Utilización de marcadores moleculares en el análisis de la

Utilización de marcadores moleculares en el análisis de la variabilidad genética
de una población de mejoramiento de Eucalyptus grandis
*Acuña Cintia1,2, Torales Susana1, Marcó Martín3, Harrand Leonel3 y Marcucci Poltri Susana1.
1
-IRB-INTA- Castelar. Las Cabañas y Los Reseros. V. Udaondo. 2- UNLu. Rutas 5 y 7. Luján.
3
-EEA INTA- Concordia. Estación Yuquerí. CC 34 (3200).
E-mail: acucin@cirn.inta.gov.ar
Introducción
Los programas de mejoramiento genético forestal clásicos emplean la selección direccional,
caracterizando a los genotipos deseados mediante el empleo de marcadores morfo-dendrológicos.
En la actualidad, además se incorporan los marcadores moleculares para el estudio de la
estructura y diversidad genética de las poblaciones de mejoramiento.
Los marcadores moleculares detectan polimorfismos a nivel de ADN, proporcionando el perfil
genético de cada individuo (huella dactilar genética del ADN). Entre los más utilizados se
encuentran: los AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism), de herencia dominante, amplia
cobertura genómica y que proporcionan una gran cantidad de fragmentos amplificados por
ensayo; y los SSR (Simple Sequens Repeats) o microsatélites, multialélicos, de gran abundancia y
amplia distribución en el genoma, que al ser de carácter codominante permiten determinar el
estado alélico de cada locus. Para la instalación de un huerto semillero se debe contemplar la
existencia y conservación de una base genética suficientemente amplia para asegurar ganancias
genéticas en etapas avanzadas del programa de mejoramiento (Gaiotto et al., 1997).
Los marcadores moleculares permiten conocer los niveles de variabilidad genética de la que se
dispone en la población de mejora, permitiendo una flexibilidad y control de la reducción de la
variabilidad existente (Grattapaglia, 2000).
Objetivos
Caracterizar y cuantificar la variabilidad genética de 45 árboles de Eucalyptus grandis
preselectos por sus características de interés forestal (crecimiento y forma) mediante
marcadores moleculares (AFLPs y SSRs), pertenecientes a un ensayo de orígenes y
procedencias plantados en Concordia (Entre Ríos) y Gral. Virasoro (Corrientes).
Monitorear la diversidad genética de 30 individuos selectos a partir de este ensayo
(minimizando la inclusión de medios hermanos) por mejores índices por mérito genético y
valorar la similitud genética promedio para integrar un huerto semillero clonal.
Metodología
Los genotipos fueron analizados mediante AFLPs (268 loci polimórficos) y 5 loci microsatélites
(EMBRA 2, EMBRA 5, EMBRA 6, EMBRA 10, EMBRA 21). Se analizó la variabilidad genética de
la población estudiada mediante:
Indices de similitud de Jaccard entre pares de genotipos (suma del número de fragmentos de
ADN de igual movilidad en relación al total de fragmentos del par de individuos).
Indices de diversidad (ID) o heterocigosidad esperada (He)=1-∑pi2 (pi=frecuencia de cada
alelo).
Resultados
La similitud promedio (AFLP) entre pares de genotipos resultó de 0.452 (d.e. 0.059), sugiriendo
poca relación entre ellos, a pesar de existir genotipos medio-hermanos.
El análisis de agrupamiento no reveló ninguna asociación particular entre individuos. A partir de
éste se detectó que el individuo 93-2 perteneciente al sitio Concordia es el más disímil del resto,
siendo un candidato a integrar el huerto semillero clonal (Fig. 1).
Figura 1. Dendrograma de los individuos analizados mediante AFLP, generado mediante UPGMA
y el índice del Jaccard. Se indica, en rectángulos coloreados, los medio-hermanos agrupados
Dendrograma
Poblaciones de Virasoro y Concordia
0.31
0.40
0.48
v5-12
v21-20
v22-15
v34-13
v93-15
v158-2
v182-10
v182-13
v167-1
v33-1
v33-20
c154-20
v189-5
c5-3
c33-20
c39-5
c1-3
c1-18
c32-17
c32-20
c38-11
c129-19
c148-20
c145-2
c145-9
c21-9
c22-5
c22-11
c28-10
c112-10
c33-15
c190-7
c28-15
c182-5
c182-7
c194-1
v121-2
c121-9
c121-15
v186-2
c152-5
c152-9
c169-17
v28-11
c93-2
0.57
0.66
Coefficient
Coeficiente de similitud de Jaccard
Se analizó el grado de confianza de los índices de similitud obtenidos a partir de 268 variables
(bandas) de AFLPs. El análisis de remuestreo (bootstrap) realizado para este fin mostró que el
coeficiente de variación resultó inferior al 10%, utilizando como mínimo 240 bandas de AFLPs
(Fig. 2).
Figura 2. Grado de confianza de los
índices de similitud obtenidos
mediante AFLP: Análisis de remuestreo (bootstrap).
Se representa en el eje X el número
de bandas computadas en cada
muestra y en el eje Y los valores
promedio de los coeficientes de
variación obtenidos para cada grupo
de datos.
El índice de diversidad (ID) promedio para estos loci de AFLP fue de 0,29 (d.e. 0,15),
relativamente elevado si se tiene en cuenta que el valor máximo que puede adquirir este índice es
de 0,5 para marcadores de tipo dominante.
El grado de polimorfismo de la población estudiada mediante 5 microsatélites resultó elevado,
detectándose un total de 95 alelos con un promedio de 19 (d.e. 4,6) alelos por locus. Todos los
genotipos fueron diferenciados a partir del análisis de sólo 2 microsatélites (EMBRA_5 y
EMBRA_6).
El ID o heterocigosidad esperada promedio fue de 0,910 (d.e. 0,017), acreditando su alto poder
discriminatorio. Para todos los loci microsatélites, la heterocigosidad observada resultó inferior a la
esperada.
Se seleccionaron los 30 individuos, en su mayoría no emparentados, con buenos índices por
mérito genético para integrar el huerto semillero clonal. La similitud genética promedio de los 30
individuos fue de 0,444 (d.e 0,059), evidenciando una baja similitud promedio entre ellos. Todos
los parámetros evaluados del huerto selecto (promedio de ganancia en volumen, forma y
combinación de ambas y similitud genética) fueron comparados con 150 huertos construidos al
azar sin reposición y sin considerar la limitación de incluir medios hermanos, evidenciando las
buena performance del grupo selecto (baja similitud, buen crecimiento e índice combinado (Fig. 3).
Figura 3. Histogramas de los
índices de similitud genética,
ganancia en volumen (Volgain),
forma (Formgain) y ganancia
combinada (Index) de los
individuos del huerto propuesto
(flechas) y 150 grupos de 30
genotipos cada uno construidos
al azar sin reposición
Además se estimó que en el proceso de selección se perderá un bajo porcentaje de loci AFLPs
(0,75%) y de alelos microsatélites (8,42%) lo cual permitirá conservar el máximo el potencial
genético existente.
Conclusiones
El empleo de marcadores moleculares utilizados en este trabajo evidenció una baja similitud
promedio entre los individuos estudiados. Cada genotipo fue distinguido del resto reflejando el
elevado potencial de ambas técnicas (AFLPs y SSRs).
Los índices de similitud entre individuos obtenidos a partir de 268 loci AFLPs poseen un grado
de confianza aceptable y cuyo análisis de cluster (UPGMA) es una buena representación de
dichos índices , observándose agrupación de algunos medio-hermanos. El genotipo c93-2
resultó el más disímil del resto, siendo un candidato para cruzamientos controlados que
potencialmente favorezcan la heterosis.
El estudio mediante SSRs permitió determinar que la población estudiada posee un elevado
grado de polimorfismo.
A partir de 45 individuos de E. grandis se seleccionaron 30 con buenas características
forestales de interés (crecimiento y forma), baja similitud genética y con los cuales se perderán
una baja proporción de alelos.
Bibliografía
Gaiotto, F.A. y Grattapaglia, D.; 1997. Estimation of genetic variability in a breeding population
of Eucalyptus urophylla using AFLP markers. Conferencia IUFRO sobre Silvicultura e
Melhoramento de Eucaliptos. Salvador, Brazil. August, 1997; 46 p.
Grattapaglia, D.; 2000. Molecular Breeding of Eucalyptus : Stage of the Art, Operational
Applications And Technical Challenges. En: Molecular Markers and Genome Mapping in
Woody Plants. Jain, S.M. Minocha, S.C. (editores), pp 451-474.