El modelo animal en las investigaciones biomédicas Dra. Silvia Hernández Médica Veterinaria. Máster en Epidemiología Encargada de la Dirección del Bioterio del Instituto de Higiene, Facultad de Medicina (UdelaR) RESUMEN El objetivo de este artículo es contribuir a difundir los principios éticos y las buenas prácticas de laboratorio que rigen el manejo y uso de los animales de experimentación en las investigaciones biomédicas. La investigación biomédica ha contribuido al logro de importantes avances del conocimiento científico y médico. La ciencia de los animales de laboratorio ha alcanzado un alto nivel de desarrollo con el fin de lograr un trato humanitario a los animales y mejorar la calidad de las investigaciones. A pesar de contar con modelos alternativos, existen pruebas para las cuales continúan siendo insustituibles. El diseño de los experimentos que los utilizan exige la definición detallada de las características genéticosanitarias y ambientales, así como una actitud ética y moral frente al uso de seres vivos. Solo de esta manera se podrán obtener en las investigaciones resultados válidos, confiables, reproducibles y comparables. Palabras clave: experimentación animal; animales de laboratorio; modelos animales; bienestar del animal; biomedicina; bioética. SUMMARY The objective of this article is to promote the ethical handling and care of laboratory animals used for scientific testing. Laboratory animals have long contributed to the improvement of medical and scientific knowledge. There is a humanitarian concern to develop scientific models of analysis that minimize the use of laboratory animals, although, in some researches the use of laboratory animals is still necessary. The design of experiments that use these animals requires a Correspondencia: silher@adinet.com.uy 252 detailed definition of the sanitary, genetic and environmental characteristics, as well as moral and ethical while handling laboratory animals. This is the only way to obtain valid, reliable, comparable and reproducible results. Key words: animal experimentation; animals, laboratory; models, animal; animal welfare; biomedicine; bioethics INTRODUCCIÓN El animal de laboratorio es una de las piezas fundamentales en las ciencias biomédicas. Son usados como modelos para investigar y comprender las causas, diagnóstico y tratamiento de enfermedades que afectan al humano y a los animales, además de sus importantes aportes en la docencia biológica y en el desarrollo, producción y control de medicamentos, alimentos y otros insumos, donde en muchos casos hasta la fecha son insustituibles (1,2). El uso de los animales de laboratorio en las investigaciones biomédicas representa un elemento fundamental en el desarrollo de importantes avances en la prevención y tratamiento de las enfermedades transmisibles y no transmisibles. Basta recordar las vacunas de la rabia, viruela, tétanos, difteria, tos convulsa y poliomielitis; el desarrollo de diversos antibióticos, la insulina y el conocimiento de las bases genéticas de la herencia. Los avances de la investigación en cáncer, cardiología, transplantes de órganos, Síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedad de Alzheimer, se deben también a las contribuciones de los estudios realizados en animales de laboratorio (2,3). Estos animales son para el investigador un reactivo biológico, por lo que su pureza debe ser vigilada, controlada y contrastada, al igual que cualquier reactivo, sin descuidar su posible contaminación biótica. Por esta razón se requiere la producción de animales “estandarizados o definidos” con características genéticas y sanitarias definidas, criados en ambientes controlados que respeten los requerimientos de la especie, con el correcto cumplimiento de los principios éticos y de bienestar animal (3). BIOMEDICINA, 2006, 2 (3) - 252-256 ISSN: 1510-9747 En los países desarrollados, fundamentalmente, existe toda una estructura en torno a los animales de laboratorio, tanto gubernamental como privada. A partir de 1940 se inició la creación de una nueva especialidad dentro de la medicina veterinaria: “la ciencia de los animales de laboratorio”. Esta ciencia se basa en investigaciones, normas, principios y legislaciones. En Países como Estados Unidos, Canadá, la Comunidad Económica Europea y Japón, existen legislaciones nacionales y/o institucionales que regulan el uso de los animales de laboratorio como son: International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS); Canadian Council of Animal Care (CCAC) y Federation of European Laboratory Animal Science (FELASA), entre otras. Estas instituciones han publicado guías con reconocimiento internacional donde se detallan las normas y las recomendaciones generales para el cuidado y uso de los animales en forma científica, técnica y humanitariamente apropiada, así como sobre la planificación y conducción de los experimentos con animales (4,6). El eje central de estas regulaciones esta dado por la aplicación del Principio de las 3 R´s formulados por Russel y Burch, en Inglaterra en 1959 y por la constitución de comités institucionales de cuidado y uso de animales de laboratorio quienes tienen como misión evaluar los protocolos de investigación y asegurar que todos los procedimientos se realicen acorde a las reglamentaciones vigentes (8,9). El objetivo de esta publicación es contribuir a difundir los principios éticos y las buenas prácticas de laboratorio que rigen el uso de los animales de experimentación en las investigaciones biomédicas. EL REACTIVO BIOLÓGICO El Animal de laboratorio es “cualquier especie animal que se mantiene bajo condiciones determinadas y se utiliza con fines científicos” (2,5). El reactivo biológico es un animal estandarizado, lo que significa que tiene una composición genético-sanitaria definida, son criados y mantenidos en ambientes controlados que cumplen con los requerimientos específicos para cada especie, los cuales garantizan, además el bienestar animal. El estado sanitario de los animales de laboratorio esta determinado por un complejo multifactorial en el que interactúan: además de la biología del animal, y el perfil genético, las condiciones ambientales del alojamiento, así como las prácticas y manejo al que son sometidos estos animales y sus insumos (2,4,7). Es bien conocido que el estado sanitario de los animales in- El modelo animal en las investigaciones biomédicas Silvia Hernández terfiere en el resultado de las investigaciones y esta ligado a la capacidad de respuesta. El uso de animales con un estado de salud deficiente conduce irreversiblemente a la obtención de resultados erróneos. En estos casos es necesario repetir las pruebas siendo esto, motivo de aumento del costo de las mismas y además una irresponsabilidad desde el punto de vista ético y moral porque estamos trabajando con seres vivos. Con el fin de proveer a los investigadores de animales sanitariamente definidos, se han desarrollado animales libres de gérmenes (axénicos); con flora bacteriana o vírica conocida (gnotobióticos) y libres de gérmenes patógenos específicos (SPF) (6,10,11). Las líneas consanguíneas (cepas endocriadas o inbred strain) son los animales genéticamente estandarizados. Son el resultado de 20 o más generaciones consecutivas de acoplamiento hermano x hermana (eventualmente, padre/madre x cría). Estos animales se caracterizan por: tener genes iguales; perfil genético propio; son estables por largos periodos de tiempo; uniformes fenotípicamente; sensibles a cambios del ambiente y son de distribución mundial. La homogeneidad genética de estos animales permite que la composición genética no tenga que ser considerada como una variable confundente en las investigaciones. Por lo que la variabilidad de los resultados de las investigaciones se pueden deber a factores ambientales o metodológicos. Esto es lo que hace posible la comparación de resultados experimentales entre animales de diferentes laboratorios. La asociación de las características fijadas en cada cepa, genera una individualidad en relación a sus cualidades, particularidad que deberá tomarse en cuenta en el momento de elegir el modelo para un trabajo de investigación (12,14). Los animales exogámicos (out bred stocks) o stocks se han utilizado ampliamente en la investigación biomédica. Las poblaciones fundadoras deben ser lo suficientemente grandes para asegurar la heterogeneidad de las colonias a largo plazo. Estos animales son los que mejor representan la variabilidad genética de una población humana, por eso son muy usados en toxicología y farmacología. Hay que destacar que estos animales no son definidos genéticamente por lo que, actualmente, su uso está cada vez más cuestionado. Se recomienda que sean sustituidos por un conjunto de cepas consanguíneas o por híbridos F1 de líneas bien distantes, obteniéndose de esta forma un polimorfismo muy alto, cercano a las poblaciones humanas (7,14). Las adecuadas condiciones de vida de los animales de laboratorio y las adecuadas prácticas de manejo a las que son sometidos les permiten crecer, madurar, reproducirse y mantener 253 BIOMEDICINA, 2006, 2 (3) - 252-256 ISSN: 1510-9747 las características genéticas y sanitarias, así como asegurar el bienestar animal (2,15). El ambiente en el cual se mantienen los animales debe ser el apropiado para cada especie, permitiendo el despliegue completo de las conductas específicas y disminuir al mínimo conductas inducidas por estrés (16,18). El ambiente de los animales de laboratorio esta constituido por el microambiente y el macroambiente. El macro ambiente o encierro secundario está constituido por la habitación: tamaño, iluminación, temperatura, ventilación y humedad relativa, ausencia de ruido y polvo, entre otros (2,4,6). El microambiente constituye el encierro primario del animal, determinado por el habitáculo o jaula y todo lo que en él se incorpora, como: lecho; agua; alimento, número de animales y objetos de enriquecimiento. Sus componentes deben satisfacer las necesidades fisiológicas, de conducta y las interacciones sociales entre individuos de la misma especie, así como el establecimiento de jerarquías dentro del encierro (4,6). La información disponible indica que la temperatura, humedad y concentraciones de gases son más altas en el microambiente que en el macroambiente. Las condiciones del ambiente pueden inducir cambios en los procesos metabólicos y fisiológicos o alteraciones en la susceptibilidad a enfermedades. Las alteraciones en la intensidad lumínica, así como en los periodos de luz-oscuridad pueden afectar la morfología, fisiología y conducta de los animales, como: problemas reproductivos, alteraciones en la ganancia de peso y en la ingestión de alimento. El ruido puede producir eosinopenia, aumento de las glándulas adrenales, disminución de la fertilidad, aumento de la presión sanguínea y canibalismo (19,22). Las características del macro y microambiente para cada especie se encuentran perfectamente definidas en las guías de cuidado y uso de animales de experimentación como: Canadian Council on Animal Care (CCAC), American Veterinary Medical Association (AVMA), Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (ILAR), European Federation of Animal Associations (FELASA). La definición de estas condiciones implica la generación de un animal experimental que nace, crece y muere en ambientes de laboratorio donde las condiciones se ajusten a normas ISO 17025, que cuenta con protocolos de procedimientos definidos y que se trabaja en el marco de las buenas prácticas de laboratorio (23,24). MODELOS Y CARACTERÍSTICAS Dentro de los modelos de experimentación sin duda, el ra254 El modelo animal en las investigaciones biomédicas Silvia Hernández tón es el más conocido y utilizado en la mayor parte de las experiencias in vivo de biología y medicina, es en general el modelo elegido para conocer la reacción de un organismo mamífero frente a una agresión, una intoxicación o una infección experimental (parasitaria, bacteriana o vírica); reacciones o trastornos inmunológicos, oncología, teratología y embriología. Muchos investigadores consideran al ratón como un modelo animal casi perfecto porque además de su corto tiempo generacional, alta performance reproductiva y fácil mantenimiento, son los animales más sofisticados que pueden ser utilizados por los investigadores (13,14). La Rata ocupa el segundo lugar, es utilizada además en investigaciones nutricionales, comportamentales y endocrinológicas. El conejo es utilizado fundamentalmente en la producción de antisueros; farmacología; toxicología; teratogenicidad y reproducción. Los cobayos son modelos de estudios inmunológicos, farmacológicos y nutricionales. El Hamster se utiliza fundamentalmente en la reproducción, citogénesis e inmunología (12,14). En la actualidad se ha desarrollado y perfeccionado una gran variedad de modelos animales, a fin de cubrir las exigencias de los investigadores para llevar a cabo los experimentos cada vez más sofisticados. Existen más de 478 cepas consanguíneas de ratón y 234 de rata de laboratorio. Dentro de éstas, las hay de uso general o especial, como los modelos para enfermedades autoimnunes, endócrinas y tumorales. También se destacan los híbridos F1, cepas congénitas, coisogénicas, transgénicos y knock-out. Se puede acceder a la última información consultando la página del principal proveedor el Jackson Laboratory de Maine, Estados Unidos (http//www.informatics.jax.org/strains) (12-14). EL PRINCIPIO DE LAS TRES R’S COMO IMPERATIVO ETICO Y DE CALIDAD En 1959 William Russell y Rex Burch, en Inglaterra, en su famoso libro “The principles of humane animal experimental techniques”, exponen por primera vez que la excelencia científica está fuertemente ligada al uso humanitario de los animales de laboratorio. Definen claramente las normas en las que se basan los principios éticos en la investigación con animales: las tres “Rs”: Reducir, Reemplazar y Refinar. Estos son los fundamentos para una racional e inteligente estrategia para minimizar el uso de animales y las causas de dolor y de diestres (25-27). Los proyectos de investigación que requieren el uso de animales de laboratorio deben ser realizados con el número mí- BIOMEDICINA, 2006, 2 (3) - 252-256 ISSN: 1510-9747 nimo necesario de animales que permitan obtener resultados científicamente validos. El perfeccionamiento del diseño de los experimentos y la selección del modelo mas adecuado, contribuyen al cumplimiento de este principio (10,26,27). Los procedimientos in vivo deben ser reemplazados siempre que sea posible por métodos alternativos que no usen animales vivos, como modelos matemáticos, simulación por computador, test serológicos, cultivos celulares y sistemas biológicos in vitro (28,29). El refinamiento involucra fundamentalmente la estandarización según parámetros internacionales: definición genético-sanitaria y la calidad del ambiente donde son criados y mantenidos los animales antes y durante la experimentación. Incluye todos los procedimientos para minimizar y eliminar el dolor, así como todos los métodos de enriquecimiento para asegurar el bienestar animal (11,30,31). Estos principios han sido adoptados para su aplicación a través de normas bioéticas, tales como la Declaración de la Asociación Médica Mundial Sobre el Uso de Animales en la investigación Biomédica, adoptada por la 41ª Asamblea Médica Mundial celebrada en Hong Kong, en 1989; la Guía del Consejo Internacional de Organizaciones de Ciencias Médicas para la investigación biomédica que involucre animales; las Guías para el cuidado y uso de los animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (4,6). EL DISEÑO DE LA EXPERIMENTACIÓN El diseño del experimento es solo una parte del desarrollo de la investigación, su éxito también depende de las condiciones de vida del animal y de la calidad de los recursos humanos (especialización y acreditación) (5,32). Para el diseño del experimento se han especificado una serie de pautas y recomendaciones a seguir, como: 1. Seleccionar el modelo animal adecuado, el cual depende de la especie, cepa y de la calidad del animal (animal definido) (2,6). 2. Todas las investigaciones deberán justificar el número de animales seleccionados. El cálculo de la muestra se hará por procedimientos estadísticos y la misma no deberá superar el mínimo necesario para asegurar la confiabilidad de los resultados. El número de animales a utilizar depende de las características mencionadas anteriormente y del protocolo de experimentación. La selección del inóculo: dosis, vía y frecuencia de inoculación y la determinación del punto final del experimento, son elementos que también se deben definir (23,24) El modelo animal en las investigaciones biomédicas Silvia Hernández 3. Realizar los procedimientos experimentales adecuados. Estos están condicionados a los conocimientos y calificación de los recursos humanos. Involucran desde la experiencia a la profesionalidad en el método a aplicar, además del reconocimiento del dolor, al manejo del alivio y la sedación. Cualquier estudio con animales puede producir en estos diestres o dolor, por lo que cualquier esfuerzo es poco para tratar de minimizarlo sin afectar el objetivo del experimento. Hasta, el momento, se considera que cualquier procedimiento que cause dolor o diestres en humanos, también puede causarlo en los animales. El incremento o disminución de la defecación y de la orina, la pérdida de peso, los cambios en el comportamiento y la inmovilidad son algunos de los signos clínicos. En roedores, son indicadores del dolor los cambios de actitud y de la apariencia del pelo corporal (28,29). 4. La realización de pruebas piloto es fundamental para madurar y definir la investigación, en lo que concierne a la muestra y sus procedimientos. La prueba piloto posibilita la elaboración del protocolo y de cuantos protocolos sean necesarios para el registro disciplinado de las observaciones y de los datos obtenidos durante las diversas etapas de la experimentación. Durante la experiencia piloto el investigador aprende a manejar el animal de la mejor manera y adquiere el entrenamiento en la técnica a utilizar (4,32). 5. Especificar el método de Eutanasia y definir el punto final humanitario del experimento. La eutanasia se define como la muerte sin dolor y diestres. La verdadera eutanasia supone una insensibilización rápida, mantenida hasta que se produzca la muerte. Se aplica al final del protocolo o puede ser necesaria antes de finalizado el mismo, por razones de dolor o distres, en todo caso que no pueda ser aliviado con analgésicos o sedantes u otros tratamientos. Los métodos aplicables son los establecidos en el “2000 Report of the AVMA Panel on Eutanasia” (32,33). CONCLUSIONES El respeto y cumplimiento de las recomendaciones internacionales sobre el cuidado y uso de los animales de laboratorio, permite alcanzar resultados válidos, confiables, reproducibles y comparables, así como adoptar una actitud responsable desde el punto de vista ético y moral frente al uso de seres vivos. La constitución de comités de ética, comité de uso y cuidado 255 BIOMEDICINA, 2006, 2 (3) - 252-256 ISSN: 1510-9747 de los animales de experimentación (CICUAL) es el paso inicial para instrumentar las normas y recomendaciones a nivel institucional. BIBLIOGRAFIA 1. Von Hoosier G, The age of biology: opportunities and challenges for Laboratory Animal Medicine. Scand J Lab Anim Sci 1999; 26 (4): 176-184. 2. Zuñiga J, Tur M, Milocco S, Piñeiro R. Ciencia y tecnología en protección y experimentación animal. México: McGraw-Hill Interamericana, 2001; p. 682. 3. Balch C, Bleyer A, Krakoff I, et al. The vital role of animal research in advancing cancer diagnosis and treatment. 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