CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA - I-Mar

CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA NITRATO
REDUCTASA EN MACROCYSTIS PYRIFERA DE POBLACIONES
EXPUESTAS Y PROTEGIDAS DEL OLEAJE, SUR DE CHILE
Leal-Sandoval, P.P.1; Varela, D. A.1; Fernández, P. A.1; Henriquez, L.1; Villarroel, A.1;
Buschmann, A. H.1 & Hernández-González, M. C.1
1
i~mar, Universidad de Los Lagos, Casilla 557, Puerto Montt. Autor para correspondencia: pleal@ulagos.cl
RESÚMEN
En el sur de Chile, poblaciones de M. pyrifera presentan distintos patrones estacionales
dependiendo de su ubicación geográfica. En sitios expuestos al oleaje, estas poblaciones no
muestran variaciones estacionales en su abundancia, mientras que poblaciones ubicadas en
sitios protegidos del oleaje desaparecen totalmente en otoño, para luego aparecer nuevamente
a en la época de invierno-verano. Estos patrones que podrían estar correlacionados con las
variaciones estacionales en la disponibilidad de NO 3- podrían ser estudiadas a través de la
medición de la actividad de la enzima Nitrato Reductasa (NR). Para corroborar esta hipótesis
se desarrollo un ensayo in vitro optimizado para medir la actividad de la NR. Aunque la
actividad de la NR mostrada por las poblaciones de M. pyrifera se relacionó directamente con la
concentración de NO3·- en la columna de agua, no se encontraron diferencias significativas en
la actividad de la NR entre poblaciones protegidas (Estero Huito y Bahía Metri) y expuestas
(Bahía Mansa y Pucatrihue) al oleaje. De acuerdo a estos resultados, se concluye que la
actividad de la NR no es una variable capaz de dar explicación a los diferentes patrones
estacionales de las poblaciones estudiadas de M. pyrifera.
INTRODUCCIÓN
En el sur de Chile Macrocystis pyrifera es la especie más común entre las laminariales,
encontrándose desde los 37ºS hasta la Patagonia (55ºS). Esta especie habita bahías abiertas
al océano Pacífico, como también en canales y fiordos que están protegidos de la fuerte acción
de las olas (DAYTON 1985).
Datos publicados recientemente (BUSCHMANN et al. 2004) muestran que, en el sur de Chile,
M. pyrifera presentan diferentes patrones estacionales dependiendo de su ubicación
geográfica. En sitios expuestos al oleaje, donde la velocidad de la corriente es alta, estas
poblaciones no muestran variaciones estacionales en su abundancia, mientras que poblaciones
ubicadas en sitios protegidos del oleaje, donde la velocidad de la corriente es baja,
desaparecen totalmente en otoño, para luego aparecer nuevamente a en la época de inviernoverano.
Estas variaciones en los patrones de estacionalidad entre poblaciones de M. pyrifera de sitios
expuestos y protegidos del oleaje, podrían ser estudiadas, dentro de un contexto ecológico,
evaluando la actividad enzimática de procesos metabólicos relevantes. Las diferencias en la
respuesta enzimática a la disponibilidad de NO3- podría explicar por qué algunas especies son
más prolíficas en aguas donde el suministro de NO 3- es variable (LARTIGUE & SHERMAN
2002). De acuerdo a ésto, las diferencias en la actividad de la Nitrato Reductasa (NR) pueden
revelar posibles líneas de evolución o patrones de adaptación diferentes entre poblaciones de
una misma especie algal (BERGES 1997).
Por otro lado la actividad de la NR está regulada por la luz (CRAWFORD 1995) y está
directamente relacionada con la concentración de nitrato presente en la columna de agua
(LOPES et al. 2002), que junto a la temperatura y a la intensidad de luz son las variables
ambientales más relevantes que pueden determinar el comportamiento estacional mostrado por
las poblaciones de M. pyrifera, en el sur de Chile. Así, dado que la concentración de NO 3- es
mayor en período otoño-invierno, que en primavera-verano. Estos cambios en la disponibilidad
de nutrientes lo que podría estar relacionado con estacionalidad mostrada por M. pyrifera en
sitios expuestos y protegidos del oleaje. De cuerdo a estos antecedentes se propuso como
objetivo determinar si existen diferencias significativas en la actividad de la NR, entre
poblaciones de M. pyrifera de zonas expuestas y protegidas del oleaje, a través de un ensayo
in vitro optimizado para cuantificar la actividad de la enzima.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de muestras. El estudio fue realizado en 4 localidades de la X Región, Chile. Las
localidades protegidas fueron Bahía Metri (41º36’S, 72º42’W) y Estero Huito (Huito 53º 79’ S
65º 40’ W), y las expuestas Pucatrihue (40º28’S, 73º02’W) y Bahía Mansa (43º33’S, 73º46’W).
De cada uno de estos sitios se recolectaron frondas juveniles de 10 individuos adultos de M.
pyrifera, las que fueron llevadas a laboratorio en bolsas herméticas dentro de un recipiente con
hielo para evitar su descomposición
Optimización del ensayo in vitro. Para determinar las condiciones óptimas de medición de la
actividad de la NR se evaluó el efecto de la ausencia de tres componentes del amortiguador de
extracción para lo cual se prepararon por separado amortiguadores sin EDTA, PVP o BSA; se
determinó el tiempo y la temperatura de incubación; se determinó la concentración de KNO3
óptima, para lo cual se midió la actividad de la enzima en un rango de concentraciones de 3-10
mM de KNO3; se evaluó la estabilidad de la enzima al almacenar extractos enzimáticos a 4º C
por periodos de tiempo entre 0 y 120 min.; y para determinar que la actividad de la enzima
aumenta linealmente con el aumento del extracto enzimático, el ensayo fue realizado con 200,
400, 600 y 800 µL.
Actividad de la NR en M. pyrifera. Para medir la actividad de la enzima en las diferentes
poblaciones de M. pyrifera se utilizó el ensayo in vitro optimizado: 0,2 g peso húmedo de tejido
algal, cortado a 2 cm. de la base de la fronda, se pulverizaron con nitrógeno líquido.
Posteriormente, se homogeneizo en 3 ml en fosfato de extracción. De esta solución se tomo
una alícuota de 200 µL que se llevo a un volumen total de 1mL con la adición de NADH y KNO 3
(este último inicia la reacción). Para detener la reacción después de 5 min. se adicionaron 1 mL
de acetato de zinc 550 mM y 20 µL de fenazina metilsulfato 825 mM. Luego de esto, la solución
se centrifugó y la concentración de nitrito presente en el sobrenadante se midió
espectrofotométricamente (λ = 540 nm). Finalmente, se determinó el contenido proteico de
cada población algal según el método de extracción y cuantificaron de proteínas descrito por
BARBARINO y LAURENÇO (2005) La actividad de la enzima fue expresada como U g-1
proteínas solubles, donde 1U=1µmol NO2- producido por la enzima en un minuto.
Análisis estadísticos. Las comparaciones estadísticas fueron realizadas con una significancia
de P< 0,05 usando una ANDEVA de una vía para la optimización del ensayo in vitro y una
ANDEVA factorial para la comparación entre poblaciones expuestas y protegidas. En ambos
casos se uso el test a posteriori de Tukey HSD.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Optimización del ensayo in vitro. Sólo con la ausencia de EDTA del amortiguador de
extracción, que es adsorbente de compuestos fenólicos (LOOMIS & BATAILLE 1966), la
actividad de la NR mostró una disminución significativa con respecto al control (amortiguador
completo) indicando que la actividad de la enzima es más inhibida por este tipo de compuestos
que por proteasas, que fueron inactivadas por la presencia de BSA. La actividad de la enzima
fue mayor luego de 5 min. de incubacion y disminuyó significativamente a los 15 min. A 10º C la
actividad de la NR mostró el valor significativamente más alto, seguido por los 15º C,
temperaturas que se encuentran habitualmente en el hábitat natural de M. pyrifera. Entre 8 y 10
mM de KNO3 la actividad de la NR mostró su valor mas alto, mientras que a 3 y 5 mM de KNO 3
mostró su valor mas bajo. La enzima extraída se mostró estable durante los 60 min. de
almacenamiento a 4º C, a los 90 min. se observó una disminución significativa en su actividad.
Por último, la actividad de la NR mostró un aumento con tendencia lineal al aumentar el
volúmen de extracto enzimático utilizado en el ensayo in vitro.
Protegida
Expuesta
0,005
0,004
soluble-1)
Actividad NR (U g proteina
Actividad de la NR en M. pyrifera. De todos los experimentos realizados el valor mas alto
obtenido para la actividad de la NR en M. pyrifera fue de 1.108 U g-1, el valor mas alto descrito
hasta ahora para el género Macrocystis (ver HAXEN & LEWIS 1981, HURD et al. 1995). Entre
las poblaciones estudiadas, la de Estero Huito mostró la mayor actividad de la NR, seguida por
la de Pucatrihue, siendo Bahía Mansa y Bahía Metri las poblaciones con la menor actividad de
la enzima entre las poblaciones de M. pyrifera (Fig. 1), patrón que también muestra la
concentración de NO3- en la columna de agua de cada localidad. Esta relación podría deberse a
que la actividad de la NR esta directamente relacionada con la concentración de NO3- en la
columna de agua. Por otro lado, la actividad de la NR de las poblaciones de M. pyrifera no fue
afectada por el grado de exposición al oleaje, ya que los resultados obtenidos no mostraron
patrones significativamente diferentes entre localidades protegidas y expuestas (Fig. 1).
0,003
0,002
0,001
0
Estero Huito
Bahía Metri
Bahía Mansa
Pucatrihue
Poblaciones de M. pyrifera
Fig. 1: actividad de la NR de M. pyrifera proveniente de poblaciones expuestas y protegidas
del sur de Chile.
CONCLUSIONES
Con la optimización apropiada del ensayo in vitro es posible realizar fácilmente la medición de
la actividad de la NR en M. pyrifera. De acuerdo con los resultados obtenidos, la actividad de la
NR no es una variable capaz de dar explicación a los diferentes patrones estacionales de las
poblaciones estudiadas de M. pyrifera.
REFERENCIAS
DAYTON, P. K. 1985. The structure and regulation of some South American kelp
communities. Ecol. Monogr. 55:447-468.
BUSCHMANN, A.; VÁSQUEZ, J.; OSORIO, P.; REYES, E.; FILUN, L.; HERNÁNDEZGONZÁLEZ, M. & VEGA A.. 2004. The effect of water movement, temperature and salinity on
abundance and reproductive patterns of Macrocystis spp. (Phaeophyta) at different latitud in
Chile. Mar. Biol. 145: 849-862.
LARTIGUE, J & SHERMAN, T. D. 2002. Field assay for measuring nitrate reductase
activity in Enteromorpha sp. (Chlorophyceae), Ulva sp. (Chlorophyceae), and Gelidinium sp.
(Rhodophyceae). J. Phycol. 38:971-982.
BERGES, J. A. 1997. Algal nitrate reductases. Eur. J. Phycol. 32:3-8.
CRAWFORD, N. M. 1995. Nitrate: nutrient and signal for plant growth. The Plant Cell.
7:859-868.
LOPES, P. F., DE OLIVEIRA, M. C & COLEPICOLO, P. 2002. Characterization and
daily variation of nitrate reductase in Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Biochem. Biophys.
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LOOMIS, W. D. & BATAILLE, J. 1966. Plant phenolic compunds and the isolation of
plant enzymes. Phytochemistry 5:423-438.
BARBARINO, E. & LAURENÇO, S. O. 2005. An evaluation of methods for extraction
and quantification of protein from marine macro- and microalgae. J. Appl. Phycol. 17:447-460.
HAXEN, P. G. & LEWIS, A. M. 1981. Nitrate assimilation in the marine kelp,
Macrocystis angustifolia (Phaeophyceae). Bot. Mar. 24:631-635.
HURD, C. L.; BERGES, J. A.; OSBORNE, J. & HARRISON, P. J. 1995. An in vitro
assay for marine macroalgae: optimization and characterization of the enzyme for Fucus
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