Pruebas Bioquímicas: diferenciación de bacterias coliformes: Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio producto de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada genotipo bacteriano establece con el entorno son propias y características. Continuamos con la técnica de búsqueda de miembros del grupo de los coliformes: prueba completa Objetivo: Identificar a las bacterias que forman el grupo de coliformes fecales para establecer la naturaleza de la contaminación de las aguas muestreadas (rio, arroyo, etc.) Características de los coliformes: Bacilos Gram. negativos No formadores de esporas Utilizan la lactosa como fuente de carbono y energía, dando formación de gas en 48 hs a 35 ºC. Pero no todas las cepas asignadas taxonómicamente al grupo de los coliformes se ajustan necesariamente a la definición de los mismos, pues a veces no fermentan la lactosa o no producen gas al fermentarla… Pasos previos…preparación del material Pruebas IMViC I=Producción de Indol M=Reaccióón de Rojo de Metilo V=Reaccióón de Voges-Proskauer C=Utilización del Citraton Pruebas bioquímicas adicionales……prueba de la oxidasa, motilidad, catalasa. Cultivo joven y puro Tinción de Gram Gram Negativo Siembro en diferentes medios para Identificar su interacción con el medio y los desechos que produce Prueba Indol El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano (presente en el medio) con producción de indol. Medio SIM (agar) -Reactivo de Kovacs Luego de la siembra incubar durante 24 hs a 35 ºC. Al cabo de este tiempo añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color del halo formado Halo rojo: reacción + Halo amarillo: reacción Prueba del Rojo de Metilo y Voges-Proskauer Esta prueba se fundamenta en el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan de la fermentación de la glucosa La fermentación n ácido-mixta La fermentación del 2,3 n-butanodiol Rojo de Metilo busca…… Fermentación ácido-mixta Glucosa ácido láctico, acético y succínico, etanol, H2 y CO2 Voges-Proskauer busca…… vía de fermentación del butanodiol Glucosa acetil-metil-carbinol butanodiol Medio RM/VP o Clark y Lubs Se siembran dos tubos del mismo medio y con el mismo material. Uno para prueba de RM y el otro para la prueba de VP. Incubar a 35°C durante 5 días Reactivo prueba de VP: Solución de naftol e K(OH) Color rojo/fucsia: reacción (+) Color marrón: reacción (–) Reactivo prueba de RM: solución indicadora Rojo de Metilo Halo rojo: reacción (+) Halo amarillo: reacción (-) Prueba del Citrato Determinación sobre la capacidad de un organismo de utilizar citrato como única fuente de carbono y energía. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarán iones amonio lo cual basificará el medio. El medio utilizado contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul bromotimol, como indicador de pH. Agar citrato de Simons Siembra en una sola estría en pico de flauta. Incubar durante 48 hsa 35 ºC. Al cabo de este tiempo añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color del halo formado Crecimiento a lo largo de la estría y color azul: reacción + Sin crecimiento y color verde: reacción – Prueba TSI El agar triple azúcar hierro es un medio de cultivo diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Además permite averiguar la producción de sulfhídrico, muy común en Salmonella El medio es un agar, ubicado en pico de flauta. Se siembra por punción y por estría. Incubar 24 hs. a 35ºC. Los resultados son indicados por el viraje de color del medio de rojo a amarillo. Según la ubicación del color se leerá fermentación de la glucosa, la lactosa y/o la manosa. El desplazamiento fermentación del medio hacia arriba indica la producción de gas. La aparición de color negro indica la producción de H2S.