificar. Por
ello cada ensayo debe comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de
la dosis de vectores que contengan los genes que se pretende insertar. Estos
riesgos tomaron una nueva dimensión en el otoño de 1999, cuando un joven
de 18 años murió cuatro días después de haber iniciado un tratamiento con
terapia génica. Los mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies
animales manipuladas genéticamente.
Transgénesis
La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño en un
genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a
todas las células en los organismos multicelulares. Generalmente, en
animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los
embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a
la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el
transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal
(gametos).
Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:
•
•
•
La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y
su regulación.
Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.
Estudiar la función de genes específicos.
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•
•
Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de
proteínas humanas.
La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia
génica.
La transgénesis se puede efectuar siguiendo dos estrategias comunes,
microinyección de zigotos y la manipulación de células embrionarias, las
cuales se describen brevemente a continuación:
1. Transgénesis por microinyección de zigotos
Desde que en 1982 se obtuviera un ratón transgénico, la producción de
animales transgénicas es cada vez más cotidiana, existiendo ya
animales transgénicos de las siguientes especies: ratón, rata, conejo,
cerdo,
vaca,
cabra
y
oveja.
La técnica se realiza, fundamentalmente por microinyección y se realiza
de la siguiente forma:
o
o
o
En la primera fase, se aíslan un número grande de óvulos
fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un
tratamiento hormonal para provocar una superovulación.
La fertilización puede hacerse in vitro o in vivo.
En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a
uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una
solución que contiene ADN.
En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras
que actuarán como nodrizas permitiendo la gestación hasta
término.
Por último, tras el destete de los recién nacidos, éstos se chequean,
para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén.
2. Transgénesis por manipulación de células embrionarias.
Una estrategia más poderosa para la transgénesis implica la
introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes
(células ES) o células embrionarias madres (células EM).
Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se
pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se
conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado
embrionario.
El ADN extraño se introduce en las células ES mediante diversas
técnicas, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas
en una blástula y ésta reimplantada en una hembra.
Con esta técnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de
éstas se consiguen animales transgénicos con aquellas quimeras que
hayan incorporado el transgén en su línea germinal
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El ganado transgénico que se emplea para producir proteínas terapéuticas,
debe contener en el ADN extraño de sus células, además del gen codificante de
la proteína, una secuencia o promotor que haga que se exprese dicho gen en
unas
determinadas
células
solamente.
Por ejemplo, si se quiere que la proteína se produzca junto con la leche, el
transgén se fusiona con una secuencia reguladora de una proteína de la leche,
con lo que la proteína sólo se formará en las células de glándulas mamarias.
Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo
una proteína humana, la alfa-antitripsina bajo la dirección del promotor ovino
de la beta-lactoglobulina. Dicha proteína se produce en una cantidad de 35
g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.
Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la
proteína C humana que controla la coagulación sanguínea y es necesaria para
los hemofílicos.
Además de estas técnicas existen otras alternativas que se describirán más
adelante, y algunas de las cuales son una combinación.
Transferencia génica por microinyección
•
Microinyección pronuclear: pequeñas cantidades del ADN de interés
(transgen) eran inyectadas en el pronúcleo de un embrión al estado de
dos células. Aunque ampliamente aceptada y utilizada en forma
rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco progreso para
mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%,
dependiendo de la especie considerada.
En la década del 80 ocurrió un importante avance en la tecnología de
animales transgénicos que marcó el curso de la investigación en este campo
por al menos dos décadas. Gordon y colaboradores describieron una técnica
donde el ADN desnudo fue inyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón
recientemente fertilizado, el que posteriormente se transfirió a hembras
receptoras sincronizadas. Este experimento demostró que era posible usar un
plásmido recombinante como vector para transferir genes foráneos
directamente hacia el embrión. El ADN inyectado de esta forma se integró en
el genoma y pudo ser heredado por la descendencia de los animales
transgénicos fundadores. La inyección de embriones al estado de una célula
fue clave para obtener una integración temprana del transgen, permitiendo al
ADN foráneo contribuir en el genoma de todas las células somáticas y la línea
germinal.
Generación de los ratones transgénicos:
En una primera fase se aíslan un número grande de ovocitos fertilizados, los
que se consiguen sometiendo a la hembras a un tratamiento hormonal para
provocar una mayor ovulación.
En una segunda fase los ovocitos recién fertilizados se manipulan uno a uno,
y con una micropipeta a modo de aguja se introduce una solución que
contiene ADN. El ADN purificado es inyectado directamente en el pronucleo
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masculino de un zigoto, utilizando para ello un micromanipulador acoplado a
una pipeta con presión negativa y otro manipulador a acoplado a una aguja de
inyección
Fig3. Instrumental para microinyección pronuclear
Fig.4
Fig.5
Fig. 4 y 5. La figura de la izquierda (4) representa un dibujo esquemático de
cómo se introduce el ADN por microinyección en el pronucleo del zigoto. A la
derecha (5) hay una foto tomada en tiempo real es la que se observa lo descrito
anteriormente.
En la tercera fase estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán
como nodrizas permitiendo el término de la gestación. Se implantan de 20-30
zigotos en el oviducto de una hembra semipreñada (recientemente apareada
con un macho vasectomizado. Alrededor de 19 días más tarde se nacen de 5-8
crías. Los animales transgénicos se identifican mediante análisis de PCR a
partir de ADN extraído de las colas de los ratones de tres semanas de vida. Los
transgénicos son verificados posteriormente por Southernblots.
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Fig.6. Implantación de óvulos transfectados e Identificación de ratones
transgénicos nacidos mediante la técnica de PCR
Los ratones positivos para la prueba PCR son cruzados con animales controles
para identificar a los fundadores, es decir, aquellos que tienen el transgen
insertado en su línea germinal.
La eficiencia de transgénesis con este método es menor al 5%. La integración
del transgen en el genoma del ratón es al azar y los niveles de expresión son
variables.
En ciertos casos la integración del transgen también ocurrió después de la
primera división del zigoto, lo que resultó en animales fundadores mosaicos.
Estos animales mosaicos aún transmiten el transgen a la descendencia pero lo
hacen a una frecuencia menor al 50%. Desgraciadamente, la eficiencia para
generar animales transgénicos utilizando esta tecnología es baja,
particularmente en animales de granja. La eficiencia de la inyección
pronuclear está controlada por una serie de factores como quedara
demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores en 1985, quienes
entregaron valiosa información sobre la integración de los transgenes y
permitieron establecer que la concentración y la forma (circular o linear) del
ADN eran los factores más críticos para una eficiente integración. No se
encontraron diferencias significativas cuando el pronúcleo femenino o
masculino era utilizado para la inyección, aunque este último es preferido por
ser más grande. Por otro lado, el cruzamiento de ratones híbridos (por ejemplo
C57BL x SJL) fue más exitoso en la producción de animales transgénicos que
las líneas consanguíneas (C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyección
de pronúcleos como un nuevo método para modificar el genoma de los
animales revolucionó la forma en que los investigadores pudieron analizar la
expresión de los transgenes y pavimentó el camino para la generación de los
primeros animales transgénicos de granja en 1985.
Desde entonces, la tecnología ha sido implementada con éxito en la mayoría
de los animales domésticos como en conejos, por Buhler y colaboradores en
1990, ovejas, por Wright y colaboradores en 1991, cabras por Ebert y
colaboradores en 1991, vacas por Krimpenfort y colaboradores en 1991 y
cerdos por Wall y colaboradores en 1990. Sin embargo, además de los
problemas asociados con la integración de los transgenes hay ineficiencias
asociadas con la recolección, cultivo de los huevos fertilizados y transferencia
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de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como el largo
período de gestación y el bajo número de animales por generación, sumado al
costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta adopción de
estas tecnologías, especialmente en los países menos desarrollados.
Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el
uso de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de
la hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la
eficiencia de conversión por Pursel y Rexroad en 1993. Estos estudios
mostraron los problemas de la inyección pronuclear con relación al control de
los niveles de expresión del transgen. Se encontró una gran variación de
expresión en las líneas de animales transgénicos generados, siendo ésta en
general muy pobre, especialmente si no todos los elementos reguladores del
transgen eran incluidos en la construcción genética (plásmido). Esto llevó a
que muchos investigadores dedicaran mayores esfuerzos a entender la forma
en que los transgenes se insertan en el genoma del animal y los factores que
afectan la expresión de los mismos. Esto explica por qué la mayoría de los
experimentos dirigidos a alterar la composición de la leche han sido realizados
principalmente en el ratón, aunque existen algunas notables excepciones tales
como la secreción de proteínas de valor terapéutico como el factor IX de la
coagulación en la leche de ovejas por Wright y colaboradores en 1991, el
activador de plasminógeno de tejido en la leche de cabras por Ebert y
colaboradores en 1991 y la lisozima humana en la leche de bovinos por
Krimpenfort y colaboradores en 1991. Sin embargo, dada la baja eficiencia de
esta tecnología, sumado a los costos involucrados, es que ha habido una
búsqueda constante por nuevas alternativas.
En términos generales, a continuación se presenta una gráfica con los niveles
de eficiencia de la técnica para diferentes especies de animales:
Fig.7. Niveles de eficiencia de la microinyección pronuclear para diferentes
especies de animales.
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- Microinyección de ADN en células embrionarias: manipulación de las
células madre embrionarias de ratón (ES cells) apareció como una potencial
solución para muchos de los problemas encontrados con la técnica de
microinyección pronuclear.
Transformación genética mediante recombinación homóloga en células madre
embrionarias (ES cells). El aislamiento de células madre embrionarias de
ratón, en 1989 por Thompson y colaboradores, abrió nuevas posibilidades
para estudiar la función génica en animales transgénicos. Las células madre
embrionarias se obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se
pueden mantener en cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la
presencia en el medio de cultivo de factores inhibitorios de la diferenciación.
Estas células pueden ser manipuladas in vitro vía recombinación homóloga,
permitiendo así alterar la función de genes endógenos. Las células así
modificadas pueden ser entonces reintroducidas en blastocistos receptores
contribuyendo eficientemente a la formación de todos los tejidos en un animal
quimérico incluyendo la línea germinal. Esta tecnología posibilita
modificaciones genéticas muy finas en el genoma del animal, tal como la
introducción de copias únicas de un gen. La incorporación de una copia única
de un gen en un sitio predeterminado del cromosoma tiene las ventajas de
permitir controlar el número de copias del transgen y se puede controlar la
inserción de este en un sitio favorable (transcripcionalmente activo) para su
expresión tejido-específica.
Utilizando esta tecnología ha sido posible anular la función de genes
endógenos del ratón mediante la integración de un marcador de selección, lo
que ha permitido la generación de varios cientos de ratones llamados knock
out que han servido como modelos de enfermedades genéticas en humanos y
como modelos para analizar la función de genes endógenos (Melton, 1994;
Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).
Fig.8. Representación de las técnicas de microinyección pronuclear y
microinyección de células embrionarias
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Transferencia génica con transposones
Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen
genes adicionales a parte de los necesarios para la transposición y están
dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta categoría se encuentran los
trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de
Drosophila, secuencias Alu de mamíferos, retrotrasposones…
CLASE I: MEDIANTE DNA
Elementos IS (Is1, IS2, IS3, IS30,
IS200, etc)
Transposones compuestos (Tn5, Tn10,
etc)
I.I PROCARIOTAS
Transposones de la familia Tn3
Bacteriófagos (Mu, lambda, P22, etc)
Sistemas de inversión
I.II. EUCARIOTAS
Elementos controladores del Zea mays
(Ac, Mu, Sm, etc)
Elementos P de Drosophila
CLASE II: MEDIANTE RNA
Superfamilia vírica
Retrovirus, LINE, Ty, ...
II.II EUCARIOTAS
Superfamilia no vírica
SINE Alu y B1 de mamíferos,
pseudogenes procesados derivados de
la polimerasa II
Fig.9. Clasificación de los elementos transponibles
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Fig.10. Estructura básica de los trasposones
Los trasposones son secuencias de material genómico que tienen la
capacidad del saltar fuera y dentro del genoma. Son capaces de
autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios dentro del
genoma (trasponerse o “saltar”). Pueden entrar en plásmidos y ser
propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la capacidad de ser
transferidos exitosamente en células y genomas extraños.
La ingeniería genética puede manipular estos trasposones para llevar a
cabo transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de
genes es la transferencia de material genético entre células y genomas que
pertenecen a especies no relacionadas, por procesos distintos a la
reproducción. Un ejemplo de ello es el uso de los trasposones de
salmónidos para la transferencia génica en vertebrados. Los trasposones
de vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mínimo un gen
único que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos repeticiones
terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de
20-30 p.b. de interacción con la trasposasa. La trasposasa interacciona
con estos sitios para cortar el trasposón, luego interacciona con secuencias
presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposón en el nuevo
locus. En vertebrados todos los trasposones que se han detectado están
inactivados por mutaciones. Sin embargo recientemente se ha obtenido un
trasposón activo de salmónidos mediante múltiple mutagénesis dirigida.
Dicho transposón denominado “Bella durmiente” o “Sleeping beauty” (SB)
se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como
vehículo de incorporación de nuevos genes y para inactivar genes en el
genoma por inserción.
17
Fig.11. Esquema de un procedimiento para integrar genes en células
usando trasposones.
18
Transferencia génica con vectores virales
Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de
un virus, tratando de eliminar sus características patológicas y adaptarlos
a una nueva función como transportadores de material genético
heterólogo. Pretenden aprovechar las ventajas que aportan los virus como
vectores naturales que han sufrido procesos de evolución complejos a lo
largo de millones de años para optimizar su función de introductores de
material genético en las células que invaden. Para modificar un virus y
transformarlo en un vector de transferencia génica en animales, el primer
paso es bloquear su capacidad de propagación eliminando los genes
responsables de su replicación. El segundo paso es la eliminación de parte
del genoma viral para crear espacio para introducir el material genético de
interés (gen o genes, más los elementos de control). Se han de eliminar
genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos que puedan
resultar tóxicos o perjudiciales para el individuo a manipular.
La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la
posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgen en el genoma de la
célula hospedadora. Por otro lado presentan desventajas como su falta de
especificidad celular en la mayoría de los casos, la limitación del tamaño
(debido a que han de empaquetarlo en la cápsida), su elevada
inmunogenidad y el riesgo biológico que conllevan (reconstitución de
partículas replicativas por recombinación, y oncogenidad inducida por
integración inespecífica.
Se han usado retrovirus y lentivirus como vectores para integrar
transgenes en genomas animales. Esta técnica se ha usado en ratones con
éxito y se ha extendido a gallinas, vacunos y suinos.
-
Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de
transducción en un gran número de tipos celulares, son capaces de integrarse
de forma estable en el genoma de las células que infectan sin expresar
ninguna proteína viral inmunogénica, y son relativamente poco patogénicos,
con excepción de algunos como el VIH. La mayoría de ellos derivan del virus
de la leucemia murina (MuLV).
En general, su principal limitación es que sólo pueden transducir eficazmente
células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo de preintegración
requiere la ruptura de la membrana nuclear. Hay un tipo de retrovirus, los
lentivirus, que si que pueden infectar e integrarse en células quiescentes,
como el VIH y SIV, pero el riesgo inherente al uso de los mismos limita su
aplicación.
Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca
estabilidad de las partículas y su baja tasa relativa de producción. Esto ha
sido parcialmente resuelto con la sustitución de la proteína de la envuelta por
la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la
obtención de títulos de hasta 109 p.i. /ml y estabiliza las partículas.
19
Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando
se quiere transducir selectivamente una población celular, se le incorporan
ligandos heterólogos o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas
especificidades. Son vectores que poseen proteínas quiméricas en la envuelta.
Contrario a la percepción de muchos, los primeros animales transgénicos
fueron producidos hace ya casi 30 años mediante la microinyección de ADN
viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de ratón (Jaenish y
Mintz, 1974). Los próximos intentos involucraron embriones de ratón
infectados con el retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que
resultó en la transmisión estable hacia la línea germinal (Jaenish, 1976). Esto
se logró reemplazando genes que no son esenciales para el virus por genes
heterólogos, aprovechando así la capacidad de los virus de infectar un amplio
espectro de células y con una gran eficiencia. Una de las grandes desventajas
de este método radica en que la integración del ADN se produce en diferentes
etapas del embrión en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra en
todas las células somáticas o en la línea germinal y por lo tanto no hay
transmisión del transgen a la descendencia. Además, los animales generados
por este método tienen a menudo más de un sitio de integración, lo cual
ocurre cuando más de una célula del embrión es infectada por el virus
(Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las líneas de ratones
transgénicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci conteniendo
el transgen y poder así aislar líneas con un sitio de inserción único.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN
foráneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita
muchos experimentos especialmente con secuencias genómicas humanas que
pueden superar ampliamente este tamaño.
-
Vectores Adenovirales
Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de
vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar
tumores en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos
celulares distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una
eficacia muy elevada. El genoma viral se mantiene episómico, lo que permite
una expresión genética transitoria.
Originalmente la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb.
Recientemente se ha conseguido eliminar casi todo el genoma viral,
manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las secuencias terminales,
rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha
denominado “vectores sin tripas” (gutless).
La eliminación de material genómico viral además de aumentar la capacidad
del vector de incorporar ADN, disminuye el riesgo de inducción de respuesta
inmune. La mayoría de la población ha sido infectada en algún momento por
adenovirus y presenta una respuesta inmune inicial.
Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta reproductividad con
títulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten ser
concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml.
Su falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias
de redireccionalidad. Quimeras que introducen ligandos específicos en
proteínas de la cápside y moléculas biespecíficas que reconocen tanto la
cápside viral como el receptor seleccionado.
20
Vectores de virus adenoasociados
Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patológicos. Son
pequeños virus sin envuelta con un genoma de ADN monocatenario, capaces
de infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división
como en su estado quiescente.
Pueden integrarse en la célula hospedadora en un lugar específico del genoma,
eliminando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja en la
carencia de respuesta inmune observada “in vivo”.
Tiene una reducida capacidad de transporte (4,5 kb) y su reproducción es
tediosa porque necesitan un virus de apoyo (adenovirus o herpesvirus), los
cuales son difíciles de eliminar completamente.
Originalmente se descubrió que al eliminar parte del genoma viral para
introducir el transgen se perdía la capacidad de integración específica.
Recientemente se ha descubierto que la proteína Rep78, en presencia de los
ITRs, es capaz de potenciar la integración específica en el genoma celular y
podría solucionar este problema.
La falta de especificidad celular ha sido solucionada empleando estrategias de
moléculas biespecíficas.
Fig.12. Vectores virales de transferencia génica
Vectores virales quiméricos
Consiste en la combinación de varios vectores para compensar las limitaciones
que tienen por separado, y aprovechar las ventajas más destacables que
poseen de forma individual. Un ejemplo es la quimera adenovirus-retrovirus,
en la que se utilizan dos tipos de vectores adenovirales: uno incorpora la
maquinaria de empaquetamiento retroviral, y el otro introduce el material
21
genético equivalente a un vector retroviral. Se aprovecha la eficacia de
transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos
vectores, transformando las células diana en productoras de vectores
retrovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar células vecinas
e integrarse en su genoma.
Transferencia génica mediada por semen
Consiste en la introducción de ADN foráneo en gametos masculinos antes
del proceso de fertilización.
Las células espermáticas están consideradas por algunos autores como
células inertes dado que no cuentan con la mayoría de la maquinaria
molecular y bioquímica que existe en las células somáticas para permitir la
replicación de ADN, la transcripción de los genes y la síntesis de proteínas.
Su morfología es particular, y se caracteriza por un compartimento
extremadamente reducido y un núcleo que contiene en ADN compactado a
modo de cromatina condensada, conectados a un largo flagelo. Estas
observaciones de la morfología llevan a la conclusión de que las células
espermáticas tienen como única misión actuar de vectores de su propio
genoma durante la fertilización. La primera evidencia de que las células
espermáticas de mamífero podían incorporar ADN foráneo cuando eran
incubadas en solución con estas macromoléculas
fue descrita por
Brackett et al. en 1971.
En 1989 Lavitrano y col. describieron la producción de ratones
transgénicos mediante inseminación artificial, utilizando semen que había
sido incubado con ADN exógeno. Las células espermáticas habían
incorporado ADN plasmídico. La generación F1 contenía el ADN exógeno.
La transferencia génica mediada por semen en vertebrados se ha
desarrollado y sufrido muchos cambios en los últimos años. La incubación
de las células espermáticas con ADN foráneo seguida de fertilización in
vitro o in vivo ha generado conejos, cerdos, ratones, ovejas, vacas, peces,
pollos transgénicos. La definición y el establecimiento de los protocolos
según la especie a transformar es y será un tema valioso en biotecnología.
Una ventaja de la transferencia génica mediada con semen frente a la
microinyección, es que la segunda requiere manipulación individual de los
embriones, mientras que con la segunda se pueden transformar
genéticamente un alto número de embriones en un solo paso. Esto es
particularmente interesante cuando se quieren obtener especies acuáticas
transgénicas.
Existen investigaciones que sugieren que el control y captación del ADN
exógeno por parte de las células espermáticas de mamíferos está altamente
regulada y es muy específica. De hecho, el fluido seminal antagoniza
fuertemente la unión de ADN foráneo y bajo condiciones normales es una
fuerte protección de las células espermáticas contra el ADN foráneo.
22
En el caso de animales domésticos, incluyendo vacuno y cerdos, al llevar a
cabo inseminación artificial a menudo se incorpora ADN foráneo mediante
transferencia génica mediada por semen. El semen recién recolectado de
los animales donadores se lava repetidas veces para eliminar el plasma
seminal
mediante centrifugaciones secuénciales.
La suspensión de
células espermáticas es incubada con ADN plasmídico foráneo diluido en
un medio apropiado.
La incorporación de ADN en células espermáticas mediada por complejos
ADN-lisosomas ha demostrado afectar la motilidad de los espermatozoides,
y a medida que aumenta la concentración de ADN disminuye el grado de
fertilización in vitro.
Técnicas alternativas se han desarrollado para una mejor incorporación del
ADN foráneo. Para aumentar la incorporación de ADN por las células
espermáticas, detergentes no polares, como tritón y tween, que
desestabilizan la membrana espermática podrían ser usados. Se han
obtenido
resultados
similares
mediante
el
congelamiento
y
descongelamiento.
Existe un método llamado “Integración mediada por restricción enzimática”
(REMI). Esta técnica emplea un ADN lineal derivado de un plásmido por el
corte con una enzima de restricción que origina un extremo cohesivo en
uno de los extremos. El ADN foráneo es introducido, junto con la enzima
de restricción en las células espermáticas por lipofección o electroporación.
El enzima de restricción corta el ADN viral en los sitios que permiten la
integración del ADN foráneo mediante el emparejamiento de los extremos
cohesivos.
Otro método alternativo es la inyección directa del esperma tratado e
incubado con el ADN foráneo en el citoplasma del oocito, método conocido
como “Inyección intracitoplasmática de espermatozoides” (ICSI). La ICSI
fue exitosamente utilizada en ratones para transferir largos fragmentos de
ADN.
Para algunas especies se ha descrito el método de la incorporación de ADN
por electroporación al esperma incubado en una solución isosmótica que
contiene el ADN foráneo. Es el caso de las células espermáticas de los
peces, con las que se han realizado con éxito el desarrollo de estas
técnicas.
Una última estrategia es la incubación de las células espermáticas con el
ADN foráneo y anticuerpos monoclonales (mAb C). El anticuerpo es una
proteína básica que se une al ADN por interacciones iónicas, permitiendo
al ADN foráneo a unirse específicamente al esperma. Esta proteína
interacciona con un antígeno de membrana de la célula espermática de
todas las especies con las que se ha experimentado, incluyendo el ratón, el
cerdo, el pollo, la oveja y el humano.
Según Lavitrano et al. (2003), SMGT es altamente eficiente y relativamente
barato, y puede ser usado en especies resistentes a la microinyección.
23
El uso de espermatozoides como vehículos no invasivos para transferir
ADN foráneo a oocitos durante fertilización in vitro ha proporcionado una
nueva alternativa para la generación de animales transgénicos.
Transplante de núcleos y clones
10.1. Clonación
Las técnicas para llevar a cabo clonación celular artificial requieren un
proceso de elaboración o de manipulación que permite obtener copias
idénticas o casi idénticas de las células madre o progenitoras utilizadas. Si el
producto o embrión se transfiere a un útero, se produce la implantación en el
endometrio y se desarrolla un nuevo ser (clonación reproductiva). Pero si se
transfiere a un medio de cultivo, el embrión dará origen a células madre
embrionarias con la potencialidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de
célula adulta (clonación terapéutica).
10.2. Métodos de clonación
1. Partición. En esta técnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de
preimplantación. A partir del embrión seleccionado, se toman mitades o
secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelúcidas
naturales o artificiales.
A continuación, se efectúa la implantación del producto en el endometrio. El
número máximo de células del embrión, no puede ser superior a 8, porque a
partir de este momento, se inicia la expresión del genoma embrionario. Los
individuos obtenidos son prácticamente idénticos entre sí, aunque diferentes a
los progenitores, por lo cual se considera que son el equivalente de los gemelos
monocigóticos. Esta técnica, empleada por Wilmut en 1999, se ha seguido
ampliamente para la clonación de animales de granja. Como ejemplos de esta
técnica están las ovejas Megan y Morag, del Roslin Institute obtenidas en el
2000.
2. Clonación por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT:
Somatic Cell Nuclear Transfer). Esta técnica se basa en la habilidad de
inyectar o fusionar óvulos carentes de núcleos con núcleos diploides derivados
de células somáticas en cultivo. Estas células pueden ser transfectadas de
manera estable y proporcionar cientos de animales idénticos en una
generación.
La transferencia nuclear se describió por primera vez en 1952 en anfibios y
consistió en extraer el material genético de un ovocito para posteriormente
introducirle el material genético de una célula del animal a clonar. Los
trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que los núcleos de
células al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo
embrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a
partir de estas células.
En la década de los ochenta se realizaron exitosamente transferencias
nucleares en la mayoría de los mamíferos como conejos (Stice y Robl, 1988),
cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas
(Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por
24
medio de la disociación de blastómeros embrionarios (células embrionarias no
diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear.
Sin embargo, los intentos por realizar transferencia nuclear con células más
diferenciadas fueron infructuosos, lo que llevó a pensar que el ADN de células
diferenciadas no podía reprogramarse, surgiendo entonces el dogma de que el
proceso de diferenciación celular era irreversible. Este dogma se derrumbó el
27 de febrero de 1997, fecha en que Ian Wilmut y sus colegas del Instituto
Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la revista Nature cómo habían
creado a la oveja Dolly .
Fig.13. Dolly: El primer mamífero clonado por transferencia nuclear desde una
célula diferenciada.
Dolly fue el resultado de la fusión de un núcleo procedente de una célula
mamaria extraída de una oveja adulta con un óvulo al que previamente se le
había extraído el material genético (proceso conocido como enucleación). El
equipo escocés demostraba así que las células adultas y especializadas podían
ser reprogramadas.
La etapa clave de este proceso fue la coordinación del ciclo celular de la célula
receptora y el de la célula donante de núcleos que se logró mediante la
deprivación de suero de estas últimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col.,
1997). La deprivación de suero, previo a la transferencia nuclear, induce a las
células a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto celular
o quiescencia (G0/G1 en el ciclo celular), el cual potenciaría el desarrollo
embrionario, permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo
donante (Campbell y col., 1996).
Los requisitos mínimos para la SCNT incluyen el uso de dos tipos de células:
somáticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los núcleos de
células somáticas de individuos postnatales se transfieren dentro de oocitos o
de cigotos enucleados. Esta técnica tiene la ventaja que permite conservar el
genoma durante la diferenciación celular y la capacidad del citoplasma celular
25
para reprogramar la actividad génica y aumentar la redireccionalidad de la
diferenciación celular. Sin la aplicación de estos dos principios, la clonación
no es posible (Gurdon JB, 2003).
Para clonar a un ser vivo mediante SCNT, se extrae el material genético de
ambos tipos de células y, a continuación, se inyecta el núcleo de la célula
somática que se desea clonar (donante), dentro del oocito previamente
enucleado (receptor). El transplante de núcleos somáticos dentro de oocitos
enucleados tiene como fin reproducir los procesos bioquímicos y fisiológicos
que, de manera natural, se desencadenan durante la fertilización.
Vale entonces, en este orden de ideas, establecer una comparación entre la
fertilización y la clonación.
Durante la fertilización, el primer evento que ocurre es la sincronización de los
pronúcleos masculino y femenino. Cuando el espermatozoide atraviesa la
membrana plasmática del oocito, su núcleo se encuentra en la etapa G0 del
ciclo celular, mientras que el núcleo del oocito está detenido en la metafase de
la segunda meiosis. Los oocitos recientemente ovulados presentan una elevada
concentración de Factor Promotor de la Maduración (siglas en inglés MPF),
una proteinquinasa que induce la ruptura de la membrana nuclear y la
condensación de los cromosomas, motivo por el cual pueden hacer su ingreso
al núcleo ciertos factores citoplasmáticos que son necesarios para la
replicación del ADN (Wilmut I. 2003). Los dos pronúcleos se llevan entonces a
la etapa S del ciclo, caracterizada por una síntesis activa de ADN. La
reanudación de la segunda meiosis ocurre como consecuencia del aumento
cíclico de [Ca2+] intracelular, que provoca a su vez la inhibición de las dos
subunidades constitutivas del MPF -ciclina B y cdc1- con el descenso
consecuente en la actividad del MPF (Wakayama T , 1998, Vallejo J, 2003).
Cuando, en la clonación, se introduce el núcleo de la célula somática donante
en la célula receptora u oocito, se efectúa un proceso similar de sincronización
o reprogramación del ciclo celular, con la finalidad de que ocurra un
acoplamiento fisiológico entre el núcleo y el citoplasma. La reprogramación del
ciclo celular, o lo que es lo mismo, la reprogramación nuclear, son términos
que describen los cambios en la actividad génica inducida experimentalmente
por el transplante de un núcleo dentro de un medio citoplasmático diferente.
La reprogramación es un requisito indispensable para el éxito del
procedimiento, pues permite que la expresión génica de la célula somática sea
la apropiada para un desarrollo embrionario normal (Campbell KHS 1996,
Hwang WS, 2004). Esta reprogramación se efectúa en el tiempo transcurrido
entre la fusión núcleo-citoplasma y la activación del producto resultante
(Hwang WS, 2004).
Si se transplantan núcleos de células somáticas, parcial o totalmente
diferenciadas, dentro de oocitos enucleados de anfibios o de mamíferos en
metafase de la segunda meiosis, se podrán obtener blastocistos, a partir de los
cuales se formará un amplio rango de tejidos y de tipos celulares (Gurdon JB,
2002).
El proceso de sincronización o reprogramación se efectúa mediante el estímulo
de la entrada de Ca2+al oocito, ya sea con un impulso eléctrico suave o con la
utilización de ionomicina (Campbell KHS, 1996., Gurdon JB, 2002) o
puromicina (Hwang WS, 2004).
26
El núcleo de la célula somática donante no debe haber iniciado o completado
la replicación del ADN, para que el cigoto pueda tener una ploidía o
complemento cromosómico normal. Si se activa el oocito, y se le permite entrar
a su primer ciclo celular, la actividad del MPF caerá y no ocurrirá la ruptura
de la membrana nuclear después de la transferencia del núcleo de la célula
donante. Así las cosas, el núcleo determina si habrá o no replicación del ADN,
de modo que pueda esperarse una ploidía normal -necesaria para un normal
desarrollo- en todos los estados del ciclo celular de la célula donante (Wilmut
I. 2003). Se considera entonces que el oocito es un receptor universal, pues no
sólo provee un medio apropiado para el núcleo de la célula donante en
cualquier estado del ciclo sino que, independientemente de éste, tiene la
capacidad para actuar sobre la estructura y la función de la cromatina del
núcleo somático, de modo que lo lleva de nuevo a un estado de
totipotencialidad (Wilmut I. 2003, Betts DH, 2001).
Al aplicar la técnica de la transferencia nuclear, no sólo se debe procurar
mantener una ploidía normal en el producto formado, sino también evitar la
destrucción de la cromatina. Por este motivo se han hecho investigaciones
sobre la evaluación de la técnica, cuando se utilizan células donantes en
diversas etapas del ciclo celular (G1, S, G2, M), y como células receptoras,
oocitos en metafase de la segunda meiosis. (Campbell KHS. 1996, Wakayama
T, 1999, . Kasinathan P, 2001). Como células somáticas donantes, al principio
se utilizaron las células quiescentes en fase G0, que habían abandonado el
ciclo celular en fase G1 y, que, por tanto, tenían un complemento cromosómico
diploide. Como ejemplo de células en fase G0 se encuentran células del
cúmulus, células de Sertoli y neuronas, aunque también se pueden obtener
artificialmente en un medio de cultivo, mediante la deprivación de factores de
crecimiento (Kühholzer B,2000). Aunque estas células son menos activas en la
transcripción y, además contienen poblaciones distintas de ARN mensajero
(ARNm) que las que se hallan en fase G1, se prefirieron, pues sus mismas
características, de alguna manera facilitan la acción de los factores
citoplasmáticos del oocito necesarios para modificar la expresión génica del
embrión, y, por tanto, la reprogramación nuclear (Wilmut I. 2003, Campbell
KHS 1996). También se han utilizado células somáticas donantes en fases G1
(Kasinathan 2001, Piotrowska, 2000), G2 (Ono Y, 2001)Lai y M (L, Macháty Z,
2001).
27
Se ha obtenido una notable eficiencia en el desarrollo de los embriones así
clonados hasta el estado de blastocisto, cuando el núcleo inyectado se
encuentra en fase M (Wakayama T 1998, Li X, Li Z, 2003). En cualquier caso,
una clonación exitosa requiere reprogramar el núcleo de la célula somática
donante, debido a que la cromatina ha sufrido previamente transformaciones
epigenéticas incompatibles con el desarrollo embrionario, que incluyen la
desacetilación de las histonas y la metilación del ADN.
En el 2004 Hwang obtuvo células madre embrionarias a partir de blastocistos
humanos. El éxito de su procedimiento radicó en que el tiempo destinado a la
reprogramación celular fue de unas pocas horas, en contraste con la
metodología utilizada en experimentos con otras especies de mamíferos
(Kühholzer B 2001). Sin embargo, no siempre la reprogramación nuclear
ocurre de modo satisfactorio.
Así hay informes de hallazgos de embriones clonados a partir de células
somáticas donantes, que fracasan en la reactivación de genes claves para el
desarrollo embrionario normal (Bortvin A 2003 ). En estos embriones se
pueden expresar precozmente genes específicos de las células donantes (Gao S
2003) , y, adicionalmente, presentar patrones aberrantes de metilación del
28
ADN en el trofoectodermo (Rhind S 2003, Dean W 2001) , así como
mosaicismo (Rhind S 2003).
Por otra parte, las células somáticas, a lo largo de las sucesivas divisiones
mitóticas sufridas in vivo, han perdido parte de los extremos de los
cromosomas, denominados telómeros. Los telómeros son repeticiones cortas
en conjunto (tándem) de ADN, que se replican mediante la acción de la enzima
telomerasa. Se ha encontrado que variables como la longitud de los telómeros
y la actividad de la telomerasa están significativamente disminuidas en las
células somáticas donantes, cuando se comparan con las células madre
embrionarias como fuente donante de núcleos. Debido a que los telómeros
desempeñan un papel estabilizador del ADN, su acortamiento progresivo
puede incidir, tanto en los procesos de envejecimiento celular, como en la
aparición de anormalidades cromosómicas, espermatogénesis defectuosa,
apoptosis aumentada y proliferación celular disminuida en médula ósea, bazo
y testículo, en animales clonados a partir de células somáticas donantes(Betts
DH , 2001).
Es claro entonces que el estado de diferenciación de la célula donante afecta
directamente la eficiencia de la clonación, y en tal sentido se considera que las
células madre embrionarias ofrecen ventajas cualitativas sobre las células
somáticas como posibles donantes en la técnica de transferencia nuclear.
A pesar de los éxitos sucesivos obtenidos en la clonación de células adultas, la
SCNT dista mucho aún de ser considerada una técnica eficaz. En primer
lugar, muchos embriones clonados mueren inmediatamente después de la
implantación, o bien, a lo largo del desarrollo prenatal. También se ha
observado, que si bien algunos individuos sobreviven hasta el término de la
gestación, mueren prontamente debido a un amplio rango de diversas
entidades. Si logran sobrevivir, presentan una talla corporal y un tamaño de la
placenta mayores que lo normal, obesidad, así como defectos en riñones,
corazón, hígado, pulmones y cerebro.
Hasta hace poco tiempo se desconocía cuál era la razón biológica y cuáles los
problemas técnicos causantes de tales fracasos. En el caso de primates no
humanos, como los monos Rhesus macacus, los intentos de clonación han
fallado, debido a que, durante la enucleación de los oocitos no fertilizados previa a la transferencia nuclear- se removían ciertas proteínas necesarias
para la organización normal del huso mitótico, como las proteínas motoras de
los microtúbulos y del centrosoma.
La dificultad fue en apariencia resuelta por Hwang y su equipo de
colaboradores32, quienes recientemente obtuvieron blastocistos humanos.
Ellos extrajeron el complejo ADN-huso mitótico inmediatamente después de la
aparición del primer cuerpo polar, a través de un orificio en la zona pelúcida,
en lugar de aspirarlo con una pipeta de vidrio, tal como es descrito por otros
autores.
En especies de mamíferos como perros, conejos, cerdos, caballos, gatos y seres
humanos, el éxito de la clonación ha sido altamente dependiente de la
disponibilidad de tecnologías especie-específicas, que incluyen el cultivo, la
activación, la micromanipulación y la transferencia de huevos y embriones a
receptores. Es así como en la aplicación de la SCNT en cerdos, si se efectúan
29
simultáneamente los procesos de fusión núcleo-citoplasma y activación del
producto, se obtienen resultados satisfactorios.
En contraste, cuando se utiliza el mismo proceso en bovinos y en seres
humanos, los porcentajes de fusión y de clivaje o segmentación son muy bajos
y no se forman blastocistos. Por tanto en estas especies, parece ser necesario
un mayor tiempo de reprogramación entre fusión y activación con el fin de
obtener un número significativo de blastocistos. Por otro lado, el tipo de
sustrato energético añadido al medio de cultivo (fructosa en lugar de glucosa)
también parece ser un factor determinante para la formación de blastocistos
en bovinos y en seres humanos.
3. Paraclonación. Consiste en inyectar núcleos de células madre
embrionarias en cultivo, dentro de oocitos enucleados y, a veces, de cigotos
nucleados. Los blastómeros se obtienen a partir de varias fuentes como la
masa celular interna o el trofoectodermo de embriones preimplantados y sus
núcleos son transferidos dentro de oocitos enucleados6. Los individuos
obtenidos son casi idénticos entre sí, aunque diferentes a los padres del
embrión que aportó el núcleo transferido. Se ha demostrado que la
supervivencia de los clones formados a partir de células madre embrionarias
en el instante del nacimiento o hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces mayor
que en los derivados de células somáticas.
Por otra parte, los clones derivados de células madre embrionarias tienen
mejores posibilidades de reactivar completamente genes claves para el
desarrollo embrionario -tales como oct4 y 10oct4- y así constituir una
población de células verdaderamente totipotenciales. Sin embargo, las células
madre embrionarias, aunque requieren un menor grado de reprogramación
que las células somáticas, presentan una elevada inestabilidad epigenética en
cultivos in vitro. La inestabilidad se refleja en una expresión aberrante de la
huella genética, de modo que, cuando estas células se utilizan como donantes
para la clonación reproductiva, el fenotipo fetal y placentario de los clones,
exhibe graves patrones de anormalidad. Sin embargo, cuando se emplean
como fuente de núcleos para la clonación terapéutica, en apariencia no ocurre
este error, pues, durante la reprogramación, se seleccionan tan sólo las
células competentes.
10.3. Clonación de la oveja Dolly
Se aislaron las células de la glándula mamaria de una oveja adulta. Se
aislaron los ovocitos de otra oveja adulta, y se eliminaron los núcleos
haploides por micromanipulación. Se fusionaron las células de ambas ovejas
por electroporación y se mantuvieron en cultivo 6 días antes de su
implantación en el útero. Tras 150 días de gestación nació Dolly.
30
Fig.14. Esquema representativo de las etapas que llevaron a la creación de la
oveja Dolly mediante la técnica de transferencia de nuclear una célula
somática diferenciada.
La tasa de éxito es de 1 de 227
10.4. Transferencia nuclear de células transfectadas diploides fetales
En primer lugar se aíslan células diploides fetales y se realiza una transfección
estable con un vector que contenga el gen de interés y un promotor que dirija
su expresión. El promotor puede dirigir la expresión dentro de algún tejido
específico de interés, o para determinada etapa del desarrollo del animal. Por
otro lado se aíslan ovocitos y se les elimina el núcleo haploide. A continuación
se fusionan las membranas, y la célula resultante se implanta en un útero
para su desarrollo. Transcurrido el tiempo de gestación el resultado es un
animal clónico transgénico.
31
Fig.15. Fusión celular inducida por un pulso de electricidad
10.5. Transferencia nuclear Honolulu
La técnica de transferencia nuclear Honolulu utiliza la microinyección para
generar células diploides. La activación in vitro del ovocito tiene lugar
mediante su incubación en un medio sin calcio que contiene estroncio y
citocalasina B para prevenir la formación del cuerpo polar.
La tasa de éxito es 3 de 100.
32
Fig.16. Transferencia nuclear Honolulu
10.6. Aplicaciones de la clonación mediante la técnica de transferencia
nuclear
El estado del arte en la clonación ha permitido su empleo en dos direcciones
claramente definidas: La clonación con fines reproductivos y la clonación con
fines terapéuticos. La primera apunta a duplicar seres vivos completos,
mientras que la segunda promete convertirse en una alternativa para prevenir
y tratar ciertas enfermedades, así como para el reemplazo de tejidos y órganos
lesionados.
33
Clonación terapéutica. Las células madre o troncales son células
pluripotenciales de gran tamaño que, después de experimentar un proceso de
diferenciación, se especializan en una direcciónfuncional determinada, hacia
una gran variedad de tipos celulares.
Las células madre se pueden obtener en dos formas diferentes:
1. A partir de células de la masa celular interna o del trofoectodermo de
blastocistos clonados mediante la técnica de transferencia nuclear y
cultivadas in vitro.
34
A las células somáticas donantes se las manipula para inducirlas a un proceso
de diferenciación en tipos celulares determinados, que posteriormente se
utilizarán en el tratamiento de ciertas enfermedades incurables. La ventaja de
esta técnica radica en que las células madre embrionarias, una vez
transplantadas, no provocan rechazo inmunológico, pues se comportan como
injertos autólogos, gracias a que son genéticamente idénticas a las células del
receptor o del paciente.
El problema de los transplantes heterólogos, es el largo tiempo que toma el
enfermo en aceptarlos, a pesar de que los órganos utilizados comparten su
misma información genética, pues casi siempre provienen de miembros de la
misma familia. Por otra parte, cuando se produce rechazo al tejido
transplantado, la salud del individuo queda seriamente comprometida y hay la
eventualidad que se debe pensar en un nuevo transplante.
Algunos hallazgos recientes han revolucionado la biología de las células madre
y han demostrado su potencial clínico para tratar diversas enfermedades,
como trastornos neurodegenerativos, desórdenes sanguíneos y diabetes.
Además, una estrategia válida para el manejo de desórdenes de origen
genético conocido, como la anemia falciforme y la ß-talasemia, consiste en
utilizar la técnica de transferencia nuclear, combinada con terapia génica y
celular.
Los defensores de la clonación terapéutica de células humanas aducen que
permite disponer de tejidos y de órganos viables, a partir de una fuente de
ADN, sin que sea necesario traer un nuevo ser al mundo con el único fin de
obtener un tejido. Con la finalidad de asegurar la normalidad del clon y, por
tanto de las células madre embrionarias, se propone una "prueba o test de
seguridad" que seleccione y discrimine los embriones a los que se les permitirá
progresar en su desarrollo. En teoría, este filtro se podría efectuar mediante la
evaluación de los errores en la expresión y en la huella genética de los
blastómeros en estado de preimplantación, pero no tiene en cuenta que se
desconocen los efectos epigenéticos adversos que desencadenaría tal
manipulación.
A partir de ciertos órganos o tejidos de individuos postnatales, se pueden
aislar células que pueden persistir en forma indiferenciada. Estas células
podrían ser transformadas en células madre pluripotenciales y cultivadas
separadamente, de acuerdo a la necesidad del paciente.
Así, dentro de tejidos clásicamente considerados con un potencial regenerativo
nulo, como el nervioso y el muscular, se han identificado grupos de células
madre, capaces de proliferar y de madurar hacia diferentes tipos celulares,
tanto in vivo como in vitro. De la misma manera, en la zona subventricular del
cerebro adulto, se han hallado células madre que eventualmente se podrían
utilizar en terapias de reemplazo neuronal. Por otro lado, se observa una
buena regeneración de tejidos como músculo esquelético lesionado, cuando se
injertan mioblastos cultivados in vitro.
Otra fuente prometedora de células pluripotenciales es la sangre del cordón
umbilical. La muestra de sangre se obtiene en el momento del nacimiento, sin
que el neonato ni su madre se vean afectados. La eficiencia del procedimiento
es tal, que, a partir de un volumen de 20 ml de sangre del cordón, se obtienen
hasta 4 millones de células madre67, que pueden crioconservarse por largo
35
tiempo sin deterioro alguno, para ser utilizadas en transplantes y en procesos
de terapia génica. La sangre del cordón umbilical también provee hematíes
normales y leucocitos muy útiles en el tratamiento de la anemia falciforme y
en la restauración del sistema inmunitario de los niños nacidos con
inmunodeficiencia grave.
Si las células madre que provienen de determinados órganos de individuos
adultos, se cultivan en condiciones apropiadas, son susceptibles de sufrir
transdiferenciación. En 1999, un grupo de científicos italianos y canadienses
demostraron la presencia, en personas adultas, de células madre nerviosas
capaces de diferenciarse en células hematopoyéticas. Según sus hallazgos, la
diferenciación de las células madre estaría condicionada por las señales que
reciben del entorno donde se sitúan. Igualmente se ha determinado que
células madre nerviosas de ratones se pueden diferenciar hacia células
hemáticas, como también las células hemáticas en células musculares
esqueléticas, o bien, en células de microglia o de astroglia. Estos hechos
sugirieron la posibilidad que células madre de la médula ósea fueran
transplantadas con el fin de tratar enfermedades como distrofia muscular, mal
de Parkinson, infarto de miocardio o falla hepática. Sin embargo no es claro si
la aparente plasticidad de las células madre adultas examinadas se debe a las
condiciones particulares en las que se cultivaron, a posible contaminacióno a
fusión celular. Además de esta incógnita que retrasa su empleo como
donantes en la clonación, se ha observado que las células madre adultas
presentan otra serie de desventajas con respecto de las células madre
embrionarias. Tales desventajas incluyen no sólo dificultades en su
aislamiento y cultivo, sino también una alta probabilidad de sufrir
mutagénesis insercional y cáncer, como resultado de la introducción de
transgenes retrovirales, necesarios para su manipulación genética. En
contraste, las células madre embrionarias se obtienen fácilmente a partir del
embrión seleccionado, proliferan de modo indefinido en cultivo, y sus defectos
genéticos se pueden reparar mediante procesos de recombinación homóloga.
Recientemente se obtuvieron células madre adultas derivadas de tejido
mesenquimatoso de médula ósea en ratas, ratones, otros animales y seres
humanos, que sufrieron una rediferenciación exitosa hacia células de las tres
capas germinativas (ecto, meso y endodermo), cuando se transfirieron sus
núcleos dentro de blastocistos.
Hay otras fuentes que ofrecen disponibilidad de células madre
pluripotenciales, que se pueden diferenciar y cultivar separadamente: Son los
embriones desechados durante el procedimiento de fertilización in vitro (IVF).
Clonación reproductiva. Inicialmente, el proceso es igual al que se efectúa
durante la clonación terapéutica. La diferencia aparece con posterioridad a la
fusión del núcleo de la célula donante con el oocito enucleado, pues el cigoto
se debe implantar en un útero, donde se desarrollará hasta formar un
individuo réplica del donante.
36
Fig.17. El esquema representa la técnica de transferencia nuclear con fines
reproductivos
Se toma el núcleo de alguna célula del cuerpo del animal que se quiere clonar
(animal A). Ese núcleo tiene toda la información genética que determina las
características de ese individuo. Este núcleo se introduce en un óvulo de otro
individuo al que previamente se le quitó el núcleo (animal B). De esta forma,
se obtiene una célula que se asemeja a un cigoto. Este cigoto realiza in vitro
las primeras divisiones mitóticas hasta convertirse en embrión de unas pocas
células y entonces es implantado en el útero de una madre adoptiva (animal
C). A partir de ese cigoto se desarrolla un individuo exactamente igual a aquel
individuo que donó su material genético. En total son necesarios 3 animales:
el que se quiere clonar que aporta el núcleo, una hembra que aporta óvulos y
otra adoptiva que llevará a cabo la preñez.
Existe otra técnica de clonación, denominada “clonación por fusión nuclear”
que es similar a la anterior pero en lugar de tomar el núcleo de la célula, se
fusiona una célula completa del animal que se quiere clonar (animal A) con un
óvulo de otro animal (B) al que se le ha extraído el núcleo. Esa fusión genera
un óvulo con toda la carga cromosómica completa, es decir, un cigoto, el cual
se desarrollará en embrión in vitro y luego será implantado en una madre
adoptiva (animal C).
Cuando se quieren tener muchos animales transgénicos idénticos que
produzcan la misma proteína recombinante de interés, se recurre a la
clonación reproductiva. Esta técnica permite obtener individuos genéticamente
idénticos al animal deseado.
La clonación utilizando células somáticas sin transformar ha demostrado la
utilidad en generar clones de animales individuales de alto mérito genético;
esto combinado con la tecnología de ADN recombinante da lugar a la
generación de animales clónicos transgénicos de alto mérito genético, que es
posible mediante la incorporación de los genes de interés a líneas celulares
mediante transfección, las cuales pueden ser utilizadas como donantes de
núcleos en la transferencia nuclear.
A diferencia de la microinyección pronuclear, donde sólo un 3-5% de los
animales nacidos son transgénicos (cifra que es inferior en animales mayores),
37
la transferencia nuclear asegura que el 100% de los animales nacidos sea
transgénico, eliminándose, por lo tanto, una generación de animales.
Además, estos animales presentan un bajo índice y/o ausencia total de
mosaicismo. Esto permite producir varios animales transgénicos en la primera
generación, posibilitando hacer pruebas de expresión del transgen en un
grupo de animales mientras el resto se utiliza para propagar la línea. En forma
adicional es posible seleccionar el sexo del animal sin necesidad de incurrir a
biopsias del embrión, lo que permitiría incrementar la masa ganadera por
multiplicación (clonación) en forma más rápida y eficiente. Finalmente, la
posibilidad de recombinación homóloga (gene targeting) en células somáticas
previo a la transferencia nuclear abre infinitas posibilidades de manipulación
genética en animales de granja que habían sido restringidas sólo al ratón, a
través de recombinación homóloga en células madre embrionarias. Esto
permitirá expandir el horizonte de posibilidades a esta tecnología,
posibilitando la eliminación de genes de interés en el animal (gene knock out),
como, por ejemplo, la eliminación del gen del cerdo responsable del rechazo a
los trasplantes de órganos (Phelps y col., 2003; Ramsoondar y col., 2003) o la
eliminación del gen de la oveja responsable de la producción de priones
(Denning y col., 2001), además de la posibilidad de insertar genes específicos
en regiones definidas del genoma del animal, favoreciendo un sitio permisivo
para asegurar altos niveles de expresión de la proteína de interés (McCreath y
col., 2000).
Fig.18. Rutas para la producción de animales transgénicos
En el campo de la clonación animal con fines reproductivos existe consenso
sobre las bondades de efectuar el procedimiento en animales de granja, con la
38
finalidad de preservar el genoma de los mejores ejemplares. Es lo que se ha
llamado comúnmente clonación de animales de élite.
Además de proporcionar una ruta para la generación de animales
transgénicos, la transferencia nuclear podría utilizarse para la producción de
cantidades ilimitadas de animales genéticamente idénticos con cual la
posibilidad de multiplicar razas de animales seleccionados podría aumentar la
eficiencia de la productividad pecuaria.
Las características genéticas más valoradas son, entre otras, un crecimiento
rápido, resistencia a enfermedades, una elevada producción de leche o de lana
de alta calidad.
Una ventaja importante de la clonación sería la diseminación más rápida del
progreso genético desde rebaños elite hacia los productores. Hasta la fecha
esto se ha venido realizando mediante la inseminación artificial, la cual
suministra sólo la mitad de los genes. Con la clonación, los productores que
pudieran pagar este servicio recibirían embriones que serían clones de las
vacas más productivas de los rebaños elite, con lo que incrementarían la
performance de sus rebaños en tan sólo una generación. En este escenario las
empresas venderían embriones clonados de la misma forma en que hoy
comercializan el semen. Estos embriones tendrían la ventaja de un transporte
más fácil de los genotipos entre países, evitándose los inconvenientes de la
cuarentena. Aunque los rebaños de algunos productores pudieran consistir
sólo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clones de diferentes
animales elite incrementaría la diversidad genética en estos predios.
La clonación reproductiva también permite preservar especies exóticas o que
se encuentren en peligro de extinción. Aunque la transferencia nuclear se
asocia en la mente de la gente con una pérdida de la diversidad genética, esta
técnica también proporciona nuevas alternativas para la conservación
genética. Con una cada vez más creciente presión comercial, muchas razas
indígenas o criollas adaptadas a las condiciones locales están siendo
reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivos de
producción.
Estas razas locales pueden contener importantes genes que confieran
resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climáticas
(frío/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extinción.
Los métodos actuales de conservación consisten en almacenar semen o
embriones congelados, procesos que son largos y costosos. Como
consecuencia, el futuro de sólo unas pocas razas está asegurado. La
tecnología de clonación puede proporcionar una forma más simple y efectiva
de conservar estas razas, por cuanto muestras de sangre, biopsias de piel o
incluso pelo pueden ser utilizadas como fuentes de células que podrían ser
crecidas brevemente en el laboratorio, mantenidas y congeladas mediante su
almacenamiento en nitrógeno líquido para ser luego utilizadas en
experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplo del potencial de esta
tecnología lo demuestran los recientes experimentos en diversas especies en
peligro de extinción mediante transferencia nuclear interespecies (Lanza y col.,
2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee y col., 2003).
39
11. Generación de animales knockout
La posibilidad de recombinación homóloga (gene targeting) en células
somáticas previo a la transferencia nuclear ha captado la atención de las
principales compañías biotecnológicas. La modificación genética que conduce
a la pérdida de función de un gen, o más comúnmente conocida como gene
knock out, ha sido utilizada extensivamente en el ratón para obtener un
mayor entendimiento de la función génica y como modelo para ciertas
enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).
11.1. Generación de ratones knockouts
Los ratones knockout están alterados genéticamente de tal manera que un gen
concreto (diana) se ha interrumpido (inactivado y se ha convertido en no
funcional. Es una técnica compleja que utiliza la combinación de ADN
recombinante, de cultivos celulares y de manipulación de embriones. La
técnica de construcción del un ratón knockout fue desarrollada en 1989 por
varios grupos, como el de Mario Cappechi en la Universidad de UTA, el de
Oliver Smithies en la Universidad de Carolina del Norte, y el de Elizabeth
Robertson en la Harvard Medical School.
Al tercer día de post-fertilización de las hembras de ratón son obtenidas del
útero las células ES, que derivan de la masa celular interna de la blástula en
desarrollo.
Las células ES se cultivan en placas que contienen fibroblastos embrionarios
incapaces de dividirse llamados feeder cells.
Fig.19. Superovulación de una hembra agouti, donadora de células ES, y
obtención de cultivos de células ES a partir de los blastocistos aislados del
útero de la hembra.
A continuación el constructo de ADN, que contiene un marcador (o dos) de
selección, es transfectado de manera estable en las células ES mediante
40
electroporación o lipofección. En algunas de estas células ES el vector de ADN
introducido habrá reemplazado al gen normal por un suceso de
recombinación. Se realiza análisis de PCR o Southern blots para comprobar
qué sub-líneas contienen el ADN incorporado a su genoma.
La recombinación homóloga en las células ES es el proceso de inserción génica
que requiere de una recombinación homóloga entre secuencias del vector y
secuencias genómicas. La inserción génica conduce a la interrupción del gen y
a la incorporación de la región codificadora del marcador de selección, lo que
permite realizar el seguimiento en las posteriores manipulaciones.
Fig.20. Esquema de recombinación del vector introducido en las células ES
con el genoma, de manera que se introduce la región codificadora para el
marcador de selección escogido en este caso, gen de resistencia a la
neomicina.
Se seleccionan las células ES que contienen una copia del gen recombinante y
un alelo normal, y se las hace crecer en cultivo. Estas células genéticamente
modificadas se inyectan a un embrión de ratón, en el que participarán en la
formación de los tejidos y órganos adultos. Se transfiere el embrión quimera a
una madre adoptiva para que se complete su desarrollo. Se pueden utilizar
genes del color del pelaje como marcadores para seleccionar posteriormente a
los ratones quimera que tengan células germinales provenientes de las células
ES genéticamente modificadas.
Los ratones heterocigotos pueden cruzarse para obtener ratones homocigotos
para el gen inactivado. Estos ratones homocigotos se denominan knockout ya
que se ha mutado o suprimido la funcionalidad de un gen.
41
Fig.21.Construcción de un ratón Knockout
La eficiencia del método es alta y la inserción en el genoma es dirigida.
La desventaja del método es que la frecuencia de recombinación es baja, del
orden de 10-5. Los factores que afectan a la recombinación son:
- El largo de la secuencia del vector
- El grado de homología entre las secuencias homólogas del vector y las
secuencias blanco
- La ubicación cromosómica del gen blanco
Es posible aplicar esta técnica para producir animales con múltiples genes
inactivados implicando a varios genes de una vía bioquímica, así como
desarrollar animales que tienen genes inactivados en un determinado tejido, o
que contienen genes discapacitados en lugar de inactivados.
11.2. Condicional knockouts
Esta técnica permite inactivar un gen sólo en tejidos particulares y/o a
tiempos específicos durante su ciclo de vida. Un ejemplo es la mutagénesis
condicional que lograron en el año 2006 en
Max-Planck-Institute of
Experimental Medicine, Goettingen, Alemania con el ratón NEX-Cre.
Crearon una línea de ratones que expresaba la recombinasa Cre bajo el
control de las secuencias regulatorias de NEX, gen que codifica para la
proteína neuronal bHLH. Para mimetizar la expresión endógena de NEX en el
telencéfalo dorsal, la recombinasa Cre fue insertada en el locus de NEX por
recombinación homóloga en células ES. El patrón de expresión de Cre fue
analizado después de que las líneas se cruzaran con líneas de ratones que
tenían insertado el gen marcador lac-Z. Se visualizó una expresión prominente
en el hipocampo y en el neocortex a partir de los 11,5 días.
42
Fig.21. Sección frontal cerebral de un ratón doble transgénico NEX-Cre*LacZmarcador a la edad de 55 días. La tinción de lac-Z corresponde exactamente a
la expresión conocida de los dominios del gen NEX, como el hipocampo y el
neocortex.
11.3. Aplicaciones de las técnicas knockout
Actualmente existe una gran carencia de órganos para trasplantes humanos
que no es cubierta por las donaciones. El trasplante de órganos de animales
hacia humanos (xenotrasplantes) podría ser la solución. Sin embargo, existen
muchas barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal
barrera consiste en el fenómeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia
de anticuerpos naturales contra epítopes del disacárido galactosa 1-3
galactosa presente en las superficies celulares de mamíferos, pero que estarían
ausentes en las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col.,
1985). Este es uno de los principales usos donde la tecnología de
recombinación homóloga acoplada con transferencia nuclear está siendo
explotada. La reciente generación de cerdos transgénicos en los que se eliminó
el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitiría la producción de animales que
carecen del epítope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara
demostración del poder de esta tecnología (Phelps y col., 2003).
Otra de las aplicaciones de esta tecnología está en la creación de animales
resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones
han tenido un enorme impacto económico en algunos países de Europa y la
utilización de productos animales para su uso en humanos es una
preocupación constante.
Este es el caso de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) o más
comúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sería la causa
de una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos
denominada vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones
(Prusiner y col., 1993) y más recientemente en ovejas (Denning y col., 2001),
demuestran que es factible eliminar el gen para los priones (PrP) mediante
recombinación homóloga y que los animales producidos son resistentes al
Scrapie. Dado que las ovejas y vacas están siendo utilizadas para producir
proteínas humanas de uso farmacológico y que estos animales poseen genes
43
funcionales PrP, sería apropiado producir poblaciones de animales resistentes
a estos priones.
La tecnología de recombinación homóloga ha sido ampliamente utilizada en el
ratón para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo,
debido a las diferencias fisiológicas sería más apropiado disponer de modelos
animales que se asemejen más al humano. Este es el caso del modelo para
fibrosis quística creado en el ratón, donde se eliminó el gen Cftr (Cystic
fibrosis transmembrane responder). Este modelo no presentó las
características típicas de la enfermedad en humanos debido a las diferencias
en la fisiología del pulmón del ratón (Davidson y col., 1995). La eliminación del
gen Cftr en la oveja se esperaría produjera un modelo animal para fibrosis
quística más exacto debido a las similitudes de la fisiología pulmonar entre
ovejas y humanos.
Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de producción
tales como el crecimiento y la eficiencia de alimentación son uno de los
principales objetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la
miostatina se eliminó mediante recombinación homóloga desarrollaron mayor
musculatura esquelética que los controles no modificados (McPherron y col.,
1997). Además, el fenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas,
por ejemplo Belgian Blue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones
naturales) del gen de la miostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la
eliminación de este gen en bovinos, ovejas y cerdos podría producir animales
con mayor masa muscular, lo cual sería de enorme importancia económica.
Tal es así que actualmente existe una empresa biotecnológica en USA (http://
www.prolinia.com) cuyo objetivo es proporcionar la clonación a los
mejoradores de razas registradas, para luego mediante ingeniería genética
proveer a estas razas elite de características deseables como la mutación para
el gen de la miostatina.
Otra característica productiva que se podría mejorar a través de esta
tecnología es la leche. La leche aporta cerca del 30% de las proteínas
consumidas en los países desarrollados. Por esta razón, la lactancia ha sido
objeto de diversos estudios en el campo de genética, fisiología y nutrición. La
recombinación homóloga podría ser utilizada para reemplazar genes de las
proteínas de la leche de los animales de granja con la respectiva contraparte
de los genes humanos para utilizarlos como fuentes de proteínas. Por ejemplo,
la seroalbúmina humana es utilizada ampliamente para el tratamiento de
quemaduras y como reemplazo de fluidos corporales en cirugía. La escala de
requerimiento de esta proteína (~ 600 toneladas al año) la hacen un muy buen
candidato para su producción a escala comercial en la leche de vacas
transgénicas. Desafortunadamente, la seroalbúmina bovina es muy similar a
la humana, lo que genera problemas para su purificación. Una solución sería
reemplazar el gen bovino con su contraparte humana, así la proteína bovina
sería eliminada sin alterar o comprometer la viabilidad del animal. Otro
ejemplo lo constituye la ß-Lactoglobulina que está presente sólo en la leche de
rumiantes y no tiene una función conocida en el proceso de secreción de leche
(Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunas propiedades de elaboración
indeseadas y se cree es la responsable de la mayoría de las alergias a la leche
bovina, situación que afecta a una considerable parte de la población mundial.
Por lo tanto, la eliminación de esta proteína podría proporcionar nuevas
propiedades tecnológicas a la leche (Richardson, 1985). Además, su
eliminación no sólo ayudaría con el problema de las alergias, sino que
también, debido a la compensación compensación que se produciría en la
concentración de las otras proteínas de la leche, probablemente incrementaría
la concentración de caseínas, lo que tendría un efecto directo para la industria
44
quesera. De la misma forma, la sobreexpresión de caseínas en la leche se
esperaría que alterara significativamente las propiedades tecnológicas de la
misma como fuera demostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la
expresión de proteasas podría generar resistencia a enfermedades de gran
impacto en el sector lechero como la mastitis (Kerr y col., 2001).
12. Modelos de animales transgénicos
12.1. Animales transgénicos como fábricas de proteínas: Vaca transgénica
productora de hormona del crecimiento
Cuando se quiere expresar proteínas farmacológicas para abastecer grandes
demandas, se debe pensar en producirlas en grandes cantidades. Pero, a su
vez, la producción de estas proteínas dentro del animal no debe interferir con
la biología misma del organismo. Por ello se pensó en obtener las nuevas
moléculas a partir de la leche de los animales de granja. Las ventajas de esta
estrategia consisten en que es un método natural con muy bajo impacto
ambiental (no se utilizan plantas industriales para la producción de la
proteína), y el costo de producción es relativamente bajo. Además, la leche es
un fluido corporal renovable secretado por los mamíferos en cantidades
sustanciales, que permite una purificación relativamente simple de la proteína
de interés.
Se puede dividir el trabajo de obtención del animal transgénico en tres partes:
a) Construcción del transgén, que incluye el gen de interés.
b) Transgénesis o transferencia del gen a las células de mamíferos.
c) Detección de la proteína recombinante.
Una vez producido un animal transgénico, se lo puede clonar para obtener
una descendencia importante genéticamente idéntica que, por lo tanto,
producirá también la nueva molécula de interés.
a) Construcción del transgén
Dado que el objetivo es que la proteína recombinante se produzca en la
glándula mamaria para que sea secretada en la leche, sin interferir con el
crecimiento y metabolismo del animal, es fundamental armar la construcción
genética utilizando un elemento (promotor) que permita la expresión del gen
únicamente en la glándula mamaria. Para ello se utiliza el promotor del gen de
la caseína del mismo animal, que es la proteína mayoritaria de la leche y que
se expresa sólo en glándula mamaria para ser secretada a la leche.
Promotor
(del gen para
caseína)
GEN de interés
Construcción genética para obtener la
expresión del transgén en la glándula
mamaria.
45
b) Transgénesis del animal
Existen varias técnicas para transferir genes a células de mamíferos con el
objetivo de que dicha secuencia se integre al genoma, las cuales han sido
descritas en apartados anteriores.
Los cigotos así obtenidos son luego implantados en el útero de una madre
adoptiva, o receptora, que ha sido preparada hormonalmente para poder llevar
adelante la gestación.
Otra técnica que se encuentra en desarrollo para ser aplicada a animales de
granja, consiste en transferir el gen de interés a las células de un embrión de
mamífero que proliferan in vitro y conservan su capacidad de poder
diferenciarse a otros tipos celulares. Cuando el embrión sigue su desarrollo en
el útero de una madre receptora, se forma un animal con células transgénicas.
c) Detección de la proteína
Una vez nacidos los animales hay que determinar que sean transgénicos, es
decir, que contengan al menos una copia del transgén y que lo expresen, es
decir, que produzcan la proteína. Si la proteína de interés farmacológico se
produce en la leche del animal, sólo cuando el animal comienza a producir
leche se puede detectar la proteína. En ese caso, la proteína se purifica y se
obtiene el producto farmacológico deseado.
Algunos animales de granja transgénicos
La primera oveja transgénica fue Tracy y vivió entre 1991 y 1998. Tracy
producía a1-antitripsina en la leche, un medicamento para tratar la fibrosis
quística, una enfermedad que afecta los pulmones. La siguiente tabla muestra
algunos ejemplos de animales transgénicos utilizados para la producción de
proteínas de interés farmacológico:
Animal Fármaco producido
Conejo
Cabra
Cerdo
Oveja
Vaca
Tratamiento
Interleukina-2
Deficiencias inmunológicas
a-Glucosidasa
Enfermedad de Pompe
Activador del plasminógeno tisular Coágulos coronarios
Anti-trombina III
Resistencia a la heparina
Factor VIII humano
Hemofilia
Proteína C
Prevención de trombos
a1-antitripsina
Fibrosis quística
Factor de coagulación IX
Hemofilia
lactoferrina
Deficiencia de hierro
Hormona de crecimiento humano
Enanismo
Algunos de estos fármacos ya se encuentran en etapas avanzadas de prueba
clínica y se espera que en los próximos años salgan al mercado, inicialmente
en Alemania y otros países de la Comunidad Europea.
46
Vaca Transgénica productora de hormona del crecimiento
La gran producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro
de leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas.
La primera vaca transgénica argentina se llama Pampa Mansa, y fue
producida en 2002. Pampa Mansa, transgénica y clonada, produce la
hormona de crecimiento humano para tratar casos de enanismo, y comenzó a
dar leche con buenos niveles de hormona de crecimiento en octubre de 2003.
Los pasos para la obtención de Pampa Mansa se muestran en el siguiente
esquema:
La técnica empleada consiste en la fusión de un óvulo de vaca no fecundado al
que se le quitó el núcleo, con una célula de una vaca que fue previamente
transformada mediante la introducción del gen humano que codifica para la
hormona de crecimiento humana. La célula que contiene el transgén en este
caso fue un fibroblasto (un tipo de célula que forma parte del tejido conectivo).
Como resultado de la fusión se origina un cigoto transgénico, que se desarrolla
en embrión y se implanta dentro de una vaca madre “portadora”, hasta su
nacimiento.
Posteriormente, en febrero de 2004 se obtuvo la segunda generación de
animales transgénicos, Pampa Mansa II y III, clones obtenidos a partir de
Pampa Mansa. La técnica empleada se muestra en la infografía de la página
siguiente extraída del Diario Clarín del 7 de febrero de 2004.
47
12.2. Animales transgénicos resistentes a la mastitis: Vaca transgénica
resistente a la infección intramamaria
Las posibles estrategias para producir y usar animales transgénicos
resistentes a la mastitis se fundamentan en la variedad de sustancias
antimicrobianas presentes en la glándula mamaria de los bovinos. Cuando
una bacteria logra atravesar el canal del pezón las probabilidades de mastitis
son altas. Pero los animales muestran diferentes grados de susceptibilidad
para enfermarse y en buena parte esa resistencia es determinada
genéticamente. Las bases genéticas de la resistencia a la mastitis no son aún
bien conocidas, pero es necesario hacerse varias preguntas de tipo práctico
acerca del impacto económico que tendría este comportamiento genético. Los
ensayos para incrementar la resistencia de la glándula mamaria a la mastitis
utilizando cruces o vacunas han tenido hasta el momento un impacto muy
limitado. Sin embargo la revolución contemporánea en genética animal
conducirá a posibilidades aún no pensadas, la transgénesis puede ser la clave
de una de ellas.
Hay dos tipos de estrategias transgénicas para aumentar la resistencia de la
glándula mamaria a la mastitis:
•
Aumentando la eficiencia y efectividad de los mecanismos de
defensa del huésped para prevenir la entrada, sobrevivencia y
multiplicación de los microorganismos en la glándula mamaria.
•
Ampliando la habilidad del sistema inmune del huésped para
eliminar rápidamente la infección, reducir la inflamación y/o minimizar
los daños tisulares.
48
PREVENCIÓN DEL CRECIMIENTO Y SOBREVIVENCIA DE LAS BACTERIAS EN LA GLÁNDULA MAMARIA
Cuando ingresan las bacterias a la ubre no son eliminadas a pesar del efecto
removedor que se produce durante el ordeño, debido a que ellas emplean
diversas técnicas para permanecer, tales como la rápida multiplicación, su
adherencia tisular o la invasión intracelular. Teóricamente la transgénesis
puede ser usada para aumentar la actividad antimicrobiana con la mayor
producción de sustancias como lisozimas, bloquear una ruta metabólica
básica del microorganismo, prevenir la adherencia al tejido o todas en
conjunto.
Eliminar la infección, reducir inflamación y minimizar el daño tisular:
Una vez el microorganismo invade la glándula inicia su multiplicación
generando por parte del huésped una respuesta inflamatoria con el propósito
de controlar o eliminar el agente invasor, ya sea recurriendo a la respuesta
humoral o a la celular; la transgénesis podría emplearse para modificar la
velocidad y naturaleza de la respuesta celular, aumentar la producción local
de anticuerpos o neutralizar toxinas y metabolitos que produzcan daño
celular.
La estrategia transgénica que se ha venido investigando en la Universidad de
Vermont, tiene por objetivo aumentar la resistencia gracias a la codificación
genética que estimula la producción de péptidos antibacterianos en la
glándula mamaria (Williamson y Col 1964, Kerr y col 2001). A continuación se
presentan los progresos de estas investigaciones.
Numerosos péptidos y proteínas antimicrobianos son producidos por
microorganismos, plantas o animales, que según su actividad van desde los
que tienen un estrecho espectro como colicinas y lisostafinas hasta moléculas
de mayor espectro con actividades no específicas como lisozimas y
lactoperoxidasa. Unas y otras tienen ventajas y desventajas cuando se quiere
elegir a una de ellas para la transgénesis. En este caso se eligió un péptido, la
lisostafina que tiene un espectro específico antiestafilococo. Esta es una
endopeptidasa que hidroliza los enlaces pentaglicina en el péptidoglicano de la
pared de Staphylococcus aureus, produciendo la lisis celular. Naturalmente la
lisostafina es producida por especies Coagulasa Negativa del género
Staphylococcus como es el S. simulans. Se caracteriza por ser especifica para S
aureus , con poca actividad para otras especies del mismo género, no es tóxica
y no afecta las células animales ni las proteínas de la leche. Bramley y Foster
demostraron en 1990 que una concentración de 10 mcg de lisostafina era
suficiente para prevenir mastitis en ratas en lactación. Además la expresión
genética puede estar orientada a un tejido en particular o a un estado
fisiológico por la adición de sustancias promotoras o reguladoras, por ejemplo,
la producción de B-lactoglobulina, la cual es una expresión genética de la
glándula mamaria. La expresión de la lisostafina dirigida por una secuencia
reguladora hacia las células secretoras de la glándula mamaria puede lograr
animales resistentes a mastitis causada por S. aureus.
Para conseguir el objetivo de las investigaciones el gen de la lisostafina
necesitaba ser clonado del S. simulans y modificado para que se expresara en
células animales, esto requiere de un codon particular y del cambio de la
secuencia para minimizar las diferencias existentes entre el DNA de las células
49
procarióticas de las eucarióticas. El péptido tiene que ser secretado de las
células en cantidades adecuadas y biológicamente activo y si finalmente esto
se logra, se podrá obtener un animal transgénico con expresión en su glándula
mamaria para producir lisostafina y controlar la infección intramamaria por S.
aureus.
En 1994, John Bramley de la Universidad de Vermont reportó la clonación del
gen de la lisostafina a partir de S. simulans y su modificación para que sea
expresado en células de mamíferos, in vitro. Este trabajo demostró que la
hipótesis del doctor Bramley era viable pero abrió muchos otros interrogantes
a resolver como eran, la cantidad de péptido biológicamente activo, que se
secretara en la leche.
En los trabajos de Williamson y col en 1994, se lograron producir pequeñas
cantidades de lisostafina biológicamente activa en el interior de las células
pero que no era secretada al medio. Se estableció que la secreción requería de
una codificación genética adicional, siendo necesaria la adición de una nueva
secuencia de DNA que la indujera. El péptido obtenido en este ensayo fue
ligeramente mayor al inicial pero era inactivo. Posteriormente se descubrió que
la glicosilación del péptido durante la secreción, no solo aumentaba su peso
molecular sino que lo inactivaba, siendo necesario modificar el gen para
eliminar los fragmentos responsables de la glicosilación y así tener un péptido
biológicamente activo y del tamaño correcto.
El nuevo gen productor de lisostafina ha sido usado por el doctor Robert Wall
y col. de USDA Beltville, para producir ratones y bovinos transgénicos. Se han
producido tres líneas de ratones transgénicos que tienen distintas capacidades
para secretar lisostafina en la leche.
Utilizando el modelo tradicional para estudiar la patogénesis de la mastitis por
estafilococo, las tres líneas de ratones transgénicos fueron probadas para
evaluar su resistencia a la infección por S aureus. Los resultados se expresan
en la tabla siguiente:
Con estos resultados se demuestra que la resistencia a la descarga
intramamaria con S. aureus en ratones transgénicos en forma proporcional a
los niveles de lisostafina secretada (Kerr y col 2001) En colaboración con el
USDA el trabajo se extendió a la obtención de bovinos transgénicos
productores de lisostafina, y fue en 2005 cuando obtuvieron vacas
genéticamente mejoradas para resistir la infección intramamaria por
Staphylococcus aureus. Las vacas transgénicas segregan en su leche
concentraciones de lisostafina que van desde 0,9 a 14 mg/ml. Se ha
demostrado con ensayos in Vitro la capacidad bactericida de la leche contra
50
Staphylococcus aureus . Fueron administradas infusiones intramamarias de
Staphylococcus aureus a 3 vacas transgénicas y a 10 vacas no transgénicas. El
incremento de células somáticas en la leche elevó la temperatura corporal e
indujo fase aguda de proteínas, ambos indicativos de infección, en las vacas
que no eran transgénicas, pero no se observaron dichos signos en las vacas
transgénicas.
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