Agrobacterium

Transformación mediada por Agrobacterium de cultivos celulares de vid
M.Y. Chu1, 2, C. Quiñonero2, H. Akdemir1, N. Alburquerque1, M.A. Pedreño2, L. Burgos1
1
Grupo de Biotecnología de Frutales. Departamento de Mejora Vegetal. CEBAS-CSIC.
Campus de Espinardo. Apartado de correos 164. 30100 Espinardo (Murcia), Spain
2
Departamento de Biología Vegetal (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología.
Universidad de Murcia. Campus de Espinardo (Murcia), Spain
La transformación genética de cultivos celulares de vid puede permitir la modificación de
determinadas rutas bioquímicas y la alteración del metabolismo secundario induciendo la
producción elevada de determinados compuestos de interés como el resveratrol. Los
protocolos más utilizados para su transformación se basan en los mediados por
Agrobacterium, utilizando como material vegetal callos y cultivos celulares
embriogénicos. Sin embargo, prácticamente no existen estudios que describan la
transformación de cultivos celulares indiferenciados.
En la presente comunicación se han optimizado diferentes factores que incrementan el
proceso de transformación mediada por Agrobacterium de cultivos celulares de vid,
variedad Monastrell. Se ha utilizado la cepa LBA4404 conteniendo el plásmido
pMOG800 portador del gen de resistencia a antibióticos aminoglicósidos (nptII) y un gen
que codifica una proteína fluorescente (eyfp), este último conteniendo un intrón para
evitar su expresión en la bacteria. Además, se han realizado infecciones en diferentes
momentos del crecimiento de los cultivos celulares con el fin de determinar cuándo las
células son más receptivas a la infección y a la transferencia de los transgenes. El cocultivo se realizó sobre papel de filtro humedecido con medio de cultivo y se optimizó la
densidad celular, la eliminación posterior de la bacteria y la selección de las células
transformadas. Para esto último se han realizado estudios de viabilidad celular en
presencia de diferentes concentraciones de los antibióticos aminoglicósidos kanamicina y
paromomicina. La kanamicina resultó ineficaz mientras que con paromomicina se
pudieron seleccionar las células transformadas a relativamente bajas concentraciones, que
han dependido de la densidad celular utilizada en las placas de Petri.
Todos estos estudios han permitido obtener células expresando la proteína fluorescente
que se han dividido y dado lugar a microcallos transgénicos en medio selectivo. Los
microcallos han sido cultivados en medio líquido con diferentes concentraciones de
antibióticos con el fin de determinar las condiciones que permitan restablecer las líneas de
cultivos celulares transgénicos. Mientras las células control no fueron capaces de crecer
en ningún medio con antibiótico, incluso a bajas concentraciones, las líneas transgénicas
crecieron en las concentraciones más elevadas probadas como el control en medio sin
antibiótico.