INSTRUCCIONES DE USO – MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA USAR PA-254056.06 Rev.: April 2013 BD Yersinia Selective Agar (CIN Agar) BD Aeromonas Yersinia Agar USO PREVISTO BD Yersinia Selective Agar (=CIN Agar, Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin Agar) (agar selectivo para Yersinia BD: agar CIN [Cefsulodina-Irgasan-Novobiocina]) es un medio selectivo de diferenciación para el aislamiento de Yersinia enterocolitica y BD Aeromonas Yersinia Agar (agar para Aeromonas y Yersinia BD) es un medio selectivo de diferenciación para el aislamiento de Yersinia enterocolitica y Aeromonas spp. a partir de diversas muestras clínicas y no clínicas. PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico. BD Yersinia Selective Agar fue descrito por primera vez por Schiemann como una alternativa al agar MacConkey y otros medios comúnmente utilizados para el aislamiento de Yersinia enterocolitica, un agente causante de gastroenteritis1. Se ha determinado que este medio es superior a los agares MacConkey, SS, CAL y Y2. BD Aeromonas Yersinia Agar es una modificación de BD Yersinia Selective Agar que favorece el crecimiento de no sólo la especie Yersinia enterocolitica sino también de Aeromonas (que también puede causar enteritis) dado que presenta un contenido reducido de cefsulodina3,4. En ambos medios, las peptonas proporcionan nutrientes. La fermentación de manitol en presencia de rojo neutro crea el aspecto característico de “ojo de toro” de las colonias de Y. enterocolitica: incoloras con centros de color rojo en ambos medios. La inhibición selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta, desoxicolato sódico y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina. En BD Aeromonas Yersinia Agar, las especies Aeromonas producen colonias pálidas con centro rojo carmesí, similar a Yersinia. Ambos organismos pueden diferenciarse mutuamente por medio de la reacción de oxidasa (positiva sólo para Aeromonas)3-5. BD Yersinia Selective Agar y BD Aeromonas Yersinia Agar también pueden utilizarse para el aislamiento de las especies Yersinia diferentes de Y. enterocolitica, por ejemplo, para Y. pseudotuberculosis5. REACTIVOS Fórmulas* por litro de agua purificada BD Yersinia Selective Agar Digerido pancreático de gelatina Digerido péptico de tejido animal Extracto de carne bovina Extracto de levadura Manitol Piruvato sódico Cloruro sódico Desoxicolato de sodio 10,0 g 5,0 5,0 2,0 20,0 2,0 1,0 0,5 Sulfato magnésico Cristal violeta Rojo neutro Cefsulodina Irgasan Novobiocina Agar 0,001 g 0,001 0,03 0,015 0,004 0,0025 12,0 pH 7,4 ± 0,2 En lugar de 0,015 g de cefsulodina en BD Yersinia Selective Agar, BD Aeromonas Yersinia Agar contiene sólo 0,004 g de cefsulodina por litro de medio. *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. PA-254056.06 -1- PRECAUCIONES . Solamente para uso profesional. No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamientos o cualquier otro signo de deterioro. Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biológicos y desecho del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO. ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 °C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C. CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los detalles, véase el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar las placas en atmósfera aerobia a 25 ± 2 °C o 35 ± 2 °C y efectuar la lectura después de 20 – 24 y 42 – 48 h. Cepas Aeromonas hydrophila ATCC 7966 Yersinia enterocolitica ATCC 9610 Escherichia coli ATCC 25922 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Proteus mirabilis ATCC 14153 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Sin inocular BD Yersinia Selective Agar (CIN Agar) Inhibición de parcial a completa Crecimiento de bueno a excelente; colonia rosa pálido con un centro de color rojo oscuro (aspecto característico de “ojo de toro”)* Inhibición completa. Inhibición de parcial a completa Inhibición de parcial a completa Inhibición de parcial a completa Inhibición de parcial a completa BD Aeromonas Yersinia Agar Crecimiento de medio a bueno; colonia de incolora a rosa pálido con un centro de rosa a rojo Crecimiento de bueno a excelente; colonia rosa pálido con un centro de color rojo oscuro (aspecto característico de “ojo de toro”)* Inhibición completa. Inhibición de parcial a completa Inhibición de parcial a completa Inhibición de parcial a completa, crecimiento medio aceptable Inhibición de parcial a completa Rosa claro, ligeramente opalescente * Pueden presentar un color completamente rosa después de 42 – 48 h de incubación. PROCEDIMIENTO Materiales suministrados BD Yersinia Selective Agar (CIN Agar) o BD Aeromonas Yersinia Agar, ambos suministrados en placas Stacker de 90 mm. Controladas microbiológicamente. Material no suministrado Medios de cultivo auxiliar, reactivos y el equipo de laboratorio que se requiera. Tipos de muestras BD Yersinia Selective Agar es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento de Yersinia enterocolitica y BD Aeromonas Yersinia Agar es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento de especies de Aeromonas y Yersinia enterocolitica a partir de muestras fecales o torundas rectales humanas (véase también CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO). PA-254056.06 -2- Procedimiento de análisis Extender las muestras tan pronto como sea posible después de recibirlas en el laboratorio. La placa de extensión se utiliza principalmente para aislar los cultivos puros de las muestras con flora mixta. Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda, hacerla girar en una sección pequeña cercana al borde, extendiendo luego a partir de esta área inoculada. Las especies Aeromonas y Yersinia crecen bien a una temperatura entre 25 y 37 °C. La temperatura inferior es óptima para Yersinia y está recomendada para aislamiento primario. Incubar las placas a 25 – 32 °C durante 24 – 48 h. También debe inocularse con la muestra (e incubarse a 35 ± 2 °C) un medio menos selectivo, tal como BD MacConkey II Agar para la detección de otros patógenos involucrados en la infección. En algunas ocasiones, tal vez sea necesario realizar un procedimiento de “enriquecimiento en frío” para el aislamiento de Yersinia enterocolitica a partir de muestras fecales y otros materiales tales como alimentos: Inocular alrededor de 1 gramo de muestra en 8 – 12 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) y mantener a 4 °C durante un máximo de 21 días5,6 . Se puede realizar el enriquecimiento de Aeromonas en agua de peptona alcalina4,7. Subcultivar periódicamente desde el enriquecimiento correspondiente en las placas de cualquiera de los medios descritos en este documento, realizando la extensión para obtener aislamiento. Incubar las placas como se detalla anteriormente. Resultados Las colonias características de Yersinia enterocolitica presentarán centros de color rojo intenso rodeadas de un borde pálido y transparente que le da el aspecto de un “ojo de toro” en BD Yersinia Selective Agar y BD Aeromonas Yersinia Agar después de 24 horas de incubación. Después de 42 – 48 h de incubación, a menudo presentan un color completamente rosa. Yersinia pseudotuberculosis por lo general carece de la zona transparente alrededor de las colonias. Aeromonas produce colonias más pálidas, que también tienen un centro rojo carmesí y son positivas a la oxidasa. Aeromonas se pueden diferenciar fácilmente de Yersinia y otras Enterobacteriaceae mediante una prueba de oxidasa estándar (sólo Aeromonas spp. dará resultado positivo). Se requiere confirmación bioquímica y serológica para obtener una identificación completa de los aislados presuntivos. CARACTERISTICAS DEL RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO BD Yersinia Selective Agar (CIN) y BD Aeromonas Yersinia Agar son adecuados para el aislamiento de Yersinia enterocolitica a partir de muestras fecales humanas y otros materiales1,2,5-8. Además, BD Aeromonas Yersinia Agar se utiliza para el aislamiento de Aeromonas3-5,7,8. Aunque Yersinia puede recuperarse mediante extensión directa en placa, las muestras con recuentos viables bajos pueden necesitar enriquecimiento en frío (4°C) en solución tamponada con fosfato5,7. Sin embargo, el enriquecimiento en frío tal vez no sea un método práctico debido a tiempo de incubación prolongado y porque selecciona las cepas no patógenas de Y. enterocolitica y otras especies de Yersinia5. El enriquecimiento de Aeromonas en agua de peptona alcalina puede resultar útil para aislar las poblaciones de organismos que liberan poca cantidad de organismos, por ejemplo, de pacientes portadores o en convalecencia4,7. En ambos medios descritos en este documento, también crecerán otras especies de Yersinia, tal como Y. pseudotuberculosis, Y. frederiksenii y Y. intermedia 5. El potencial patógeno de los dos últimos organismos es causa de polémica, pero, en la actualidad no se deben desestimar los aislados5. Se recomienda la fórmula de BD Aeromonas Yersinia Agar y no BD Yersinia Selective Agar para el aislamiento de Yersinia pestis5. Las especies Enterobacteriaceae diferentes de Yersinia pueden crecer en estos medios, en especial la Citrobacter. Serratia y Citrobacter no siempre se pueden diferenciar fiablemente de Yersinia por la morfología de las colonias exclusivamente. Por tanto, son necesarias pruebas PA-254056.06 -3- bioquímicas y serológicas para obtener la confirmación e identificación completas de los aislados. Determinadas cepas de Aeromonas pueden producir un crecimiento débil en BD Aeromonas Yersinia Agar. Se recomienda incluir medios de aislamiento adicionales para la recuperación de la población total de estos organismos. REFERENCIAS 1. Schiemann, D.A. 1979. Synthesis of a selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J. Microbiol. 25:1298-1304. 2. Head, C.B., D.A. Whitty, and S. Ratnam. 1982. Comparative study of selective media for recovery of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 16:615-621. 3. Altorfer, R., et al. 1985. Growth of Aeromonas spp. on cefsulodin-irgasan-novobiocin agar selective for Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 22: 478-480. 4. Abbott, S.L. 2003. Aeromonas. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5. Bockemühl, J., and J.D. Wong. 2003. Yersinia. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. Weissfeld, A.S. and A.C. Sonnenwirth. 1982. Rapid isolation of Yersinia spp. from feces. J. Clin. Microbiol. 15:508-510. 7. Kist, M., et al. 2000. Infektionen des Darmes. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 9. Urban & Fischer, Munich, Germany. 8. Downes, F.P., and K. Ito. 2001. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4th edition. American Public Health Association (APHA). Washington, D.C. USA. ENVASE/DISPONIBILIDAD BD Yersinia Selective Agar (CIN) Nº de cat. 254056 Medios en placa listos para usar, 20 placas Nº de cat. 254088 Medios en placa listos para usar, 120 placas BD Aeromonas Yersinia Agar Nº de cat. 254443 Medios en placa listos para usar, 20 placas INFORMACIÓN ADICIONAL Para obtener más información, diríjase a su representante local de BD. 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