Cultivo in vitro: propagación de plantas

Cultivo in vitro: propagación de plantas
Hojas
de
enraizando
crisantemo
Plántula de crisantemo en envase
Magenta
Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio
nutritivo en condiciones estériles. Puede ser de: plantas,
semillas, embriones, órganos, explantos, células y
protoplástos.
Características del cultivo in vitro:
Es empleado a microescala
Hay optimización
ambientales
de
las
condiciones
No se produce el patrón normal de
desarrollo de una planta
Hace factible la manipulación de las célula
individuales o tejidos. Fundamental para
transformación genética.
Pioneros del Cultivo in vitro
Tipos de Cultivo in vitro. Propagación y
regeneración de plantas
Plantas regeneradas
ORGANOGÉNESIS
Callos
EMBRIOGÉNESIS
Suspensión
de células
Protoplastos
Explantos:
trozos hojas, tallos,
meristemos, etc.
Microesporas/gametos
Planta donante
Suspensión de células
Callos
Protoplastos
Explantos:
trozos hojas, tallos,
meristemos, etc.
Microesporas/gametos
Condiciones de los cultivos in vitro
¡¡ESTERILIDAD!!
Esterilización del material vegetal
Se emplean medios nutritivos muy ricos, por lo que
la esterilización de todo el material es esencial
TOTIPOTENCIA Capacidad de las células vegetales
de regenerar un organismo completo.
REPROGRAMACIÓN DESARROLLO Se altera el
patrón de células que estaban completamente
diferenciadas.
COMPETENTES No todas las células que responden
al cambio de programa de desarrollo.
Diferenciación
Morfogénesis
Cambios de forma y función de
orgánulos, células y tejidos
Organización de la estructura de
tejidos y órganos. Arquitectura y
simetría de la planta
DESARROLLO
Crecimiento
Incremento biomasa por
división y elongación celular
Microescala
Auxinas
Se transporta polarmente desde el ápice de parte
aérea o raíz.
El transporte de larga distancia se produce por el
floema.
Junto con las citoquininas son esenciales para la
viabilidad de las plantas: no hay mutantes
deficientes.
La estructura química de las auxinas es diversa.
Pueden
acumularse en formas inactivas
conjugadas a oligosacáridos y aminoácidos.
Auxinas naturales encontradas en plantas
Auxinas sintetizadas químicamente
Proliferación de raíces secundarias
Control
[Auxina] > 10-8 M causa el inicio
de divisiones celulares en el
periciclo.
Regeneración
de
plantas
favoreciendo el enraizamiento
Alta [auxina]
Interacción con citoquinina y ácido
abscísico en la dominancia apical de tallo
Escisión del ápice causa
proliferación de tallos axilares
La auxina está implicada en la redistribución de las citoquininas
sintetizadas en la raíz hacia el ápice.
Escisión del ápice: mayor nivel de citoquinina en las yemas
laterales.
El ácido abscísico se acumula en las yemas laterales latentes. La
escisión del ápice disminuye su contenido.
Citoquininas: descubiertas en cultivos in vitro
Las se descubrieron al buscar factores que
indujeran divisiones celulares y promoviesen el
crecimiento de material vegetal.
Se probaron multitud de substancias: extractos de levadura, jugo
de tomate, etc.
La leche de coco (rica en zeatina) fue muy efectiva, más en
conjunción con auxina
Skoog descubrió que DNA desnaturalizado de esperma de
arenque era muy efectivo en promover división celular
La kinetina fue la primera citoquinina identificada producida de
síntesis por la degradación térmica de DNA
Diferentes tipos de citoquininas
Sintética
Natural
Sintética
Bencilamino
purina (BAP)
Producción de callos por acumulación
de citoquininas: Agrobacterium
CALLO tejido desdiferenciado en
continua división.
AGALLA tumor producido por la
infección
de
Agrobacterium
tumefaciens por acumulación de
citoquininas y auxinas
En la infección, se produce la inserción de genes bacterianos en el
genoma de la célula vegetal, portados en el T-DNA. Éstos codifican
enzimas para la síntesis de dichas fitohormonas.
Proliferación de parte aérea
Control
+ Citoquinina
Distintas moléculas tienen diferente actividad
Auxinas y citoquininas tienen diferente nivel de
actividad biológica según la molécula empleada:
establecer la dosis.
Regeneración por organogénesis
Concentración de IAA (mg/L)
0,18
1,18
3,0
RAÍZ
0,03
CALLO
0,005
HOJA
0
0,2
1,0
Concentración de kinetina (mg/L)
0
Regeneración de plantas por organogénesis
El callo se somete a una relación auxina/citoquinina baja, para
inducir la formación de parte aérea.
En condiciones de esterilidad, se secciona la parte aérea
formada.
Se transplanta a un medio de cultivo con una relación
auxina/citoquinina alta, para inducir la formación de raíces.
Una vez generadas raíces, se transfieren a un sustrato con alta
capacidad de retención de agua (p. ej. turba).
Las plántulas se cultivan en condiciones de humedad óptima
para evitar su desecación, hasta que la raíz se afianza.
Protoplastos
Obtención enzimática
Diversos materiales se pueden incorporar a un
protoplasto: orgánulos, DNA plasmídico, bacterias, etc.
Variación somaclonal
Beneficiosa
Perjudicial: indeseable
en la generación de
plantas transgénicas
Transformación de plantas: Agrobacterium
Inserción del T-DNA con
oncogenes y genes de
metabolismo de opinas
Pioneros del desarrollo de vectores de
transformación basados en Agrobacterium
Jeff Schell
Mark Van Montagu
Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
Estructura general del T-DNA
LB
RB
Genes vir NO se transfieren
SELECCIÓN DE
PLANTAS
TRANSGÉNICAS
Selección de trasngénicos con kanamicina
Sólo unas pocas
células son
transgénicas: varios
pasos de selección
Vectores binarios desarmados derivados
del plásmido Ti de A. tumefaciens
LB
Nos T
MnSOD
35S
35S
nptII
35S T
Cebadores específicos utilizados
Fragmento Cebador positivo
Cebador negativo
Rubisco
tccctgtttcaaggaagc
gtcgcataaaattgaaggag
(349 pb)
Rbcs01F
Rbcs02R
nptII
gaagagcatcaggggctc
gaagaactcgtcaagaaggc
(317 pb)
nptII01F
nptII02R
35S
tgccatcattgcgataaagg
cctctccaaatgaaatgaac
(234 pb)
35S01F
35S02R
Nos term
gaatcctgttgccggtcttgcg
gcgggactctaatcataaaaac
(127 pb)
nos01F
nos02R
RB