Fermentación maloláctica en vinos
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La Fermentación Maloláctica Cambios organolépticos Ing. Agr. Silvia Paladino Conversión de ác.málico ác málico en ác. ác láctico, láctico catalizada por la enzima maloláctica COOH COO CH2 CHOH COOH ác. L(-)Málico NAD Mn+2 CH3 CHOH + CO2 COOH ác. L(+)Láctico Las bacterias lácticas son los agentes causales de este cambio bi Ácido málico Propio de las uvas La concentración depende de la zona donde se cultivaron las uvas Zonas templadop frías 2 a 8 g/L Z Zonas cálidas álid < de 2 g/L g/ Bartowsky, 2005 Bacterias Lácticas á Ell vino es un ambiente b hostil h l para las l bacterias b Bajo pH Alta concentración de Etanol Baja concentración de nutrientes SO2 Bacterias Lácticas Sólo 4 g géneros son capaces p de sobrevivir en las condiciones del vino: Oenococcus Lactobacillus P di Pediococcus Leuconostoc Pero sólo Oenococcus oeni soporta pH < 3,5 G m+ Gram Metabolismo de las bacterias lácticas H Homofermentativo f t ti Azúcares Glicólisis: glucosa Pediococcus y algunos Lactobacillus ác. Láctico y CO2 piruvato Glicólisis glucosa ATP fructosa glucosa-6-fosfato fructosa-6-fosfato ATP fructosa 1,6-difosfato 1 6-difosfato Gliceraldehido 3 fosfato Dihidroxiacetona fosfato NAD+ NADH 1,3 –difosfoglicerato 3-fosfoglicerato ATP 2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato ATP piruvato i t Lactato Metabolismo de las bacterias lácticas Heterofermentativo Azúcares ác. láctico ác láctico, etanol etanol, glicerol ác. acético, manitol y CO2 Á id cítrico Ácido ít i ác. acético, á éti CO2 y ác. á láctico Vía pentosa fosfato para degradar hexosas y pentosas Oenococcus, Leuconostoc y algunos Lactobacillus Vía Pentosa Fosfato Glucosa Fosfo-6-gluconato ATP ADP NADP+ CO2 NADPH Ribulosa 5-Fosfato 5 Fosfato NADP+ NADPH Xil l Xilulosa 5 5-fosfato f f t Acetil-fosfato ADP A t t Acetato ATP NADH NAD+ Acetaldehido NADH Gliceraldehido 3- fosfato (glicolisis) ATP Piruvato NAD+ Etanol ADP Lactato Oenococcus oeni Heterofermentativo: forma ác. Láctico,, CO2 y etanol o ácido acético a partir de azúcares Resiste pH < 3,5 Casi todas las FML espontáneas Comercialmente disponible Oenococcus oeni Oenococcus oeni Oenococcus retenido en filtro de 0,45 micrones Interacción ó levadura l d -bacteria b Levaduras Negativos Competencia por nutrientes Formación y combinación de SO2 Formación de ácidos grasos de cadena larga Positivos Liberación de polisacáridos de la pared y proteínas t í (li (lisis) i ) Evolución del crecimiento bacteriano Factores q que influyen y sobre el crecimiento bacteriano • pH • Temperatura • SO2, Lisozima • Alcohol • Nutrientes • Oxígeno • Ácidos Á id orgánicos á i • Bacteriófagos g Factores que influyen sobre el crecimiento bacteriano • pH Mínimo pH=3,1 pH 3 1 Oenococcus resistente a pH<3,5 p , Lactobacillus y Pediococcus pH>3,5 C t b li Catabolismo: pH H 3,2 32 Á Málico Ác. Máli pH 3,5 p , Azúcares Velocidad de FML Factores que influyen sobre el crecimiento bacteriano • Temperatura <15ºC FML no progresa 20-25ºC óptimo p • SO2 <30 30 mg/L /L SO2 Total T t l Hasta 0,5 , mg/L g/ SO2 Molecular Ataque al acetaldehído y ác. pirúvico Factores q que influyen y sobre el crecimiento bacteriano • Lisozima Autorizada por INV Res.33/2009 Dosis máxima acumulada: 500 mg/L ( ) Controla bacterias Gram (+) ataca la pared celular. No controla levaduras ni bacterias acéticas acéticas. Efectiva a pH alto. No modifica características organolépticas. (proteínas); ); tintos (taninos ( y color)) Problemas: blancos (p Factores que influyen sobre el crecimiento bacteriano:lisozima Yun Cai Gao et al, AJGWR, 8, 76-83, 2002 Factores que influyen sobre el crecimiento bacteriano • Alcohol 13 5% limitante 13,5% Mayor y cont. Alcohol,, FML más lenta • Nutrientes R Requerimientos i i t complejos l j Autólisis de levaduras Factores q que influyen y sobre el crecimiento bacteriano • Oxígeno Las bacterias lácticas son microaerófilas Aireación moderada: estimula FML Aireación intensa: ácido acético • Acidos orgánicos g Fumarato y ác. Grasos: inhibidores Factores q que influyen y sobre el crecimiento bacteriano • Bacteriófagos Partículas semejantes a virus , que infectan y lisan bacterias Encontrados sobre bacterias de la FML P ibl responsabilidad Posible bilid d en FML problemáticas bl áti Consecuencias de la FML Modificación de la acidez Descriptores p para p un vino que q ha completado p la FML exitosamente Manteca Levadura d Vainilla Especias Nuez Miell Cuero Tostado Mayor volumen en boca Mayor persistencia en boca Menor astringencia Reducción de los aromas vegetales,herbáceos Descriptores p para p un vino que q ha completado p la FML sin control a pH > 3,5 Aromas lácticos intensos Yogurt rancio Notas de sudor Ac. Acético Notas animales Cuero mojado Fósforo quemado Fruta en descomposición Amargo g intenso al final de boca Consecuencias de la FML C bi organolépticos: Cambios lé ti sabor, aroma, color, textura Modificaciones higiénico sanitarias Estabilidad microbiana FML: cambios organolépticos Sabor Modificación de la acidez Acidez total y pH Acidez volátil FML: cambios organolépticos Sabor Acidez total: disminuye hasta 2g/L pH: aumenta 0,1-0,25 unidades Acidez volátil: aumenta aprox. aprox 0,2 0 2 g/L FML: cambios organolépticos Sabor Málico (diácido) Láctico (monoácido) Málico es un ácido más fuerte que láctico pK1 = 3,45 pK = 3,78 Málico: duro Láctico: untuoso FML cambios FML: bi organolépticos lé ti Sabor y Aroma Color FML: cambios organolépticos Aroma y sabor Modificación del carácter floral ó frutal Incorporación de aromas lácticos, lácticos manteca (diacetilo), nueces Mayor complejidad aromática á Menor percepción de la astringencia Mayor untuosidad Potencialmente: Gusto a “ratón” Gusto a geranio Diacetilo C C C C H3 O O H3 1 - 4 mg/L positivo 5 - 7 mg/L defecto manteca, manteca rancia movie o pop-corn pop o Umbral de detección en vino 0.2 mg/L para Chardonnay 0.9 mg/L para Pinot Noir hasta 2.8 mg/L para Cabernet Sauvignon (Martineau et al., 1995a). Bartowsky & Henschke, 2004 Diacetilo Catabolismo del ác. Cítrico Contenido de ácido málico en mostos 1 a 8 g/L Contenido de ácido cítrico en mostos 0,1 a 0,7 g/L Metabolismo del ácido cítrico en Oenococcus oeni (Ramos et al, 1995, en Bartowsky & Henshke, 2004) Citrato liasa Diacetilo Clave del gráfico metabolismo del ácido cítrico 1.Citrato liasa 2. Oxaloacetato l 3. Piruvato decarboxilasa 4. Alfa acetolactato sintasa 5. Alfa acetolactato decarboxilasa 6. Diacetil reductasa 7. Acetoina ceto a reductasa eductasa 8. Lactato deshidrogenasa 9. Complejo Piruvato deshidrogenasa 10 Acetato quinasa 10. 11. Decarboxilación no enzimática del alfa acetolactato 12. Aspartato aminotransferasa, TPP, Tiamina PP Diacetilo Las levaduras pueden formar también diacetilo diacetilo, pero debido al ambiente reductor de la FA, es reducido a acetoina y 2, 2 3 butilen b til glicol. li l Los productos reducidos son menos tóxicos (para la levadura) que el diacetilo, diacetilo y además esta reducción aumenta la concentración ó de NAD Y NADP Diacetilo El metabolismo del ácido cítrico no se inicia hasta que se haya metabolizado más de la mitad del ácido málico. málico (B t (Bartowsky k &H Henshke, hk 2004) FML en Cabernet Sauvignon g Factores que afectan la producción de diacetilo en vino Caso real: El vino tenía 1,8 1 8 mg/L de diacetilo, diacetilo producto de la FA. El diacetilo p producido en la FML llegó g a un máximo cuando se consumió el 95% del ácido málico, que coincide con el 75% del ácido cítrico metabolizado. Cuando todo el ác. ác cítrico (día 20) se ha consumido, consumido la concentración de diacetilo ha decrecido prácticamente al nivel inicial. inicial Factores que afectan la producción de diacetilo en vino ¿Que ha ocurrido? Umbrales de detección Diacetilo 0,2 a 2,8 mg/L A t í 150 mg/L Acetoína /L 2,3 butanodiol 600 mg/L No contribuyen organolépticamente, por estar debajo del umbral Bartowsky & Henshke, 2004 Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino La cantidad final de diacetilo en un vino depende de la cantidad producida (FA y FML) y de la intensidad de la reducción posterior sufrida. La intensidad de la reducción del diacetilo depende de la cepa de bacterias que interviene, interviene en ausencia de levaduras. Factores que afectan la producción de diacetilo en vino El metabolismo de los ácidos málico y cítrico depende de la etapa de crecimiento de las bacterias presentes. No hay degradación de ácido málico hasta que la población bl ió no alcanza l 0,5 0 5 a 1 x 106 ufc/mL. f / L Factores que afectan la producción de diacetilo en vino / Gran número de bacterias 108 ufc/mL No hay multiplicación de bacterias Los ácidos málico y cítrico son degradados g simultáneamente por actividad de las células no proliferantes. Menor producción de diacetilo. Bajo número de bacterias 106 ufc/mL Hayy multiplicación p de bacterias Se degrada inicialmente el ácido málico, posteriormente es atacado el ác. cítrico. Mayor producción de diacetilo. Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino Pinot Noir Contenido de diacetilo después de FA FA=0,5 0,5 mg/L Inoculado Inoc lado con 2 X 104 ufc/mL fc/mL Diacetilo producido en FML = 3,9 mg/L Inoculado con 2 X 106 cfu/mL Diacetilo producido en FML = 1,7 mg/L Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino Bartowsky & Henshke, 2004 Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino Temperatura En general, óptimo para LAB: 27°C En vino: 15 a 25°C óptimo para O. O oeni : 20 a 22°C 18°C menor concentración de diacetilo 27°C mayor concentración de diacetilo Pero : Menor velocidad de remetabolismo del diacetilo a menor temperatura Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino pH Menor pH p mayor concentración de diacetilo La formación de ácido acético a partir de ácido cítrico se ve favorecida a pH elevados Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino Concentración de ácido cítrico en el vino Contenido de ácido cítrico en mostos 0,1 , a 0,7 , g/L g/ Bauer y Dicks, 2004 La degradación del ácido cítrico requiere glucosa, ya que O.oeni no puede emplear el ác. Cítrico como única fuente de carbono. Mayor concentración de ác. cítrico se asocia con mayor concentración de diacetilo, pero también con mayor conc. de ác. ác acético Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino Presencia de azúcares fermentescibles en el vino Factores que afectan la producción de diacetilo en vino 3 fases Fase I: Crecimiento celular, consumo de azúcares, producción de lactato Limitada producción de acetato. lactato. acetato No hay ataque al ác. Málico ni al ác. Cítrico. Fase II: Cesa el consumo de azúcares. Fase estacionaria del c ecimiento cel crecimiento celular. la Se inicia el catabolismo del ác. ác Málico y la producción de lactato. No hay producción de acético. F Fase III III: Fase estacionaria del consumo de malato. Se inicia catabolismo t b li del d l citrato it t y producción d ió de d acetato. t t Factores q que afectan la producción p de diacetilo en vino La citrato liasa es reprimida por glucosa Citrato liasa El crecimiento de las bacterias durante la FML,, puede p provocar p una considerable producción de ácido acético, si hay suficientes azúcares durante la FML. Factores que afectan la producción de diacetilo en vino SO2 El SO2 reacciona con las funciones aldehído y cetona Combina con diacetilo en forma reversible y exotérmica, el pierde su aroma característico. diacetilo combinado p El SO2 reduce la cantidad de diacetilo libre libre, disminuyendo el descriptor manteca en el vino. Disminuye el SO2 libre, aumenta el carácter manteca. Mayor y percepción p p de diacetilo a mayor y temperatura. p Factores que afectan la producción de diacetilo en vino Contacto con el aire durante la fermentación La conversión de acetolactato a diacetilo es una decarboxilación no enzimática, se ve favorecida en presencia de oxígeno. Diacetilo formado en anaerobiosis= anaerobiosis 2 mg/L Diacetilo formado en semiaerobiosis= 12 mg/L Diacetilo presente 20 días después de finalizada FML= 0,5 mg/L Vino chardonnay Nielsen, J. C.; Richelieu; M.; 1999. Citado por Bartowsky & Henshke, 2004 Factores que afectan la producción de diacetilo en vino Contacto con borras de levaduras S h Saccharomyces cerevisiae i i es capaz de d producir d i y de d degradar diacetilo. La presencia de borras de levaduras levaduras, especialmente si son agitadas, disminuye el tenor de diacetilo. Vino Pinot noir Fin de FA= 0,5 mg/L de diacetilo Fin de FML =3,9 =3 9 mg/L de diacetilo Después de filtración y sulfitado=1,7 mg/L Conservación sobre borras por 4 semanas = 0 0,2 2 mg/L Las borras son bioquímicamente activas y reduce el diacetilo a acetoína y butanodiol. Krieger et al, 2000 citado por Bartowsky & Henshke, 2004 Reacciones del diacetilo con otros compuestos Diacetilo + malv. malv 3 glucósido = derivados del tipo Castavinol (incoloros) Diacetilo + cisteína = aromas azufrados,, florales, frutados, tostados, carnes asadas Casta inol Castavinol Antociano Diacetilo C t i l Castavinol Castagnino et al al,1996 1996 Otras modificaciones del aroma Acetato de etilo Umbral : 10 mg/L p frutal descriptor: descriptor: solvente, a mayores concentraciones Lactato de etilo Umbral:90 mg/L descriptor: frutal Producción de glicosidasas Precursores aromáticos Depende p de la cepa p de bacterias y de la variedad de uvas. Viognier vs Muscat Azúcar + monoterpenos = inodoro Azúcar + monoterpenos + β glicosidasa = hidrólisis = = terpeno p libre aromático Ejemplos: 3 hidroxidamascenona, alfa terpineol, vainillina, metil vainillato, linalol, nerol y geraniol Producción de glicosidasas Oenococcus oeni hidroliza precursores aromáticos glicosilados, por acción de β- glucosidadas. A pH más elevado, mayor actividad de la enzima U li Ugliano et al. l JJ. A A.Food F d Ch Chem., 2003 2003, 51, 1 5073-5078 0 3 0 8 Producción de glicosidasas Ataque a los antocianinas s β glicosidasa li id El aglucón es incoloro o pardo Se pierde el color rojo original Gusto (olor) a “Ratón” Ratón Metabolismo de aminoácidos Heterofermentativos 2-acetil 2 til tetra t t hid hidro piridina i idi 2-acetil 1-pirrolidina 2 etill tetra hidropiridina 2hd d Homofermentativos Mínima o nula p producción Lisina Ornitina Oenococcus oeni, L Leuconostoc t mesenteroides t id algunos Lactobacillus Gusto (Olor) a Ratón Mousy off flavors Pediococcus Lactobacillus plantarum Gusto (olor) a geranio COOH CH CH CH CH CH3 Ác.sórbico No tóxico para seres humanos Fungistático: inhibe levaduras no afecta a las bacterias Límite legal: 200 mg/L (INV R N° C.8/2010) Gusto (olor) a geranio At Ataque d dell ác. á Sórbico Só bi por las l bact. b t Lácticas Lá ti Sorbil alcohol 2,4 hexadien 1 ol + etanol 2-etoxi-hexa 3,5 dieno : olor a geranio Umbral de percepción: 100 ng/L Ocurre cuando no hay suficiente SO2 para controlar a las bacterias Este defecto no se puede corregir • Producción de fenoles volátiles Degradación de ác. cinámicos Pediococcus (algunas cepas) Lactobacillus actobac us b brevis e s Lactobacillus plantarum Oenococcus (algunas cepas) Producción de fenoles volátiles Degradación de ác. tartárico Lactobacillus En condiciones aeróbicas Producción P d ió de d ác. á acético, éti lá láctico ti y succínico D Degradación d ió del d l acetaldehido ld hid Algunas cepas de Oenococcus oeni Lactobacillus Acetaldehido ácido acético etanol Potencial liberación de SO2 FML incompleta o prolongada Degradación g del glicerol g Solo: Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii Pediococcus pentosaceus p Glicerol 3 hidroxi propionaldehido Conservación prolongada en medio ácido Acroleína Reacción con fenoles del vino Compuesto amargo Sensaciones táctiles asociadas a la producción de polisacáridos Pediococcus damnosus Biosíntesis de polímeros exocelulares polisacáridos β -d- Glucano Oenococcus oeni tiene actividad de tipo β -dGl Glucosidasa id Sensaciones táctiles asociadas a la producción de polisacáridos Consecuencias Niveles excesivos Vinos siruposos, desagradables Dificultades en las filtraciones Niveles moderados Mayor cuerpo y volumen en boca S Q Liu, S.Q. Liu 2002 Cambios en el color La intensidad colorante disminuye un 25% 30% El pH aumenta 0,1 a 0,25 unidades Los antocianos varían su color según el pH FML y el color de los vinos p pH AV g/L AT g/L /L IC Antoc. mg/L Testigo FML 3,82 , 0,19 5 01 5,01 1,026 , 673,6 4,01 , 0,36 3 90 3,90 0,764 , 657,8 Paladino, Galiotti, Formento, Rev. Fac. C. Agrarias, 2001 Perfil organoléptico del vino Malbec con y sin FML C o llo r 4 B o c a Am a rg o N a riz F ru ta d o 3 2 B o c a H e rb á c e o N a riz E s p e c ia s 1 0 B o c a Alc o h ó lic o B o c a Ac id e z B o c a U n tu o s id a d B o c a As trin g e n c ia B o c a F ru ta d o T e s tig go F ML M difi i Modificaciones higiénico hi ié i sanitarias it i Decarboxilación de los aminoácidos • Producción de Aminas biógenas : histamina >1 1 mg/L /L provoca reacciones i en personas sensibles ibl Causa picazón, problemas respiratorios, secreción nasal Vinos de pH alto, más histamina. Bacterias en contacto con el vino luego del fin de FML, más histamina. • Producción P d ió de d etil til carbamato b t Arginina urea etil carbamato Estabilidad microbiana Consumo de Nutrientes Producción de Toxinas Aumento A t d de pH H Desarrollo p posible de bacterias acéticas Estabilidad b l d d microbiana b La FML solo confiere estabilidad ante un nuevo ataque de bacterias lácticas. No surgirán problemas en la botella Finalmente: ¿Permitir la realización de FML ó no? ¿FML espontánea p ó Inocular bacterias? ¿Cuándo inocular? ¿Có ¿Cómo controlar t l ell proceso?? ¿Permitir q que se degrade g el ác. Cítrico? ¿Cuándo y cómo finalizar la FML? Bibliografía Bartowsky, E. Oenococcus oeni and malolactic fermentation- moving into the molecular arena. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2005, 11 (174-187). Bartowsky, E., Henschke,P. The “buttery” atribute of wine -diacetyl- desirability, spoilage and beyond. Int. J. of Food Microbiology. 2004. 96 (235-252). Bauer, R. and L.M.T. Dicks. Control of Malolactic Fermentation in Wine. A Review.S. Afr. J. Enol. Vitic. 2004. Vol. 25, No. 2. Castagnino, C.; Chèze, C.; Vercauteren, J. 1996 : les molécules des futurs millésimes bordelais? Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1997, 136, 19-36 Liu, S. Q. Malolactic fermentation in wine – Beyond deacidification. J. of Applied Microbiology. 2002, 92 (589-601). Paladino, S.; Galiotti, H.; Formento, J. La fermentación maloláctica y el color de los vinos tintos. Rev. Fac. C. Agrarias. 2001, Tomo XXXIII, N°2 (105-110). Swiegers, J.;Bartowsky, S k E.; Henschke,P.; hk Pretorius,I. Yeast and d bacterial b l modulation d l off wine aroma and d flavour.. fl Australian l Journal of Grape and Wine Research. 2005, 11 (139-173). Ugliano, M.; Genovese, A.; Moio, L. Hydrolysis of wine aroma precursors during malolactic fermentation with four commercial starter cultures of Oenococcus oeni. oeni J. J Agric. Agric Food Chem. Chem 2003, 2003 51 (5073-5078) (5073 5078) Yun Cai Gao et al, Inhibition of spoilage lactic acid bacteria by lysozyme during wine alcoholic fermentation. Aust. J. Grape and Wine Research.2002, 8 (76-83). Muchas Gracias
