M-040 - Universidad Nacional del Nordeste

Resumen: M-040
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Genotipificación de Trypanosoma cruzi
mediante la técnica de LSSP-PCR
Brusés, Bettina L. - Lucero, Raúl H. - Gorodner, Jorge O.
Instituto de Medicina Regional
Av. Las Heras 727 (3500). Resistencia, Chaco. Argentina.
Teléfono: 03722-428213.
Fax: 03722-422793.
E-mail: rhlucero@bib.unne.edu.ar
Antecedentes y fundamentos
Los pacientes de áreas endémicas pueden infectarse por múltiples contactos con diferentes triatomineos, y éstos, a su
vez, se pueden alimentar de diferentes individuos infectados. Esta “promiscuidad” es propicia para la formación de
poblaciones multiclonales tanto en los hospedadores como en los vectores, produciéndose así el aislamiento de cepas
multiclonales cuando crecen en cultivo.
El estudio de poblaciones de T. cruzi de diferentes orígenes, ha demostrado la presencia de un gran número de cepas
con características biológicas, inmunológicas, bioquímicas y de respuesta farmacológica diferentes.
Las isoenzimas, (formas moleculares diferentes de una misma enzima, detectadas por electroforesis) han sido
ampliamente utilizadas para clasificar al Trypanosoma cruzi. Diferentes zimodemos (grupo de cepas que comparten el
mismo patrón isoenzimático para un set de enzimas) han sido detectados en cepas aisladas de varios hospedadores y
regiones geográficas, permitiendo la tipificación de las poblaciones.
Debido al polimorfismo biológico, diferentes clones de una cepa podrían presentar un tropismo especial por diferentes
tejidos y así ser un factor determinante en el curso clínico de la enfermedad. Esto constituye el centro de lo que se llamó
“modelo histotrópico clonal” de la Enfermedad de Chagas. (Macedo et al. 2002).
El ADN kinetoplastídico de Trypanosoma cruzi representa el único ADN mitocondrial de estos protozoos. Consiste en
dos moléculas específicas, minicírculos y maxicírculos, que están unidos en una única gran red de ADN situada cerca
del corpúsculo basal del flagelo. Existen aproximadamente 20.000 minicírculos y 40 maxicírculos por red. (Simpson,
2000).
La variabilidad genética de los minicírculos de ADN puede ser estudiada con una diversidad de técnicas entre las cuales
están las: endonucleasas de restricción (RFLP) y LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer-PCR).
En el protocolo de PCR de dos fases, denominado LSSP-PCR, un fragmento de ADN purificado es sometido a PCR
utilizando un solo primer específico bajo condiciones de muy baja astringencia. El primer hibridiza específicamente a
una región complementaria y también en forma no específica a múltiples sitios dentro del fragmento, en una manera
dependiente de la secuencia, produciendo un set altamente complejo de productos de reacción, que puede ser resuelto
por electroforesis generando un sello genético particular.
La técnica de LSSP-PCR se ha aplicado satisfactoriamente al fragmento de ADN variable de 330 pb correspondiente a
los minicírculos del kDNA, produciendo patrones de kDNA específicos.
Es evidente que no existe una única técnica que reúna todos los criterios que la encuadren dentro de la técnica ideal
como método de estudio para el polimorfismo genético de T. cruzi, por lo tanto es importante tener un menú de
protocolos, o al menos varios métodos diversos cuando se quiere abordar este tema.
Los aspectos genéticos del parásito, juegan un papel muy importante en la patogénesis de la Enfermedad de Chagas,
como así también en la determinación de los tejidos que se verán afectados.
El propósito del siguiente trabajo es poder caracterizar genéticamente las diferentes cepas de T. cruzi circulantes en
nuestra región de manera de intentar obtener una correlación entre dichas cepas y su tropismo tisular (presentación
clínica de la enfermedad).
Materiales y Métodos:
Extracción de las muestras: Se obtuvieron 62 muestras de la localidad de Presidencia de la Plaza (localidad
seleccionada debido a su alta incidencia de la infección chagásica). Se realizaron estudios serológicos a todas las
muestras para evaluar la presencia de anticuerpos contra el T. cruzi, HAI e IFI, tomando como valor de corte para
muestras positivas títulos ≥ 1/32.
Preparación del ADN: Se partió de 700 µl. de sangre entera, anticoagulada con EDTA 1%. Se eliminaron los glóbulos
rojos mediante 4 lavados con igual volumen de un buffer de lisis de glóbulos rojos (10 mM Tris-HCl pH 7.6; 5 mM
MgCl; 10 mM NaCl). Luego se incubó a 60ºC durante 1 hora aproximadamente, con una solución de homogeneización
(2% (p/v) de CTAB; 1,4 M de NaCl; 0,2% (p/v) β-mercaptoetanol; 20 mM EDTA; 100 mM Tris-HCl pH 7.5).
Posteriormente, se procedió a la extracción de proteínas con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Con
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posterioridad a la centrifugación, la solución quedó dividida en 3 fases: una fase superior o acuosa, donde están, en
solución, los ácidos nucleicos; una fase intermedia o interfase, que contiene las proteínas; y una fase inferior, en la que
se concentraron los lípidos. La fase superior debió ser transvasada con cuidado a otro tubo Eppendorf. Luego se
precipitó esta fase acuosa con un volumen de alcohol isopropílico. Finalizada la centrifugación, se descartó el
sobrenadante, y se agregó 1 ml. de etanol 70%. Se centrifugó nuevamente, se descartó el sobrenadante, y se dejó
evaporar el resto de alcohol, luego se resuspendió el ADN obtenido en buffer TE o agua destilada estéril.
Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Esta técnica incluyó principalmente los pasos que se detallan
a continuación:
Se preparó la mezcla de reacción en un volumen final de 25 µl, conteniendo agua destilada estéril; buffer 10X; Cl2Mg
50 mM; 100 mM de dNTP’s; 25 mM de cada uno de los primers: #121 y #122, dirigidos al el ADN kinetoplastídico
(Wincker et al., 1994); Taq Polimerasa, 2.5 µl de la muestra de ADN y 30 µl de aceite mineral.
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PTC-100 MJ Research, Inc., de acuerdo a las siguientes
condiciones de ciclado: 5 minutos a 95ºC; 1 minuto a 60ºC; 1 minuto a 72ºC; 33 ciclos de: 40 segundos a 94ºC, 40
segundos a 60ºC y 40 segundos a 72ºC, correspondientes a la desnaturalización, hibridización y extensión de los
primers respectivamente; y por último, 1 ciclo de 5 minutos a 72ºC como extensión final de los productos amplificados.
La visualización de los amplicones se realizó sobre gel de agarosa al 2% sembrando 9 µl. del producto amplificado, y 1
µl de buffer de corrida, realizando la corrida electroforética a 70 V. durante 45 minutos aproximadamente, tiempo y
voltaje necesarios para poder observar la banda de 330 pares de bases correspondiente al ADN kinetoplastídico.
Una vez finalizada la corrida electroforética, se tiñó el gel con bromuro de etidio y a continuación se lo colocó en el
transiluminador UV para la visualización de las bandas específicas.
Como control positivo se utilizó ADN extraído de cultivos de T. cruzi, cedidos por el Laboratorio Central de Salud
Pública del Chaco.
Como control negativo se empleó la mezcla Master Mix pero con el agregado de agua destilada en reemplazo del ADN
de las muestras.
Aislamiento del amplicón de 330 pb: Una vez constatadas las muestras PCR positivas se procedió a realizar una
segunda reacción de amplificación en idénticas condiciones a la anterior pero con un volumen final de 50 ul, lo que
permitió posteriormente sembrar 25 ul del amplificado en un gel de agarosa compuesto de 1/3 de Low Melting Point
Agarose y 2/3 de Agarosa común en una concentración final de 1,5%. Posteriormente en condiciones estériles se aisló
con bisturí la banda correspondiente a 330 pb, la que posteriormente fue eluída y fue utilizada como ADN molde para la
LSSP-PCR.
LSSP-PCR:. Se sometió el ADN purificado a la amplificación por PCR de la manera anteriormente descripta en
presencia del par de primers dirigidos contra el kinetoplasto.
Con los productos de amplificación de la primer PCR, se realizó una segunda reacción de PCR con condiciones de baja
astringencia: elevadas concentraciones de enzima (Taq ADN polimerasa), baja temperatura de annealing, y solamente
un único primer. Cuadro 1
Bajo estas condiciones, el oligonucleótido se hibridizó con elevada especificidad a su extremo complementario y con
baja especificidad a múltiples sitios dentro del fragmento generando un patrón electroforético altamente específico para
cada clon del parásito (Andrade et al., 1999). Se hizo una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 6% en
buffer TBE utilizando la cuba vertical, y posteriormente se tiñó el mismo con NO3Ag.
Cuadro 1. Condiciones de Master Mix para LSSP-PCR
REACTIVOS
CONCENTRACION FINAL
Agua
MgCl2 – 25 mM
Buffer 10X
dNTP`s – 2,5 mM
S35 – 450 pmol
Taq-polimerasa –
5U/µl
ADN
Aceite mineral
VOLUMEN/TUBO
6,5 µl
2,5 mM
1X
0,6 µl
1
µl
0,2 mM
0,2 µl
48 – 50 pmol
0,4 µl
1U
0,3 µl
3
µl
30
µl
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Discusión de los Resultados:
De las 62 muestras estudiadas, 26 resultaron con serología positiva (42%).
Hasta el momento se han realizado 32 PCR de las cuales 20 fueron positivas y 12 negativas. De las 20 PCR positivas,
12 eran serológicamente positivas, mientras que de las 12 PCR negativas, 7 tenían serología positivas con títulos bajos
(≤ 1/124), lo que explicaría el resultado negativo de la PCR. Tabla 1
Tabla 1: Relación entre Serología para enfermedad de Chagas y PCR
PCR positiva
PCR negativa
Total
Serología positiva
12
7
19
Serología negativa
8
5
13
Total
20
12
32
Para poner a punto la técnica de caracterización genética del parásito se estudiaron hasta el momento 3 muestras por
LSSP-PCR incluída la muestra de ADN del parásito cultivado por métodos convencionales.
Conclusión:
Los resultados hasta el momento obtenidos permitirían corroborar que la técnica de PCR sería más sensible que las
reacciones serológicas clásicas a la hora de evaluar infección por T. cruzi. Sin embargo en aquellos pacientes con
serología positiva y PCR negativa, deberán estudiarse más profundamente para ensayar una explicación al respecto.
Con respecto a los patrones genéticos obtenidos luego de la LSSP-PCR, si bien deben ser analizados mediante un
Software específico debido a la complejidad de las bandas obtenidas, puede observarse que las 3 muestras analizadas
poseen patrones bien diferenciados. Estos resultados preliminares deberán demostrar reproducibilidad, lo que se
obtendrá al procesar un mayor número de muestras, lo que también permitirá poder comparar patrones similares en
pacientes de la misma región.
Bibliografía:
Avila HA, Pereira JB y col. Detection of Trypanosoma cruzi in blood specimens of chronic chagasic patients by
polymerase chain reaction amplification of kinetoplast minicircle DNA: comparison with serology and
xenodiagnosis. J Clin Microbiol 1993; 31: 2421-6.
Dias JCP. Enfermedad de Chagas. Epidemiología-clínica-terapéutica. Programa de salud humana, Bs. As.: 1984:
106.
Escalante M, Montilla M, Nicholls RS, Del Portillo P, Puerta CJ. Extracción de ADN de Trypanosoma cruzi
mediante tratamiento con bromuro de hexadeciltrimetil-amonio. Biomédica 1997; 17: 120-125.
Gomes NM, Macedo AM, Vago AR, Pena SDJ, Galvao LM, Chiari E. Trypanosoma cruzi: optimization of
polymerase chain reaction for detection in human blood. Exp Parasitol 1998; 88: 28-33.
Köberle F. Patología y anatomía patológica de la enfermedad de Chagas. Bol of San Pan 1961; 51: 404-427.
Rosenbaum MB, Alvarez AJ. The electrocardiogram in chronic chagasic myocarditis. Am Heart J 1955; 7: 492527.
Lucero RH. Informe de Pasantía de capacitación. Caracterización genética de Trypanosoma cruzi mediante la
técnica de LSSP-PCR..Facultad de Medicina de Triángulo Mineiro (Uberaba-Brasil).2002.
Macedo AM, Pena SDJ. Genetic variability of Trypanosoma cruzi: implications for the pathogenesis of Chagas
disease. Parasitol Today 1998; 14: 119-123.
Macedo AM, Oliveira RP, Andrade LO, Chiari E, Galvao LM, Reis D, Pereira ME, Simpson AJ, Tostes S, Pena
SD. Kinetoplast DNA signatures of Trypanosoma cruzi strains obtained directly from infected tissues. Am J Pathol
1996; 149: 2153-2159.
Morel C, Chiari E, Camargo EP, Mattei DM, Romanha AJ, Simpson L. Strains and clones of Trypanosoma cruzi
can be characterized by pattern of restriction endonuclease products of kinetoplast DNA minicircles. Proc Natl
Acad Sci USA 1980; 77: 6810-6814.
Resumen: M-040
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Pena SDJ, Barreto G, Vago AR, De Marco LA, Reinach FC, Dias Neto E, Simpson. Sequence-specific "gene
signature" can be obtained by PCR with single specific primers at low stringency. Proc Natl Acad Sci USA 1994;
91: 1946-1949.
Rosenbaum MB, Alvarez AJ. The electrocardiogram in chronic chagasic myocarditis. Am Heart J 1955; 7: 492527.
Russomando G, Figueredo A, Almirón M, Sakamoto M, Morita K. Polymerase chain reaction-based detection of
Trypanosoma cruzi DNA in serum. J Clin Microbiol 1992; 30: 2864-2868.
Schofield CJ. Triatominae. Biología y control. Eurocommunica publications, West sussex, UK: 1994: 76.
Simpson L. The mitochondrial genome of kinetopiastid protozoa: genomic organization, transcription, replication,
and evolution. Annu Rev Microbiol 1987; 41, 363-382.
Storino R, Auger S, Wojdyla D, Urrutia MI, Jörg M. Análisis descriptivo multivariado de la enfermedad de Chagas
en 2260 pacientes. Rev Argen Cardiol 1998; 66: 17-39.
Tibayrenc M, Ward P, Moya A, Ayala FJ. Natural populations of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease,
have a complex multicional structure. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 115-119.
Vago AR, Andrade LO, Leite AA, d'Avila Reís D, Macedo A, Adad SJ, Tostes S, Moreira M, Filho GB, Pena S.
Genetic characterization of Trypanosoma cruzi directly from tissues of patients with chronic chagas disease. Am J
Pathol 2000; 156:1805-1809.
Wincker P, Britto C, Borges-Pereira J y col. Use of simplified polymerase chain reaction procedure to detect
Trypanosoma cruzi in blood samples from chronic chagasic patients in a rural area. Am J Trop Med Hyg 1994; 51
(6): 771-777.