Universidad de Los Lagos Departamento de Acuicultura y Recursos Acuáticos Caracterización de la actividad de la enzima Nitrato Reductasa en Macrocystis pyrifera de poblaciones expuestas y protegidas del oleaje Proyecto de seminario de título para optar al título de Biólogo Marino Pablo Patricio Leal Sandoval 2006 Macrocystis pyrifera Importancia ecológica •Base de cadenas tróficas •Hábitat •zonas asentamiento larval •Refugio Bahías abiertas al océano Pacífico y canales y fiordos protegidos de la acción de las olas Importancia económica •Alginatos •Alimento abalón Sur de Chile Áreas expuestas al oleaje Áreas protegidas del oleaje Abundancia poblacional Sin variaciones estacionales •Población estable •Reproducción continua Con variaciones estacionales •Disminuyen en primavera-verano; desaparecen en otoño •Reproducción verano Patrones de estacionalidad de poblaciones expuestas y protegidas Dentro de un contexto ecológico, la actividad enzimática de procesos metabólicos relevantes. •Tº •Nutrientes •Luz •Movimiento del agua Crecimiento Nitrógeno (N) NO3- Reproducción Urea NH4+ La capacidad para captar y asimilar NO3-, puede determinar las tasas de crecimiento macroalgal. Removido el NO3- desde la columna de agua y almacenado como NO3-, reducido a NH4+ o asimilado en los aminoácidos. Nitrato Reductasa Regulación Degradación de proteína Síntesis de proteína Presencia de NO3 - Actividad de la enzima Luz Ausencia de NO3Presencia de NO2- Concentración de NO3en la columna de agua Fluctuaciones circadianas o ultracircadiano Actividad de la enzima NR Define Actividad mostrada por la proteína Cantidad de proteína Mide Cantidad de NO2- producido en un periodo de tiempo determinado Métodos Ensayo in situ Ensayo in vitro Muchos trabajos se han basado en los factores que regulan la actividad de la NR en plantas superiores y microalgas. Pocos trabajos se han enfocado en macroalgas. Los ensayos enzimáticos de la NR han sido realizados de acuerdo a un método estándar sin la optimización para un alga en particular. Se ha observado que un método estándar no es igualmente eficiente para medir la actividad NR en diferentes algas marinas. Preguntas de investigación ¿Cuáles son las condiciones óptimas para la evaluación de la actividad de la NR in vitro en Macrocystis pyrifera? ¿Existen diferencias entre poblaciones de hábitat expuestos y protegidos del oleaje, en cuanto a la actividad de la NR? ¿La enzima NR es útil como indicador fisiológico de diferencias adaptativas entre distintas poblaciones de una misma especie?. Objetivo General Determinar si existen diferencias significativas en la actividad de la Nitrato Reductasa in vitro, entre poblaciones de M. pyrifera de zonas expuestas y protegidas del oleaje. Objetivos Específicos Optimizar el ensayo in vitro para la extracción y medición de la actividad de la enzima Nitrato Reductasa en M. pyrifera. Evaluar la actividad de la enzima Nitrato Reductasa en frondas juveniles de individuos provenientes de diferentes poblaciones de M. pyrifera expuestas y protegidas del oleaje, utilizando un ensayo in vitro optimizado. Hipótesis H1 Existen diferencias significativas, en la actividad de la enzima Nitrato Reductasa, entre poblaciones de Macrocystis pyrifera de zonas expuestas y protegidas del oleaje. H1.1 La medición de la actividad de la NR, con un el ensayo in vitro optimizado, en frondas juveniles de individuos de Macrocystis pyrifera determina diferencias significativas en la actividad de la NR entre poblaciones expuestas y protegidas del oleaje. Metodología 0,2 g peso fresco Pulverizara en N líquido Homogeneizara en 3 ml amortiguador extracción 750 x g por 5 min NADH KNO3 200 µl de homogeneizado 600 x g por 5 min Acetato de zinc Fenazina metilsulfato NNED Sulfanilamida Concentración de NO2- (λ = 540 nm) Experimento 1: Optimización del ensayo in vitro para la extracción y medición de la actividad de la NR en M. pyrifera •Frondas juveniles de individuos adultos de M. pyrifera. NO3Km NADH Estabilidad de la enzima Componentes del amortiguador Actividad de la enzima 0 - 20 mM 0 - 5 mM Extractos de la enzima serán almacenados en frío por 0 - 0,25 - 0,5 - 1 - 1,5 y 2 horas. Prepararán, por separado, amortiguadores sin EDTA, PVP o BSA. Experimento 2: Caracterización de la actividad NR in vitro de poblaciones expuestas y protegidas del oleaje de M. pyrifera. Osorno Faro Corona Bahía Mansa Puerto Montt Dalcahue Bahía Metri Quellón Análisis estadísticos Los resultados obtenidos se someterán a una ANOVA simple con una significancia de P < 0,05. Experimento 1 2 Factor Ausencia o presencia (EDTA, PVP o BSA) Concentracion de KNO3 y NADH Tiempo de almacenamiento Grado de exposicion al oleaje Variable Respuesta Actividad de la NR Actividad de la NR Gracias...