Sustratos para la multiplicación viral

Sustratos para la multiplicación viral
Siendo los virus parásitos intracelulares obligados, necesitan un soporte vivo para replicarse.
Básicamente existen 3 tipos de sustratos para la multiplicación viral:
1- animales de laboratorio
2- huevos embrionados
3- cultivos celulares
1- Animales de laboratorio:
Desde que se lograron aislar los primeros virus al principio, se mantenían por pasajes en
animales de laboratorio. Sin embrago esto llevó en algunos casos a la selección de virus mutante
o de variantes virales; por ejemplo: el pasaje del virus polio en cerebro de mono seleccionó un
mutante que no pudo infectar más a chimpancés por vía oral (la ruta natural de infección). Si bien
los cultivos celulares reemplazaron a los animales para la propagación viral, algunos virus no
pueden crecerse así (ejemplo: virus Norwalk, que causa gastroenteritis).
La infección experimental de animales de laboratorio fue y es el procedimiento obligatorio
para estudiar los procesos de patogénesis viral, cómo un virus causa enfermedad. Se necesita para
entender cómo reacciona el sistema inmune o los órganos complejos frente a la infección viral,
para el desarrollo y prueba de vacunas, drogas antivirales y ensayos de diagnóstico.
Los animales más utilizados actualmente son los ratones.
2- Huevos embrionados:
Este fue también un sustrato muy utilizado para la propagación viral previo al advenimiento
de los cultivos celulares. Una o dos semanas luego de la fertilización del huevo, se inocula
asépticamente el virus, usando jeringa y aguja, a través de un agujero que se realiza en la cáscara;
este agujero se sella con parafina y los huevos se incuban durante 2 o 3 días para permitir la
multiplicación viral. Los huevos embrionados contienen diferentes tipos de células y tejidos en los
que varios virus pueden replicarse, por ejemplo la membrana corio-alantoidea para herpesvirus o
la cavidad amniótica o cavidad alantoidea para influenza.
Los huevos embrionados se usan hoy de rutina para el virus influenza, por la alta producción
viral en este sustrato; se usa para aislamiento y para la producción de vacunas.
3- Cultivos celulares:
Este es el método más común para propagar virus. Son células aisladas que pueden crecer in
vitro, ya sea en monocapa o en suspensión. Existen 3 tipos de cultivos celulares:
a) Cultivos celulares primarios: se obtienen por disgregación de tejidos embrionarios frescos
(por disrupción mecánica y tratamientos con enzimas proteolíticas como la tripsina).
Conservan el número normal de cromosomas (por ejemplo, 60 en el bovino). Si bien estas
células tienen un alto índice mitótico, los cultivos primarios soportan bajo número de
pasajes, no más de 8-20 divisiones. Se usan cuando no hay líneas celulares apropiadas para
el virus en cuestión y en la producción de vacunas a virus atenuado (por ejemplo: células
primarias de riñón de mono para el virus polio).
b) Células diploides: población homogénea de un tipo celular único; puede dividirse más de
100 veces y conservan su número diploide de cromosomas. Las más usadas son las
establecidas a partir de embriones humanos, como las WI-38 (de pulmón).
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c) Líneas celulares continuas: son las más usadas; es un único tipo celular que se propaga
indefinidamente en cultivo. En su origen han sido cultivos primarios, cuyas células han
sido transformadas artificialmente (con químicos mutagénicos o con un virus tumoral) o
provienen de tumores; por lo tanto, no conservan el número normal de cromosomas de la
especie (son aneuploides). Generalmente no conservan la morfología de las células de
origen, son menos diferenciadas y perdieron ciertas propiedades bioquímicas. Las líneas
celulares dan una población uniforme de células, por eso se las utiliza por ejemplo para
análisis de curvas de crecimiento viral o estudios bioquímicos de la replicación viral.
Ejemplos de líneas celulares: MDBK (de riñón bovino), BHK-21 (de riñón de hamster
bebé), HEp-2 (de epitelio humano), Vero (de riñón de mono verde africano), MT-2 (de
linfocitos humanos), etc.
Los cultivos celulares pueden crecer en monocapa, cuando son de tipo epitelial o
fibroblástico (sobre el fondo plano de una botella de cultivo o de una placa de cultivo); o en
suspensión en el medio de cultivo, cuando son células de tipo linfoideo que no se adhieren
entre sí.
Requerimiento de los cultivos celulares:
Las células, para desarrollarse, necesitan un medio de cultivo adecuado que debe tener los
nutrientes esenciales disueltos en una solución salina balanceada, por ejemplo Na, K, Ca, Cl,
fosfatos, bicarbonato, vitaminas, azúcares como fuente de energía y aminoácidos. Estos
medios de cultivo se comercializan en polvo (para hidratar luego con agua destilada estéril) o
en forma líquida. Ejemplos de medios de cultivo: MEM, DMEM, Earle. Para el desarrollo
celular, a estos medios de cultivo se les agrega suero fetal bovino (SFB) que posee algunos
nutrientes macromoleculares (factores de crecimiento) indispensables para la multiplicación
celular. Generalmente se usa SFB al 5 o 10% en el medio de cultivo. Los medios de cultivo se
ajustan a pH fisiológico de 6,8 a 7,4.
Además, las células necesitan crecer a 37ºC, con una tensión de CO2 de 2 a 5% y humedad
constante. Esto se logra en una estufa de cultivo.
Manejo de los cultivos celulares en el laboratorio:
Para la observación de los cultivos celulares se necesita un microscopio invertido, que
posee la fuente de luz en la parte superior y los objetivos y oculares en la parte inferior de la
platina, de modo de poder observar las células que están adheridas en el piso de las botellas o
placas. En el caso de las células que crecen en monocapa, se dice que el cultivo está en
confluencia cuando las células ocupan la totalidad de la superficie de la botella y están en
buenas condiciones morfológicas. Al llegar al 100% de confluencia, las células tienen una
inhibición por contacto y dejan de crecer.
Por eso, para mantener los cultivos celulares, hay que hacer pasajes sucesivos antes que
las células alcancen el 100% de confluencia. Las células pueden desprenderse entre sí y de la
botella utilizando enzimas que rompen los puentes intercelulares, como la tripsina. Luego de
esta separación, las células se cuentan, se diluyen en medio de cultivo a razón de 1:3 o 1:5 o
1:10 (dependiendo del tipo celular), se distribuyen en varias botellas y se coloca nuevamente
en la estufa de cultivo. Las células que crecen en suspensión no necesitan tratamiento con
tripsina; sólo se las cuenta, se las diluye y se las coloca nuevamente en cultivo.
Para el control de viabilidad de las células (para saber el porcentaje de células vivas en mi
cultivo) se usan generalmente 2 tipos de colorantes: naranja de acridina-bromuro de etidio, que
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tiñe de verde fluorescente las células vivas y de naranja las muertas, o azul tripán, que deja
incoloras las células vivas y tiñe de azul las muertas. Este segundo es el más usado ya que la
visualización se realiza en un microscopio de luz blanca; para el naranja de acridina-bromuro
de etidio se necesita un microscopio de luz fluorescente.
Congelado y descongelado: Los cultivos celulares pueden conservarse congelados, bajo
condiciones óptimas, y descongelarse para ser utilizados posteriormente. Para ser congeladas,
las células tienen que tener al menos un 80% de viabilidad; se colocan en medio de cultivo
nuevo con al menos 20% de SFB y el agregado de 10% de dimetil-sulfóxido (DMSO), que es
un protector de membranas celulares, en un criotubo. El congelamiento debe ser progresivo:
colocar los tubos 1 hora a 4ºC, luego varias horas a -20 o -80ºC y finalmente en un termo con
nitrógeno líquido (-196ºC); así pueden conservarse varios años o décadas. El descongelado de
las células debe ser rápido para evitar el daño de las membranas celulares. Se saca el tubo
criogénico del termo de nitrógeno, se coloca a baño maría a 37ºC, antes que terminen de
descongelarse las células se colocan en una botella con medio de cultivo completo (con al
menos 10% de SFB) y se lleva a la estufa de cultivo. Conviene siempre hacer un control de
viabilidad celular luego del descongelado.
IMPORTANTE: Todo manejo de los cultivos celulares se realiza en absoluta esterilidad,
es decir, dentro de las cabinas de flujo laminar.
Área de Virología – FCV - UNCPBA
Autor: Dra. Guillermina Dolcini
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