Patogenia, latencia y reactivación de las infecciones
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Rev. sec. tech. Off. int. Epiz., 1986, 5 (4), 829-836. Patogenia, latencia y reactivación de las infecciones provocadas por herpesvirus E. THIRY, J. DUBUISSON y P.-P. PASTORET* Resumen : Después de un breve examen de la patogenia de las infecciones provocadas por herpesvirus, se presentan los aspectos esenciales de la latencia : su localización, el estado latente y el control de la latencia. También se examinan los estímulos de reactivación y se discuten los mecanismos supuestos de la misma. Se estudia igualmente la reexcreción, que es la consecuencia directa de la reactivación. La latencia posee una significación epizootiológica esencial, principalmente a causa de la reexcreción. La reexcreción de virus por portadores latentes, sin ningun signo clínico, asegura la transmisión silenciosa del virus a animales sensibles. Las nuevas medidas profilácticas deben tener en cuenta no sólo la prevención de las consecuencias clínicas de una infección provocada por un virus virulento, sino también la prevención de la reexcreción. P A L A B R A S C L A V E : Enfermedades de los bovinos - Enfermedades víricas Herpesviridae - Herpesvirus bovino - Infección latente - Patogenia. INTRODUCCIÓN Las infecciones provocadas por herpesvirus en los animales domésticos son de primerísima importancia para la producción ganadera y de aves de corral, especial­ mente porque los herpesvirus han desarrollado estrategias complejas de superviven­ cia en las poblaciones sensibles de pequeño tamaño. La latencia es una propiedad compartida por todos los herpesvirus que les permite persistir indefinidamente en el huésped después de una infección primaria o secundaria (45). Los mecanismos del establecimiento y del mantenimiento de la latencia no han sido aún totalmente esclarecidos, pero se están realizando estudios moleculares en lo concerniente a diferentes modelos de herpesvirus y algunos datos recientes parecen indicar que la latencia se encuentra bajo el control de genes virales. Se han formulado nuevas hipótesis sobre las regiones codificantes responsables del establecimiento y del man­ tenimiento de la latencia, como así también del nivel de expresión del genoma durante la latencia. Sin embargo, según los herpesvirus estudiados estos mecanismos pueden ser diferentes y el término « latencia » no posee la misma significación en todos los casos. En efecto, se han observado diferencias entre los herpesvirus en lo concer­ niente a la localización de la latencia, el estado del genoma viral, la capacidad para proporcionar modelos de latencia in vitro, la frecuencia de la reactivación y los estí­ mulos que pueden provocarla. Además, se deben tener en cuenta las relaciones virus-huésped : según la especie animal o las células infectadas por el virus el com­ portamiento del herpesvirus puede ser diferente. * Departamento de Virología y de Enfermedades Virales, Facultad de Veterinaria, Universidad de Lieja, 45, rue des Vétérinaires, B-1070 Bruselas, Bélgica. — 830 — Este artículo examina los aspectos generales y comparativos de la patogenia, de la latencia, la reactivación y la reexcreción de los herpesvirus animales. Se ha puesto énfasis en particular en los mecanismos que les permiten a los herpesvirus escapar a los métodos utilizados para luchar contra su propagación, en particular la vacuna­ ción y la erradicación (40). PATOGENIA DE LAS INFECCIONES PROVOCADAS POR HERPESVIRUS El conjunto de las enfermedades provocadas por infecciones herpesvirales es muy amplio. Además, según la cepa viral, la edad del animal y la vía de penetración de la infección, el mismo virus puede inducir diferentes enfermedades. El herpesvi­ rus bovino 1 (BHV-1) y el herpesvirus porcino 1 (SHV-1) constituyen ejemplos ilus­ trativos en ese sentido : la infección de los bovinos provoca rinotraqueitis, vulvova­ ginitis, conjuntivitis, abortos de las vacas servidas, encefalitis en los terneros jóve­ nes, metritis ; el BHV-1 también está asociado a la enteritis y a la mastitis (44). La infección del cerdo por parte del SHV-1 provoca abortos en las cerdas servidas, sep­ ticemias en los recién nacidos, encefalitis en los lechones, o enfermedades respirato­ rias en los cerdos jóvenes y en los adultos (3). En los animales domésticos, la enfermedad clínica se produce en general como consecuencia de una infección primaria, y la enfermedad recurrente, es decir provo­ cada por un virus reactivado, parece producirse con muy poca frecuencia. En los seres humanos la situación es diferente : las lesiones recurrentes labiales y genitales se observan a menudo en los hombres infectados por el virus herpes simplex de tipo 1 y 2 (HSV 1 y 2), incluso en presencia de un nivel elevado de inmunidad específica (34). La zona es una manifestación dolorosa de la reactivación del virus zonavaricella, otro herpesvirus humano. La virulencia es una propiedad genéticamente controlada y las regiones del genoma viral que son portadoras de los marcadores genéticos de la virulencia están en vías de identificación, en particular en el caso de los HSV y SHV-1. El gen de la timidina kinasa (TK) fue el primer gen de virulencia descrito en forma inequívoca. La avirulencia de los mutantes TK-negativos ha sido demostrada (4, 22, 23, 31), pero los marcadores genéticos de la virulencia se observan también en otras partes del genoma (5, 27, 50, 64). Las proteínas codificadas por estas regiones deben aún ser estudiadas. En un futuro próximo, el conocimiento de las regiones del genoma portadoras de los marcadores genéticos de la virulencia permitirá construir mutan­ tes de supresión, específicamente avirulentos y destinados a convertirse en cepas de vacunas artificialmente atenuadas. LA LATENCIA Se define a la latencia como la persistencia silenciosa del virus en el organismo, que no se puede detectar mediante los procedimientos virológicos clásicos (44). Sólo los cultivos prolongados de células de órganos, o el cultivo conjunto de estas células con células sensibles permiten aislar virus infecciosos en los órganos infectados en forma latente (30, 47). Es por ello que no se puede reaislar ningún virus infeccioso en cultivos celulares inoculados con un órgano triturado infectado en forma latente. — 831 — Establecimiento de la latencia Para el establecimiento del virus en estado latente se requiere la expresión de algunos genes virales. El gen TK fue el primer gen de latencia reconocido, pero ello se presta a discusión : en efecto, incluso mutantes de HSV-1 con una pequeña pro­ ducción de TK pueden permanecer al estado latente (14). La actividad del TK no es absolutamente necesaria para la multiplicación de HSV en el ganglio trigémino (10). Además, Kit y col. señalaron recientemente el establecimiento con éxito de mutantes de BHV-1 TK negativos (23). Para el establecimiento de la latencia, la multiplicación de los herpesvirus no es absolutamente necesaria. Mutantes termosensibles incapaces de multiplicarse en ratones pueden persistir en forma latente (26). Sin embargo, la multiplicación del virus aumenta considerablemente la cantidad del virus en el organismo y, por ello mismo, la posibilidad de producir la latencia. La localización de la latencia Para los herpesvirus, se describen tres localizaciones de la latencia : la nerviosa, la epitelial y la linfoide. El virus de Epstein-Barr (EBV ; herpesvirus humano 4) per­ siste en estado latente en los linfocitos B periféricos de los seres humanos infectados (36). Al igual que el virus de la enfermedad de Marek (MDV ; herpesvirus 1 de las gallináceas) forma parte de los Gammaherpesvirinae y la latencia linfoide es una propiedad de esta subfamilia (49). Un grupo de herpesvirus de los bovinos, clasifi­ cado provisionalmente por Ludwig como herpesvirus 4 de los bovinos (29), que comprende un conjunto de cepas aisladas de órganos respiratorios y genitales (cepa DN599, Movar 33/63, etc.), parece también instalarse en estado latente en los órga­ nos linfoides de los bovinos (38) y en los conejos experimentalmente infectados los monocitos pueden ser una localización de latencia (39). Otras características (creci­ miento en cultivo celular, microscopia electrónica de células infectadas) llevaron a clasificarlos como citomegalovirus bovinos (60). El citomegalovirus murino, que pertenece a los Betaherpesvirinae, puede establecer la latencia en las células de las glándulas salivales y en los linfocitos del bazo (48). Los Alfaherpesvirinae poseen una localización nerviosa de latencia : los ganglios nerviosos y especialmente el gan­ glio trigémino (6, 49). Sin embargo, la piel es una localización importante de laten­ cia para el herpesvirus bovino 2 (BHV-2) (32, 57), aunque también se haya descrito la latencia en el sistema nervioso (7). Además, el HSV se establece en estado latente en la piel de los cobayos y de los ratones (19, 58). Por lo tanto, se debe considerar con sumo cuidado la posibilidad de una localización epitelial de latencia para los otros Alfaherpesvirinae. El estado latente Clásicamente, se describen dos estados latentes (6) : a) un estado dinámico : la multiplicación del virus se produce siempre en las células infectadas en forma latente, de modo tal que, en todo momento, las células contienen una cantidad reducida de virus infeccioso ; b) un estado estático : ninguna infección productiva se produce en las células infectadas en forma latente en las que, sin embargo, se conserva la información genética del virus, ya que el virus infeccioso puede obtenerse a través del cultivo in vitro de estas células. La segunda hipótesis es la más probable (6, 66). En efecto, la latencia puede ser instaurada por mutantes termosensibles incapaces de multiplicarse en ratones (26). — 832 — La forma del genoma viral latente puede ser variable : integración del genoma del citomegalovirus en el ADN celular (11) o su presencia bajo la forma episómica. Las dos formas pueden coexistir, tal como se lo describe in vitro para el EBV (2, 25) y el MDV (55). En muchos sistemas se ha demostrado que algunas partes del genoma se transcriben durante el período de latencia (6 ; Rock D.L., Mayfield J. y Osorio F.A., comunicación personal ; Rziha H.-J., Ohlinger V., Mettenleiter T.C., Bandtlow I. y Falser N., comunicación personal). En algunos casos se define a la latencia como un bloqueo de la transcripción pero el bloqueo debería ser sólo par­ cial (37). Es posible que las regiones del genoma que son transcripcionalmente acti­ vas durante la latencia actúen como soporte de los genes que intervienen en el man­ tenimiento de la misma. El nivel de expresión en el genoma viral varía según la localización de la latencia. Cuando la latencia se produce en una localización neu­ ronal, lo que ocurre por lo menos en el caso de los Alfaherpesvirinae, la transcrip­ ción es muy reducida. Por el contrario, si la localización de la latencia se produce en el linfocito, el genoma viral se expresa en mayor medida y los antígenos virales específicos están presentes en la superficie de las células linfoblastoides infectadas en forma permanente (17). Para el HSV se han descrito modelos de latencia in vitro. Clásicamente, se recurre a la inhibición de la multiplicación del virus y a la incubación a una tempe­ ratura supraóptima para provocar una infección persistente in vitro (54). Puesto que nuestros conocimientos sobre la latencia natural son muy limitados, es imposible evaluar el valor de esos modelos in vitro. Control de la latencia El control de la latencia y los mecanismos que conducen a la reactivación están estrechamente relacionados, ya que estos mecanismos proporcionan una orden con­ traria a la orden de mantenimiento del estado latente. El virus puede mantenerse en estado latente, sea a través del control de la res­ puesta inmune específica o a través de una relación biológica entre el virus y las células latentemente infectadas. Un mejor conocimiento de los genes que intervie­ nen en la latencia podría contribuir al estudio de esa relación. La primera hipótesis, es decir la del control por la respuesta inmune, supone al menos la expresión de antígenos virales en la membrana de las células infectadas en forma latente. Al parecer, los Alfaherpesvirinae no expresan antígenos en las célu­ las infectadas a nivel latente. En el núcleo de las neuronas infectadas a nivel latente sólo se ha identificado un polipéptido inmediato y precoz (ICP4) del HSV (15). Por otra parte, los Gammaherpesvirinae, como EBV, expresan antígenos virales en la superficie de los linfocitos infectados a nivel latente, y estas células son efectiva­ mente destruidas por inmunocitolisis (16). En este último caso, la respuesta inmune no controla realmente la latencia. En un capítulo futuro que estudie los estímulos de reactivación también se discutirá la intervención eventual de la respuesta inmune en el control de la latencia. REACTIVACIÓN Se define a la reactivación como la aparición de virus infecciosos en la localiza­ ción de la latencia. A la reexcreción se la define como la presencia de virus infeccio­ sos o no infecciosos en los tejidos y órganos periféricos, seguida por su excreción — 833 — fuera del cuerpo. La terminología usualmente adoptada para las infecciones por HSV es la siguiente : — la recurrencia es la aparición de virus infecciosos en la periferia sin ninguna lesión clínica ; — la recrudescencia o enfermedad recrudescente consiste en lesiones clínicas en los tejidos periféricos, provocadas por un virus recurrente (6). La reactivación en sí misma es muy difícil de demostrar. La única forma con­ siste en investigar directamente el sitio de la latencia y de verificar en ello la reapari­ ción de la multiplicación viral. Por lo general, la reactivación se estudia a través de sus consecuencias directas : reexcreción y efecto inmune secundario. Estímulos de reactivación Se han señalado muchos mecanismos de reactivación que pueden diferir según los herpesvirus. La frecuencia de reactivación es tan elevada en algunos modelos (por ejemplo, los conejillos de indias infectados por el HSV) que es imposible iden­ tificar un estímulo de reactivación puesto que no es posible distinguir claramente entre la reactivación espontánea y la reactivación provocada. Por otra parte, la definición de la reactivación espontánea no es obvia : ella puede ser provocada por una condición endogénea del animal latentemente infectado o por una modifica­ ción de la relación entre el virus latente y la célula infectada, a nivel celular (24). Sin embargo, los estímulos de reactivación han sido identificados inequívoca­ mente en la mayor parte de las infecciones por herpesvirus. Entre ellos, podemos mencionar las situaciones de stress, el parto, el transporte, la sobreinfección por parte de otro virus (63), el cambio de habitat (13), la irritación local de la piel (18), un tratamiento mediante ciclofosfamida (6, 65). El estímulo experimental más importante de reactivación es el de la inyección de glucocorticoides, puesto que reactiva diferentes herpesvirus de importancia veterinaria : el herpesvirus bovino 1 (BHV-1) (59), el herpesvirus bovino 2 (BHV-2) (57), el herpesvirus felino-1 (12), el SHV-1 (33) y, recientemente, el herpesvirus de los equídeos 1 que ha sido exitosa­ mente reactivado y reexcretado por poneys infectados en forma latente (9). Los mecanismos de reactivación Los mecanismos de reactivación se relacionan con los factores implicados en el control de la latencia. Se deben considerar tres hipótesis : la reactivación de un her­ pesvirus latente puede ser inducida sea por una inmunodepresión, sea por un efecto directo del estímulo en las células latentemente infectadas o por una combinación de estos dos mecanismos. Ambos mecanismos pueden ilustrarse por el efecto de inyección de glucocorticoides. Los glucocorticoides pueden actuar sea a través de sus propiedades inmunodepresivas conocidas (51), o por un efecto directo sobre la célula infectada en forma latente (41). A la segunda hipótesis la respalda el hecho de que los glucocorticoides penetran en la célula, están acoplados a una proteína vector y pueden inducir en forma selectiva la transcripción de algunas partes del genoma. En otra familia de virus, los Retroviridae, se ha demostrado el efecto directo de los glucocorticoides sobre el genoma proviral (56). El mecanismo de reactivación es aún controvertido. Por ejemplo, la reactiva­ ción del citomegalovirus murino es inducida por varios estímulos ; se sabe que la mayor parte de éstos son inmunosupresivos. Sin embargo, efectos no inmunológicos acompañan a estos tratamientos y podrían representar el verdadero estímulo de reactivación (21). La ciclofosfamida es un medicamento inmunosupresivo potente. — 834 Induce la reactivación de varios herpesvirus : HSV (20) y el herpesvirus de la paloma 1 (65), pero no tiene efecto alguno sobre la latencia del BHV-1 (42). La dosis de ciclofosfamida utilizada provoca también alteraciones del ADN (6). Por lo tanto, no se puede afirmar que el efecto de la ciclofosfamida se deba a la inmunosupresión. Finalmente, puesto que se está identificando a los genes implicados en la latencia, el estudio de la regulación de su expresión contribuirá sin duda alguna al conocimiento del fenómeno de reactivación. REEXCRECIÓN La reexcreción sólo se produce cuando los virus reactivados atraviesan diferen­ tes barreras. En el caso de la latencia nerviosa (ganglio trigémino), los virus emi­ gran a través de las ramas sensibles del nervio trigémino y finalmente llegan a la piel o a la mucosa respiratoria. En ese momento, se puede detener la multiplicación de los virus mediante una citotoxicidad de mediación celular (52). También intervienen mecanismos inmunes no específicos : sistemas monocitarios-macrofágicos, células NK y el interferón también limitan la multiplicación viral (28). La inmunidad humoral desempeña un papel limitado puesto que los herpesvirus pasan de célula a célula a través de puentes intercelulares (8). Posteriormente, cuando el virus es libe­ rado en el espacio extracelular, la neutralización interviene al limitar la reexcreción del virus infeccioso. Por lo tanto, la reexcreción del virus es un fenómeno controlado por una inmu­ nidad específica. Es por ello que no siempre se observa la reexcreción después de la reactivación, aunque sea una consecuencia directa de la misma. Se pueden conside­ rar cuatro casos : 1) no se produce ninguna reexcreción, pero la multiplicación viral puede provo­ car una respuesta inmunitaria y la inmunidad específica puede aún ser estimulada (61) ; 2) la inmunidad específica ya no puede estimularse, se induce la reactivación pero no se la puede demostrar ni mediante una respuesta inmunitaria ni por un epi­ sodio de reexcreción ; 3) a la reexcreción no la acompaña una respuesta inmunitaria : la reactivación ha sido provocada en animales altamente inmunizados ; algunos de los virus reacti­ vados escapan a la defensa inmunitaria y son excretados. En este caso, el período de reexcreción es breve y los títulos de los virus reexcretados son muy bajos (41) ; 4) la reexcreción es producida y acompañada por una respuesta inmunitaria (41). SIGNIFICACIÓN EPIZOOTIOLÓGICA DE LA LATENCIA La significación epizootiológica de la latencia es, obviamente, la persistencia del virus en la población debida a portadores « silenciosos » sin ninguna señal de la enfermedad clínica. Estos portadores « silenciosos » parecen en buen estado de salud y, en algunos casos, no pueden diagnosticarse mediante las pruebas serológicas clásicas (1). Se han utilizado en gran escala medidas profilácticas basadas en la vacunación para prevenir las manifestaciones clínicas de infecciones por parte de herpesvirus en — 835 — los animales domésticos, pero ellas no pueden prevenir la instalación de una cepa en estado latente ni tampoco eliminar un virus latente presente en el momento de la vacunación. Más aún, en esos animales la vacunación no puede prevenir totalmente la reexcreción de virus latentes y la diseminación ulterior de virus de tipo salvaje a los animales vecinos. Las vacunas vivas atenuadas ofrecen al animal el espectro más amplio de componentes inmunogénicos necesarios para una respuesta inmune bien equilibrada (53), pero es perfectamente posible que las cepas de vacunas atenuadas persistan en estado latente (43). Los bovinos vacunados con una cepa atenuada de BHV-1 y sometidos luego a una cepa virulenta reexcretan ambos virus después de la reactivación (35). La presencia de un virus en un estado latente no excluye la laten­ cia de otro virus : la infección simultánea con dos cepas constituye el mejor método para establecer la latencia de los dos virus, si la virulencia de ambos virus es simi­ lar ; la sobreinfección es menos eficaz ya que la multiplicación de los virus sobreinfectantes puede estar sumamente limitada por la respuesta inmunitaria (62 ; Yierrel D.L., Blyth W.A. y Hill T.J., comunicación personal). Como la recombinación se produce fácilmente para el HSV y el SHV-1, por ejemplo, la aparición de recombi­ nantes virulentos puede presentarse en los animales infectados en forma latente por las dos cepas de vacunas. Un trabajo reciente demostró que los recombinantes viru­ lentos han sido obtenidos por la recombinación in vitro entre cepas atenuadas de SHV-1 (Lomniczi B., Kaplan A.S. y Ben-Porat T., comunicación personal). Por lo tanto, las nuevas vacunas atenuadas deben poseer las siguientes caracte­ rísticas : 1) deben ser capaces de prevenir la reexcreción, ya que la vacunación no impide la instalación de una cepa virulenta en una forma latente ; 2) deben ser eliminadas en las regiones genómicas implicadas en la latencia para prevenir su propia latencia ; 3) deben eliminarse en los genes de virulencia y estas deleciones deben situarse en diferentes partes del genoma para prevenir la aparición de recombinantes viru­ lentos ; 4) deben poseer marcadores fácilmente identificables : marcadores biológicos o bioquímicos, pero sobre todo marcadores antigénicos. Este punto será discutido más adelante. Las programas exitosos de erradicación de las infecciones por herpesvirus deben tener en cuenta el fenómeno de latencia. Los portadores « silenciosos » no presen­ tan ningún signo clínico de infección y los análisis serológicos no logran identificar todos estos animales infectados a nivel latente. Más aún, la vacunación conduce a una confusión epidemiológica, ya que en general es imposible distinguir mediante una prueba serológica entre animales vacunados y los infectados por una cepa viru­ lenta. En algunos casos es posible identificar virus aislados mediante marcadores biológicos (por ejemplo, cepa de vacuna termosensible) o mediante marcadores bio­ químicos (por ejemplo, análisis de restricción). Se deben realizar investigaciones ulteriores en lo concerniente al desarrollo de cepas de vacunas que poseen propieda­ des antigénicas originales, en lo concerniente a la cepa parental, y que no afectan su inmunogenicidad (Kit S., Sheppard M. y Kit M., comunicación personal). El desa­ rrollo reciente de vacunas de virus TK-negativo introduce no sólo una nueva pro­ piedad atenuada, sino también un marcador de la cepa (TK-negativa) (22, 23, 31). El desarrollo de métodos de diagnóstico susceptibles de detectar todos los portado­ res latentes y selectivamente a los animales vacunados será sumamente útil para los programas de erradicación. — 836 — CONCLUSIONES La latencia incrementa la complejidad de la epizootiología de las infecciones provocadas por herpesvirus. Las consecuencias de la latencia son difíciles de apre­ hender en términos puramente verbales, debido a la acumulación de datos. Es nece­ sario disponer de un enfoque conceptual de las interacciones entre el animal y el virus latente. Por lo tanto, podría ser útil contar con un modelo que permita anali­ zar todas las situaciones epizootiológicas y sugerir una evolución del sistema. En este contexto, el análisis lógico podría ser sumamente útil (46). La biología molecular ha proporcionado nuevos instrumentos para el estudio de la latencia y de la patogénesis herpesviral : en el futuro próximo, el conocimiento del control genético de la latencia y de la virulencia permitirá producir vacunas ino­ cuas atenuadas mediante deleciones específicas en el genoma. Este es un paso más en la dirección de una profilaxis nueva y racional que debería prevenir plenamente el establecimiento del virus latente y la reexcreción de virus portados en forma latente. * * * BIBLIOGRAFÍA (véase pág. 815)
