Determinación de proteínas, carbohidratos y lípidos en semillas de

Determinación de proteínas, carbohidratos y lípidos en semillas
de
ajonjolí germinadas y sin germinar
Objetivo: encontrar la variación de los compuestos de reserva de la semilla de ajonjolí en su
germinación para llegar a plántula y su relación metabólica.
Palabras clave: germinación, lípidos, carbohidratos, proteínas, ajonjolí, ciclo del glioxilato.
Germinación de las semillas de ajonjolí
El ajonjolí es una semilla con un alto contenido de aceite que va del 55 al 50% de su peso total. La semilla de
ajonjolí requiere temperaturas altas y uniformes de entre 27 y 30°C para germinar.
•
Es muy importante lavarse muy bien las manos antes de iniciar las manipulaciones para evitar
que las semillas se contaminen.
•
Pese tres lotes de semillas de ajonjolí, cada uno de 0.5 g.
•
Cada lote de semillas se coloca en un frasco “Gerber” NO estéril. Las semillas se desinfectan con 25
mL de una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 5 min., para facilitar el lavado el frasco se tapa con
una capa de gasa sujetada por una liga y las semillas se enjuagan perfectamente con agua estéril,
hasta que el olor del cloro desaparezca.
•
Etiquete sus frascos “Gerber” estériles y humedezca el papel filtro del frasco con agua estéril,
introduzca las semillas a cada frasco (con la ayuda de una espátula) cuidando que no queden por
debajo del papel filtro, agrégueles agua estéril resbalándola por la pared del frasco, suficiente para
iniciar el proceso, pero sin dejar a las semillas totalmente cubiertas de agua para evitar que se
ahoguen.
•
Ponga a incubar sus frascos a 28 °C, y revise sus semillas al siguiente día para verificar que tengan el
agua suficiente; si es necesario agrégueles más agua. ¡OJO NO confundan las raicillas con
contaminación!
•
Las semillas se dejan incubar cuatro días. El día de la práctica pese tres lotes de semillas de ajonjolí,
cada uno de 0.5 g.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 10 mL de
amortiguador de fosfatos pH 7.5, MgCl 3 mM para homogeneizarlos.
2. Los homogeneizados se centrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.
3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan.
4. Se toman 150 μL y se colocan en un tubo de microfuga, se agregan 75 μL de TCA 10%, esto se hace por
duplicado para cada lote. Se agita en un vórtex.
5. Los tubos se centrifugan a 10 000 rpm, por 5 min en una microfuga.
6.
El sobrenadante se descarta y el precipitado se resuspende en 3 mL de una solución 1:1 de SDS 10% y NaOH
0.8 N.
7. Se lee a 280 nm contra un blanco de la solución SDS/NaOH .
8. Para realizar los cálculos de concentración de proteínas tome en cuenta los valores del Ε y el PM de la albúmina.
DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS
1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 5 mL de
etanol al 75% frío, se filtran los homogeneizados en tubos de centrifuga, se agregan 5 mL mas de etanol a cada
mortero para lavarlos y añadirlo a los tubos.
2. Los homogeneizados se centrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.
3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan.
4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la tabla 1:
Tabla 1.
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
Sol. patrón de glucosa (mL)
0.02
5
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
H2O destilada
0.97
5
0.95
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
Extracto enzimático sin germinar diluido 1:20
8
9
10
11
12
0.9
0.9
0.9
0.9
1.0
0.1
Extracto enzimático sin germinar diluido 1:50
0.1
Extracto enzimático germinado diluido 1:20
0.1
Extracto enzimático sin germinar diluido 1:50
0.1
Los tubos se agitan en el vórtex
¡¡¡Los siguientes pasos se realizan en la campana de extracción!!!
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Fenol 5% (mL)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
Los tubos se agitan con cuidado en el vórtex
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
H2SO4
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
•
Agite con cuidado en el vórtex pues la reacción es exotérmica y la temperatura puede aumentar hasta 110°C.
•
Deje enfriar a temperatura ambiente no en hielo.
•
Lea los tubos a 485 nm en el espectrofotómetro.
•
El tubo 12 corresponde al blanco de reactivos.
DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS
1. Se pesan dos vasos de precipitados de 50 mL y se marcan: lote sin germinar y lote germinado.
2. Los dos lotes de semillas se muelen en morteros fríos y se homogeneizan con 10 mL de cloroformo-metanol frío,
evite que las semillas germinadas lleven agua séquelas con papel.
3. Los homogeneizados se filtran con gasa en tubos de centrífuga de 50 mL.
4. Se centrifuga a 3 000 rpm durante 5 min.
5. Se colectan los sobrenadantes en otros tubos de centrifuga con ayuda de una pipeta pasteur.
6. Los precipitados se vuelven a homogeneizar con 5 mL de cloroformo-metanol cada uno y los sobrenadantes se
pasan a otros tubos de centrífuga.
7. Se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min.
8. Si se observa que los sobrenadantes tienen agua, se agregan 10 mg de sulfato de sodio anhidro.
9. Los dos sobrenadantes de cada lote de semillas, se juntan en sus respectivos vasos con ayuda de una pipeta
pasteur.
10. Se eliminan los solventes mediante calentamiento en baño maría.
11. Los vasos se pesan.
12. Calcule la cantidad de lípidos presente en cada muestra por diferencia de pesos entre los vasos vacíos y los vasos
con lípidos después de eliminar los solventes (si usó sulfato de sodio, descuente el peso de éste del peso final de
su vaso de precipitado).
RESULTADOS
Reporte para cada lote de semillas germinadas y sin germinar:
semillas sin germinar
mg
de
proteína/mL
homogeneizado
de
mg de proteína/g de semilla
µ g de carbohidrato/ mL de
homogeneizado
µ g de carbohidrato/ g de
semilla
mg de lípido/g de semilla
semillas germinadas (4
días)
Análisis
Conclusiones
Apéndice
Composición Nutricional:
Los datos de la composición nutricional se deben interpretar por 100 g de la porción comestible.
COMPUESTO
Calorías
Agua
Proteína
Grasa
Cenizas
Carbohidratos
Fibra
Calcio
Hierro
Fósforo
Vitamina C
CANTIDAD
570 Kcal
3g
17.81 g
48 g
8g
26.19 g
9.3 g
420 mg
2.51 mg
762 mg
0.0 mg
Fuente: http://www.nal.usda.gov/fnic/cgi-bin/nut_search.pl
La planta contiene entre 50% y 60% de aceites los cuales son de alta estabilidad, dada la presencia de
antioxidantes naturales como la sesamolina, sesamina y sesamol. La composición de sus aceites varía según
las variedades.