peptidos capaces de unirse al dominio sh3 de la proteina

19
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 248 800
51 Int. Cl. : C12N 15/12
7
C07K 14/47
A61K 39/395
C12Q 1/68
A61K 38/17
G01N 33/53
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 95941126 .5
86 Fecha de presentación : 22.11.1995
87 Número de publicación de la solicitud: 0793721
87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.09.1997
54 Título: Péptidos capaces de unirse al dominio SH3 de la proteína GAP, secuencias nucleotídicas codificado
ras para estos péptidos, su preparación y su utilización.
30 Prioridad: 22.11.1994 FR 94 13955
16.05.1995 FR 95 05753
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.03.2006
73 Titular/es: Aventis Pharma S.A.
20, avenue Raymond Aron
92165 Antony Cédex, FR
72 Inventor/es: Duchesne, Marc;
Faucher, Didier;
Parker, Fabienne;
Schweighoffer, Fabien y
Tocque, Bruno
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Díez de Rivera y Elzaburu, Ignacio
ES 2 248 800 T3
16.03.2006
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 248 800 T3
DESCRIPCIÓN
Péptidos capaces de unirse al dominio SH3 de la proteína GAP, secuencias nucleotídicas codificadoras para estos
péptidos, se preparación y su utilización.
5
La presente invención se refiere a nuevas secuencias peptídicas y nucleotídicas, y su utilización farmacéutica. Más
particularmente, la invención se refiere a péptidos capaces de unirse al dominio SH3 de la proteína GAP.
10
Los productos de los genes ras, denominados generalmente proteínas p21, desempeñan un papel clave en el control de la división celular en todos los organismos eucariotas en los que se han investigado. Algunas modificaciones
específicas de estas proteínas hacen que pierdan su control normal y las llevan a volverse oncogénicas. De este modo,
se han asociado un gran número de tumores humanos a la presencia de genes ras modificados. Asimismo, una sobreexpresión de estas proteínas p21 puede llevar a un desorden de la proliferación celular. Globalmente, las proteínas p21
están implicadas en el 30% de los cánceres humanos.
15
La comprensión del papel exacto de estas proteínas p21 constituye por lo tanto uno de los objetivos diana de la
investigación en el dominio de la oncología.
20
25
30
35
40
45
El modelo del que se dispone en la actualidad para explicar el funcionamiento de las proteínas p21 se basa en
analogías que comparten con las proteínas G de transducción. En las células existe un equilibrio entre las proteínas
p21 activas, unidas al GTP, y las formas inactivas, que han fijado GDP. En una célula quiescente, en la que las p21 no
están estimuladas, la mayoría de entre ellas están en forma GDP. Cuando se estimula la célula, el factor de intercambio
de nucleótidos, GEF, se vuelve más activo y facilita la evacuación del GDP y su reemplazo por GTP. La proteína adopta
entonces una conformación activa que le permite reconocer y estimular su efector, la proteína GAP “GTPase activating
protein”, probablemente asociada a otras proteínas. El complejo p21-GTP-GAP interacciona probablemente a su vez
con una u otras proteína(s) permitiendo así la transmisión de la señal que lleva una respuesta biológica de la célula.
La asociación del p21-GTP con la GAP desencadena de forma simultánea la hidrólisis del GTP y la vuelta de la p21
hacia la forma inactiva.
En el caso de las proteínas p21 oncogénicas, la mutación que llevan impide la vuelta al estado inactivo. El equilibrio, en este último caso, se desplaza hacia la forma activa de la p21.
Este equilibrio complejo entre las formas activa e inactiva de la p21 está controlado a la vez por factores inherentes a las propiedades bioquímicas de las proteínas p21 (afinidad relativa para el GDP y el GTP, velocidad
de intercambio de nucleótidos,...) y factores externos que modulan su actividad, tal como la proteína GAP principalmente.
La proteína GAP es una proteína citosólica presente en todos los organismos eucariotas que posee por lo tanto
la facultad de acelerar de forma importante la hidrólisis del GTP, unida a la proteína p21 normal (Trahey y Mc
Cormick 1987). Posee dos dominios que aseguran funciones distintas. Su extremo carboxi-terminal lleva la actividad
catalítica que fija las proteínas p21 y aumenta su actividad GTP-asa. En su otro extremo, posteriormente a la parte
amino-terminal, se encuentra una yuxtaposición de los dominios SH2 y SH3 que son susceptibles de participar en
interacciones con otras proteínas.
En la actualidad, se conocen dos proteínas que interaccionan con la proteína GAP. Se trata de las proteínas llamadas p62 y p190, de 62 kDa y 190 kDa respectivamente. Estas dos proteínas que son inmunoprecipitadas por
anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopes de la GAP, forman evidentemente un complejo específico con la
GAP. En particular, se sabe que la interacción de la proteína p62 con la proteína GAP se produce a nivel de la región SH2.
50
55
60
En lo que se refiere más particularmente al dominio SH3, su presencia en diferentes proteínas como las fosfolipasas
Cγ (PLC-γ), la subunidad p85 de la fosfatidilinositol-3-cinasa y la proteína grb-2, todas ellas implicadas a nivel de
la transducción de la señal p21-Ras, hace pensar que este dominio es muy importante particularmente para dirigir
las interacciones proteína-proteína y por lo tanto necesario para el funcionamiento de la proteína correspondiente y/o
su localización celular. En el caso particular de la proteína GAP, este dominio SH3 podría por lo tanto participar
igualmente en la transducción de la señal Ras. Es evidente que la comprensión del papel exacto de este dominio SH3
sería particularmente precioso en el plano terapéutico.
La presente invención tiene precisamente como objetivo contribuir a la elucidación de la contribución del dominio
SH3 a la transducción de la señal ras.
La solicitante también ha evidenciado la existencia de proteínas capaces de asociarse a la proteína GAP mediante
una unión directa a su dominio SH3.
65
Más precisamente, la presente invención resulta de la identificación, aislamiento y caracterización de proteínas
capaces de interaccionar con el dominio SH3 de la proteína GAP. Resulta igualmente de la caracterización estructural
de estas proteínas por identificación de las secuencias peptídicas correspondientes.
2
ES 2 248 800 T3
Más particularmente, el polipéptido de la invención, capaz de interaccionar con el dominio SH3 de la proteína
GAP, comprende todo o parte de una secuencia peptídica elegida entre las secuencias SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ
ID Nº3, SEQ ID Nº4, SEQ ID Nº5 y SEQ ID Nº9.
5
10
15
20
En el marco de la presente invención, el término derivado designa cualquier molécula obtenida por modificación
de la naturaleza genética y/o química del polipéptido según la invención y que conserva la actividad buscada. Por
modificación de naturaleza genética y/o química se debe entender cualquier mutación, sustitución, deleción, adición
y/o modificación de uno o varios restos. Dichos derivados se pueden generar con finalidades diferentes, tales como
principalmente el de aumentar la afinidad del péptido por su lugar de interacción, el de mejorar sus niveles de producción, el de aumentar su resistencia a proteasas, el de aumentar su eficacia terapéutica o reducir sus efectos secundarios
o el de conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas.
También se puede tratar de fragmentos de las secuencias mencionadas anteriormente de derivados de éstas. Dichos
fragmentos se pueden generar de diferentes formas. En particular, se pueden sintetizar por vía química, sobre la base
de la secuencia dada en la figura 1, utilizando los sintetizadores peptídicos conocidos por el profesional. También se
pueden sintetizar por vía genética, por expresión en un huésped celular de una secuencia nucleotídica que codifica para
el péptido buscado. En este caso, la secuencia nucleotídica se puede preparar químicamente utilizando un sintetizador
de oligonucleótidos, sobre la base de la secuencia peptídica dada en la presente solicitud y del código genético. La
secuencia nucleotídica se puede preparar igualmente a partir de la secuencia dada en la presente solicitud, por recortes
enzimáticos, ligadura, clonación, etc. según las técnicas conocidas por el profesional, o por selección en bancos de
ADN con sondas elaboradas a partir de la SEQ ID Nº1.
Según un modo particular de la invención, el polipéptido reivindicado comprende la SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2,
SEQ ID Nº3 y/o SEQ ID Nº4.
25
Preferentemente, el polipéptido según la invención posee un peso molecular del orden de 68 kDa.
Según un modo particular de la invención, se trata de un polipéptido de origen humano que comprende todo o parte
de la SEQ ID Nº5 o de la SEQ ID Nº9.
30
Se trata más particularmente de un polipéptido que comprende la SEQ ID Nº5.
Más preferentemente, se trata de un polipéptido representado en la SEQ ID Nº9.
35
40
De forma inesperada, esta proteína no posee homología con otra proteína p68, de la que ya se ha identificado que
se une al dominio SH3 de Src. No está fosforilada a nivel de sus restos tirosina en las células en crecimiento o en
estado de mitosis.
El análisis de la secuencia proteica ID Nº9 revela que la proteína asociada al dominio SR+H3 de la proteína GAP,
denominada G3BP, pertenece a la familia de las hnRNP (heterogenous nuclear RiboNucleoProteins). Más precisamente la G3BP es una proteína de 466 aa., que presenta un peso molecular aparente de 68 kDa y que contiene varios
dominios característicos de las proteínas que se unen a los ARN:
- dominios RNP2 y RNP1 (aa. 342 a 347)
45
- 4 RGG box (aa. 435 a 449)
- un dominio auxiliar ácido (aa. 144 a 221).
50
55
60
La invención se extiende también a los péptidos capaces de antagonizar la interacción entre la G3BP y el dominio SH3 de la GAP. La actividad de estos péptidos se puede poner en evidencia mediante ensayos de competición
(Cf. ejemplo 2-3) o de interferencia de las señales transducidas por las proteínas Ras.
Otro objetivo de la invención reside en los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos policlonales o monoclonales
dirigidos contra un polipéptido tal como se ha definido anteriormente. Dichos anticuerpos se pueden generar por
métodos conocidos por el profesional. En particular, estos anticuerpos se pueden preparar por inmunización de un
animal contra un polipéptido cuya secuencia se elige entre las SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3, SEQ ID
Nº4, SEQ ID Nº5 y la SEQ ID Nº9 o cualquier fragmento o derivado de éstas, extracción de sangre y aislamiento
de los anticuerpos. Estos anticuerpos se pueden generar igualmente por preparación de hibridomas según las técnicas
conocidas por el profesional.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden así utilizar para regular el estado de activación del producto de los genes ras.
65
Por otro lado, estos anticuerpos se pueden utilizar igualmente para detectar y/o dosificar un péptido según la
invención en muestras biológicas y, por lo tanto, para informarse sobre el estado de activación del producto de los
genes ras.
3
ES 2 248 800 T3
La invención se extiende también a los antagonistas, es decir cualquier péptido capaz de bloquear la interacción
de un polipéptido según la invención con el dominio SH3 de la proteína GAP. Dichos péptidos se pueden poner en
evidencia mediante ensayos de competición (Cf. ejemplo 2-3) o de inhibición de la actividad ras.
5
10
15
20
La presente invención permite por lo tanto generar polipéptidos derivados de las secuencias identificadas anteriormente así como anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos o las proteínas correspondientes, que presentan
propiedades biológicas interesantes con vistas a una utilización farmacéutica.
La invención proporciona igualmente compuestos no peptídicos o no exclusivamente peptídicos que se pueden
utilizar farmacéuticamente. En efecto, es posible a partir de los restos proteicos activos descritos en la presente solicitud, realizar moléculas inhibidoras de la vía de señalización dependiente de las proteínas P21 no exclusivamente
peptídicas y compatibles con una utilización farmacéutica. A este respecto, la invención se refiere a la utilización de un
polipéptido de la invención, tal como se ha descrito anteriormente, para la preparación de moléculas no peptídicas, o
no exclusivamente peptídicas, activas farmacológicamente, mediante la determinación de los elementos estructurales
de este polipéptido que son importantes para su actividad y la reproducción de estos elementos por estructuras no
peptídicas o no exclusivamente peptídicas. La invención tiene también como objetivo composiciones farmacéuticas
que comprenden una o varias moléculas preparadas de esta forma.
La presente invención tiene también como objetivo cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica para un
polipéptido capaz de unirse al dominio SH3 de la proteína GAP. Más preferentemente, se trata de una secuencia que
comprende:
(a) toda o parte de la SEQ ID Nº6, SEQ ID Nº10 o de una de sus hebras complementarias,
25
(b) las secuencias derivadas de las secuencias (a) con motivo de la degeneración del código genético.
Preferentemente, comprende la secuencia SEQ ID Nº6 y más preferentemente está representada por la SEQ ID
Nº10.
30
35
40
45
50
55
Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Se puede tratar de
secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas
secuencias pueden obtenerse por ejemplo por selección en bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas sobre la base de las secuencias presentadas anteriormente. Tales bancos se
pueden preparar a partir de células de diferentes orígenes por técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el
profesional. Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden preparar igualmente por síntesis química, principalmente según el método de las fosforamiditas, o también por métodos mixtos que incluyen la modificación química
o enzimática de las secuencias obtenidas por selección en bancos.
Estas secuencias nucleotídicas según la invención son utilizables en el dominio farmacéutico, bien para la producción de los polipéptidos de la invención, bien para la realización de secuencias antisentido utilizables en el marco de
una terapia génica o bien para la detección y el diagnóstico, mediante experimentos de hibridación, de la actividad
de la proteína GAP en muestras biológicas o para el aislamiento de secuencia homólogas a partir de otras fuentes
celulares.
Para la producción de los polipéptidos de la invención, las secuencias nucleicas definidas anteriormente se colocan
generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión en un huésped celular. La elección de estas señales
(promotores, terminadores, secuencia líder de secreción, etc.) puede variar en función del huésped celular utilizado.
Preferentemente, estas secuencias nucleotídicas de la invención son parte de un vector que puede ser de replicación
autónoma o integrador. Más particularmente, se pueden preparar vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de replicación autónoma en el huésped elegido. Cuando se trata de vectores integradores, éstos se pueden preparar
por ejemplo utilizando secuencias homólogas a ciertas regiones del genoma del huésped, permitiendo, por recombinación homóloga, la integración del vector.
Los huéspedes celulares utilizables para la producción de los polipéptidos de la invención son tanto eucariotas
como procariotas. Entre los huéspedes eucariotas que convienen se pueden citar las células animales, las levaduras
o los hongos. En particular, cuando se trata de levaduras, se pueden citar las levaduras del género Saccharomyces,
Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden citar las células
COS, CHO, C127, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente las especies Aspergillus o Trichoderma.
Como huéspedes procariotas se prefieren utilizar las bacterias siguientes: E.coli, Bacillus o Streptomyces.
60
65
Las secuencias de ácidos nucleicos según la invención pueden también servir para la realización de ácidos nucleicos antisentido que se pueden utilizar como agentes farmacéuticos. Se ha demostrado que la inhibición de la expresión
de algunos oncogenes por ácidos nucleicos antisentido es una estratega útil en la comprensión del papel de estos
oncogenes y una vía particularmente prometedora en la realización de un tratamiento anticanceroso. Los oligonucleótidos antisentido son oligonucleótidos pequeños, complementarios de la hebra codificadora de un gen dado y por esto
capaces de hibridar específicamente con el ARNm transcrito, inhibiendo su traducción en proteína. Tales oligonucleótidos pueden estar constituidos por toda o una parte de las secuencias nucleicas definidas anteriormente. Se trata
generalmente de secuencias o de fragmentos de secuencias complementarios de las secuencias codificadoras para los
4
ES 2 248 800 T3
péptidos según la invención. Tales oligonucleótidos se pueden obtener, a partir de las secuencias citadas anteriormente,
por fragmentación, etc. o por síntesis química.
5
10
La invención se refiere igualmente, como secuencias nucleotídicas, a las sondas nucleotídicas, sintéticas o no,
capaces de hibridarse con las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente que codifican para un polipéptido de la
invención, o con el ARNm correspondiente. Tales sondas se pueden utilizar in vitro como herramienta de diagnóstico.
Tales sondas deben marcarse previamente y para ello el profesional conoce diferentes técnicas. Las condiciones de
hibridación en las que se pueden utilizar estas sondas son las condiciones de exigencia normales. Estas sondas pueden
utilizarse igualmente para la puesta en evidencia y el aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos homólogos que
codifican para un polipéptido de la invención, a partir de fuentes celulares. Como ilustración de estas sondas, se pueden
mencionar más particularmente las sondas representadas por la SEQ ID Nº7 y la SEQ ID Nº8, que se utilizan en el
ejemplo 3 a continuación.
15
La invención tiene además como objetivo cualquier composición farmacéutica que comprende como principio
activo al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente.
20
También tiene como objetivo cualquier composición farmacéutica que comprende como principio activo al menos
un anticuerpo y/o un fragmento de anticuerpo tal como se ha definido anteriormente, así como cualquier composición
farmacéutica que comprende como principio activo al menos un oligonucleótido antisentido tal como se ha definido
anteriormente.
Además, tiene también como objetivo las composiciones farmacéuticas en las que los polipéptidos, anticuerpos y
oligonucleótidos antisentido definidos anteriormente están asociados entre ellos o con otros principios activos.
25
30
35
40
45
50
Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden utilizarse para modular la activación de las proteínas
p21 y de esta forma modular la proliferación de ciertos tipos celulares. Más particularmente, estas composiciones
farmacéuticas están destinadas al tratamiento de cánceres. En efecto, numerosos tipos de cánceres se han asociado a
la presencia de proteínas ras oncogénicas. Entre los cánceres que comprenden más a menudo genes ras mutados se
pueden citar principalmente los adenocarcinomas de páncreas, de los que el 90% presenta un oncogén Ki-ras mutado
en el codón duodécimo (Almoguera et al., Cell 53 (1988) 549), los adenocarcinomas de colon y los cánceres de tiroides
(50%), o los carcinomas de pulmón y las leucemias mieloides (30%, Bos, J. L. Cancer Res. 49 (1989) 4682).
La invención tiene también como objetivo la utilización de las moléculas descritas anteriormente para modular
e incluso inhibir la actividad de las proteínas p21. En particular, la invención tiene como objetivo la utilización de
toda o un fragmento de la G3BP para interferir con las señales transducidas por los productos de los genes Ras. Los
fragmentos proteicos homólogos de los hnRNP se utilizan ventajosamente para inhibir la unión de la G3BP con sus
ARN diana. Secuencias idénticas o complementarias a estos ARN diana se pueden también utilizar para interferir con
las señales transducidas por la proteína G3BP.
La invención proporciona también un procedimiento de detección de la expresión y/o de una sobre-expresión
de la proteína G3BP en una muestra biológica. Dicho procedimiento comprende por ejemplo la puesta en contacto
de dicha muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la invención, la revelación de los complejos
antígeno-anticuerpo y la comparación de los resultados obtenidos con una muestra patrón. En dicho procedimiento,
el anticuerpo puede estar en suspensión o previamente inmovilizado sobre un soporte. Este procedimiento también
puede comprender la puesta en contacto de la muestra con una sonda nucleotídica según la invención, la puesta en
evidencia de los híbridos obtenidos y la comparación con los obtenidos en el caso de una muestra patrón.
La presente invención se puede utilizar de diferentes modos en el dominio terapéutico: los polipéptidos, anticuerpos
y secuencias nucleotídicas de la invención, que son capaces de modular la actividad de los genes ras, permiten en efecto
intervenir en el proceso de desarrollo de cánceres. Debido a su gran expresión en las células de los músculos estriados
esqueléticos, estos péptidos intervienen además probablemente en las patologías unidas a un defecto de señalización,
como por ejemplo la diabetes. Otro aspecto de la invención consiste en utilizar secuencias nucleotídicas de ADN
o ARN capaces de interaccionar con los polipéptidos reivindicados. Estas secuencias se pueden preparar según el
método descrito en la solicitud internacional WO91/19813.
55
La invención también se puede utilizar en el dominio del diagnóstico y de la clasificación de cánceres.
Otras ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos y figuras que siguen, que deben
ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
60
Figuras
Figura 1: Efecto de una sobre-expresión de la G3BP en fibroblastos NIH 3T3 sobre la actividad CAT.
65
Figura 2: Efecto de una sobre-expresión de la G3BP en fibroblastos NIH 3T3 sobre la formación de focos inducidos
por los oncogenes Src y Ras.
5
ES 2 248 800 T3
Material y métodos
Técnicas generales de clonación
5
10
Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, electroforesis sobre geles de agarosa o de
acrilamida, purificación de fragmentos de ADN por electroelución, extracciones de proteínas con fenol o con fenolcloroformo, precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, transformación en Escherichia coli, etc.
son bien conocidos por el profesional y están ampliamente descritos en la bibliografía [Maniatis T. et al., “Molecular
Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et
al. (eds), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].
15
Las enzimas de restricción han sido proporcionadas por New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) o Amersham y se utilizan según las recomendaciones de los proveedores. El plásmido pGEX 2T es
de origen comercial.
20
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN mediante la técnica llamada PCR [Polymerase-catalyzed
Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155
(1987) 335-350] se efectúa utilizando un “DNA thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del
fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas se efectúa mediante el método desarrollado por Sanger et al. [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] utilizando el kit distribuido por Amersham.
25
Para los experimentos de hibridación, las condiciones de exigencia normales generalmente son las siguientes:
hibridación: 3 x SCC en presencia de 5 x Denhart’s a 65ºC; lavado: 0,5 x SSC a 65ºC.
Ejemplo 1
30
35
Preparación de las proteínas de fusión Glutatión-S-transferasa SH3
Las secuencias de ADN que codifican para los dominios SH3 de las proteínas GAP (restos 275 a 350) y c-Src
(restos 84 a 148) se amplifican mediante la técnica de P.C.R. y se clonan en un vector de expresión pGEX2T entre
los sitios de restricción Bam HI y ECORI. Las bacterias así transformadas se cultivan, se inducen con IPTG (1tio-β-D galactopiranósido) y se descomponen por ultrasonidos. Las proteínas de fusión GST SH3 se purifican por
cromatografía de afinidad sobre bolas de agarosa glutatión (Pharmacia LKB Biotech) y luego se eluyen con glutatión
reducido 10mM.
Ejemplo 2
40
1) Preparación de lisados celulares
45
50
55
Se cultivan células ER22 (fibroblastos de hámster que sobre-expresan el receptor EGF humano) o células NIH 3T3
que expresan pp60 C-Src (F-527) sobre medio DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle Medium) enriquecido con 10%
de suero de ternera fetal que contiene el antibiótico G418 (200 µg/ml) y 2 mM/l de glutamina (5GBICO-BRL) a 37ºC
en atmósfera con 5% de CO2 .
En cada ensayo, las células ER22 se cultivan en cajas de 100 mm hasta confluencia y luego en suero durante 18
horas. Se añade ortovanadato de sodio con una concentración final de 100 µM y la incubación se prosigue durante
30 minutos. A continuación se añade EGF directamente al medio hasta una concentración final de 80 nM durante 10
minutos y a 37ºC.
Para algunos ensayos, las células mitóticas se recuperan mediante tratamiento con 0,4 µg de nocodazol (SIGMA)
por ml durante 18 horas. Se lavan rápidamente con un tampón salino a base fosfato, se enfrían con hielo, y luego se
disuelven durante 30 minutos a 4ºC en 1 ml de tampón de lisis, HNTG (50 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl,
1% de Tritón x 100, 10% de glicerol, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de EGTA), en presencia de inhibidores de fosfatasas
(1 mM de Na3 VO4 , 10 mM de Na4 P2 O7 , 10 mM de NaF) y de inhibidores de proteasas (1 µg/ml de leupeptina,
1 µg/ml de inhibidor de tripsina, 1 µg/ml de pepstatina A, 2 µg/ml de aprotinina, 10 µg/ml de benzamidina, 1 mM de
fluoruro de fenilmetanosulfonilo, 1 µg/ml de antipaína y 1 µg/ml de quimostatina).
60
Los lisados se decantan por centrifugación a 15.000 vueltas/mn durante 10 minutos. A continuación se determina
la concentración en proteínas (Bio-rad micro-test).
2) Ensayo de enlaces directos
65
El conjunto de lisados celulares (200 µg) y proteínas inmunoprecipitadas se separan sobre gel de poliacrilamida al
7,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y luego se transfieren sobre una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF Millipore Corpo.). La unión no específica a nivel de los filtros se bloquea con 2% de leche desnatada en
6
ES 2 248 800 T3
5
PBS que contiene 0,05% de Tween 20, durante 2 horas, a temperatura ambiente. Se incuban los filtros con la proteína
GST y proteínas GST-SH3 en el tampón de bloqueo durante 12 horas a 4ºC. Después de lavado con PBS-0,05% Tween
20, se detectan las proteínas enlazadas por incubación sucesiva con un anticuerpo monoclonal anti-GST (0,25 µg/ml)
(Hybridolab Pasteur Inst.), un anticuerpo anti-ratón conjugado con una fosfatasa alcalina y sal 5-bromo-4-cloro-3indoilfosfato toluidinio de azul de nitro-tetrazolio (PROMEGA).
3) Ensayo de competición
10
Se sintetizan los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias (275-305), (299-326), (317-326), (320-350)
de la GAP SH3 o a la secuencia putativa de la dinamina (RRAPAVPPARPGS) que se unen al dominio SH3 en un
aparato Applied Biosystems 431 A, utilizando la química FMOC.
15
Se aísla la proteína p68 purificada por electroforesis sobre gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio y se
transfiere por electroforesis sobre membrana PVDF. Las membranas se incuban con cantidades crecientes de péptidos.
Se utiliza el péptido poli-L-prolina (SIGMA) a 500 µM en una reacción testigo. Después de 1 hora de incubación,
se añade proteína GST-GAP-SH3 (2µg/ml) en cada medio de reacción. Se ensayan los filtrados con un anticuerpo
monoclonal anti-GST tal como se ha descrito anteriormente.
4) Inmunoprecipitación e inmunotransferencia
20
25
30
Se decantan los lisados celulares solubles (3 mg) con 50 µl de proteína A sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech)
durante 2 horas a 4ºC. Los lisados celulares decantados se incuban con el anticuerpo monoclonal antifosfotirosina
(anticuerpo monoclonal 4G10 - Upstate Biotechnology Incorporated) durante 4 horas a 4ºC. Luego se añaden 50 µl de
proteína A-Sefarosa al complejo y la incubación se prosigue una noche entera a 4ºC. Los inmunoprecipitados se lavan
3 veces con un tampón HNTG y se disuelven con una muestra de tampón SDS (100 µl). Se separan a continuación los
complejos con SDS-PAGE y se transfieren por electroforesis sobre membranas PVDF.
Se incuban las membranas con el anticuerpo monoclonal fosfotirosina en TBS (10 mM de Tris, pH 7,4,150 mM de
NaCl, 3% de albúmina de suero bovino) y además se incuban con segundos anticuerpos conjugados con una fosfatasa
alcalina. Se añaden sustratos para la fosfatasa alcalina para un revelado apropiado del color.
5) Purificación y análisis de la secuencia
35
40
45
50
55
60
Se descomponen aproximadamente 5x109 células ER22 en 200 ml de tampón HNTG. El lisado se centrifuga a
15.000 g durante 15 minutos y se diluye 5 veces con un tampón HNG (50 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl,
10% de glicerol y 1 mM de EGTA, inhibidores de fosfatasa e inhibidores de proteasa). El lisado se incuba durante
una noche con 6 ml de S-Sefarosa de flujo rápido equilibrado con el mismo tampón. El complejo se transvasa sobre
una columna (2,5 x 1,3 cm - IBF). La columna se lava con 10 veces su volumen en tampón y las proteínas ligadas se
eluyen a continuación a una velocidad de elución de 60 ml·h−1 , con un gradiente lineal de 60 ml de 0 a 1M de NaCl
del mismo tampón. Las fracciones que poseen la actividad de enlace determinada en las condiciones del ejemplo 2.2
(0,15-0,37M de NaCl) se recogen, se diluyen 10 veces con un tampón HNG y se cargan sobre Heparina-Sefarosa CL6B (3ml) (Pharmacia LKB), equilibrada previamente con el mismo tampón a una velocidad de elución de 24 ml·h−1 .
Después de lavado con el de tampón HNG, la columna se eluye con un gradiente de 24 ml, de 0 a 1M de NaCl. Se
recogen las fracciones activas de la cromatografía S de flujo rápido, se diluyen 4 veces en un tampón MES (100 mM
de MES, pH 6,8, 1 mM de MgSO4 . 1 mM de EGTA) y se transfieren sobre una columna ATP de agarosa (3 ml) (Sigma
Nº A9264) equilibrada previamente con el tampón MES que contiene 50 mM de NaCl con un caudal de elución de
6 ml·h−1 . A continuación se lava la columna con 20 ml de tampón MES que contiene 50 mM de NaCl y se eluye a
30 ml·h−1 con un gradiente lineal de 50 mM a 2 M de NaCl en el tampón MES. Se eluye la proteína p68 entre 0,3 M y
0,4 M de NaCl. Las fracciones activas se recogen, se dializan con 20 mM de NH4 HCO3 , pH 8,3, y se concentran. Las
proteínas llevadas a sequedad, se vuelven a poner en suspensión en un tampón SDS, se separan por electroforesis sobre
gel de poliacrilamida. El gel se colorea con azul de coomassie y se recoge la banda de peso molecular de 68 kDA,
correspondiente a la actividad de unión SH3 . Se lava durante 1 hora con las siguientes disoluciones: agua, agua/etanol
(90/10), agua/CH3 CN (80/20), agua/CH3 CN (50/50).
A continuación se divide la banda de gel, que contiene la proteína p68 purificada, en pequeños fragmentos y se
seca en SPEED/VAC (SAVANT). Se añaden 400µl de una disolución que contiene 25 mM de Tris, pH 8,5, 1 mM
de EDTA, 0,05% de SDS y 5 µg de endoproteinasa Lys-c (Boehringer Mannheim) y el conjunto se incuba durante
una noche a 37ºC. El hidrolizado se inyecta en una columna de HPLC en fase inversa (Vydac C18: 2,1 x 250 mm).
La columna se eluye a 0,2ml/min con un gradiente lineal de 0 a 35% de B en 150 minutos. (A: H2O + TFA 0,07%
y B: CH3 CN + TFA 0,07%) y los picos de elución observados a tr 113,7, 117,7 y 133,7 minutos se recogen y se
secuencian directamente utilizando un microsecuenciador Applied Biosystems 477A. La secuencia de los péptidos
correspondientes así obtenidos se presenta en SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3 y SEQ ID Nº4. Estas secuencias
no presentan ninguna homología con las proteínas referenciadas en las bases de datos de proteínas [PIR 33. SwissProt 33 (intelligenetics)].
65
Para determinar si la proteína p68 está fosforilada a nivel de la tirosina en las células mitóticas o no síncronas,
las proteínas de los lisados resultantes de células ER22 cultivadas en 10% de suero de ternera fetal o de células
tratadas con nocodazol se inmunoprecipitan con anticuerpos anti-fofotirosina, se transfieren sobre membrana y bien
7
ES 2 248 800 T3
5
10
se inmunodetectan con anticuerpos anti-fosfotirosina o bien se incuban con GST-GAP-SH3 o GST-Src-SH3, en las
condiciones descritas en los ejemplos 2.2 y 2.4. Como testigo, se ensayan las proteínas de las células NIH 3T3,
transformadas con un alelo activado de c-Src (c-Src Y527F) en las mismas condiciones que las descritas para las
proteínas ER22. Los resultados obtenidos muestran que algunas proteínas son fosforiladas a nivel de la tirosina, más
particularmente en la región 60-70 kDa. En las células ER22 no se detecta ninguna unión a una proteína fosforilada
p68 con las sondas GST-GAP-SH3 o GST-Src-SH3. En las células NIH3T3 (c-Src Y527F), la sonda GST-Src-SH3
se une a una proteína de peso molecular de 68 kDa fosforilada en la tirosina mientras que la sonda GST-GAP-SH3 no
interacciona con ninguna proteína.
Con el fin de confirmar la implicación funcional de esta proteína en la vía de señalización ras, se han realizado
experimentos de competición en las condiciones descritas en el ejemplo 2.3. Los resultados obtenidos muestran que los
péptidos derivados de la GAP capaces de bloquear la ruptura de las vesículas germinales de huevos de xénope (GVBD)
inducida por ras, péptidos (299-326) y (317-326) de la GAPSH3, también son capaces de bloquear la interacción entre
la proteína G3BP y la GAP.
15
Estos resultados confirman claramente que la capacidad de bloquear la actividad de la proteína según la invención
o de interferir con su actividad constituye una nueva aproximación particularmente prometedora para el tratamiento
del cáncer.
20
Ejemplo 3
Aislamiento de la secuencia SEQ ID Nº6 humana a partir de un banco de ADNc de placenta humana
25
Se utilizan como sondas las SEQ ID Nº7 y Nº8, establecidas a partir de secuencias peptídicas SEQ ID Nº1 y SEQ
ID Nº3. El ADN del banco Clonetech HL1008B se ha preparado y utilizado en una reacción de PCR. Se han realizado
30 ciclos de amplificación en las siguientes condiciones: desnaturalización 1 minuto a 94ºC, emparejamiento 1 minuto
entre 35 y 40ºC y elongación 1 minuto a 72ºC. Esta reacción permite aislar un fragmento de ADN de 1,3 kb del que
una parte la secuencia está dada en SEQ ID Nº6. Un análisis por Northern Blot muestra que el ARN correspondiente
(3,3 kb) es ubicuo y se expresa muy fuertemente en el músculo esquelético adulto.
30
Ejemplo 4
Aislamiento de la secuencia SEQ ID Nº10 humana a partir de un banco de ADNc de placenta humana
35
40
45
50
Se utilizan los dos oligonucleótidos (SEQ ID Nº7) y (SEQ ID Nº8) como iniciador para la ampliación de un ADNc
en un banco de placenta humana. Se ha realizado la P.C.R. mediante un Amplitaq Perkin Elmer a una temperatura de
hibridación de 35ºC seguida por 1 minuto de extensión a 72ºC en presencia de 10% de formamida. Se ha amplificado
un fragmento de ADNc de 1164 pb. Después de una clonación directa en el vector pMOSblue (Amersham) que
comprende secuencias -20 e inversa, el fragmento se ha secuenciado mediante sondas fluorescentes. Este fragmento
PCR se ha utilizado a continuación como sonda para seleccionar 106 fagos de un banco λgt11 de ADNc de placenta
humana (Clontech). La sonda se ha sintetizado por el sistema Rediprime de Amersham y los filtros se han incubado
durante 16 horas en el tampón de hibridación (6X SSC, 5X Denhardt’s, 100 µg/ml de esperma de salmón, 0,25% de
SDS) que contiene la sonda a 45ºC. A continuación se han lavado durante 1 hora a temperatura ambiente y 20 minutos
a la temperatura de hibridación en 2X SSC, 0;05% de SDS. Se han identificado ocho clones positivos. Dos de entre
ellos se han purificado y los ADNc se han digerido mediante EcoRI para volver a obtener los insertos. Se han subclonado en M13mp18/EcoRI para ser secuenciados. La secuenciación se ha realizado sobre los fragmentos resultantes
de una deleción progresiva en la exonucleasa III del ADNc (Nested Deletion Kit, Pharmacia Biotech). Las diferencias
de tamaño de los fragmentos se han analizado por amplificación PCR entre los iniciadores -20 y reverso del vector
M13 y se han elegido diferentes poblaciones de tamaño para realizar la secuenciación. La recogida de las diferentes
secuencias obtenidas ha permitido la reconstrucción de la fase abierta entera de la P68.
Ejemplo 5
Sobre-expresión de la G3BP en fibroblastos NIH 3T3
55
60
65
Se transfectan fibroblastos NIH 3T3 con un gen transportador, el de la cloramfenicolacetil-transferasa, colocado
bajo control de elementos de respuesta a Ras derivados del potenciador del virus del polioma. Estos elementos son
estimulados de 15 a 30 veces cuando las células son transfectadas por un vector de expresión que lleva el ADNc
de los oncogenes Src y Ras. Estas estimulaciones se ven afectadas cuando la proteína G3BP se expresa después de
co-transfección de un vector de expresión que contiene un ADNc que corresponde a la fase abierta de la proteína.
De forma dependiente de la dosis, la G3BP inhibe la actividad CAT estimulada mediante Src y mediante la forma
oncogénica de Ras. Esta observación está representada en la figura 1.
De la misma forma, la expresión de la proteína G3BP se opone a la formación de los focos inducidos por los
oncogenes Src y Ras. La figura 2 rinde cuentas de esta observación.
Estos experimentos demuestran claramente la capacidad de la G3BP para oponerse a los efectos proliferativos
transducidos por las proteínas Ras normales u oncogénicas.
8
ES 2 248 800 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Polipéptido capaz de interaccionar con el dominio SH3 de la proteína GAP caracterizado porque comprende
une secuencia peptídica elegida entre las secuencias SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3, SEQ Nº4, SEQ ID Nº5
o la SEQ ID Nº9.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID
Nº3 y/o SEQ ID Nº4.
10
3. Polipéptido según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque posee un peso molecular del
orden de 68 kDa.
4. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque es de origen humano.
15
5. Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende la secuencia SEQ ID Nº5 o la SEQ ID
Nº9.
6. Polipéptido según la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque está representado por la SEQ ID Nº9.
20
25
7. Polipéptido según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque sus restos tirosina no se fosforilan en las células mitóticas o en crecimiento.
8. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo caracterizado porque está dirigido contra una secuencia elegida entre las
secuencias peptídicas presentadas en SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3, SEQ ID Nº4, SEQ ID Nº5 y SEQ ID
Nº9.
9. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 8, caracterizado porque posee la facultad de
inhibir la interacción entre la proteína GAP y un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 7.
30
10. Ácido nucleico caracterizado porque comprende:
(a) la secuencia SEQ ID Nº 6 o la SEQ ID Nº 10 o sus hebras complementarias, y
35
(b) las secuencias derivadas de las secuencias (a) con motivo de la degeneración del código genético.
11. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende la secuencia SEQ ID Nº6.
12. Ácido nucleico según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque está representado en la SEQ ID Nº 10.
40
13. Utilización de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 10 a 12 para el diagnóstico de anomalías
genéticas.
45
14. Composición farmacéutica que comprende como principio activo al menos un polipéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 7 y/o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 8 ó 9.
15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14 destinada a modular la activación de las proteínas p21.
16. Composición farmacéutica según la reivindicación 14 destinada al tratamiento de cánceres.
50
17. Utilización de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo según la reivindicación 8 para la detección de la
expresión y/o de una sobre-expresión de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 7.
55
18. Utilización de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento
destinado a interferir con las señales transducidas por los productos de los genes Ras.
60
65
9
ES 2 248 800 T3
10
ES 2 248 800 T3
11
ES 2 248 800 T3
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) CALLE: 20, avenue Raymond ARON
10
(C) CIUDAD: ANTONY
(E) PAÍS: FRANCIA
(F) CÓDIGO POSTAL: 92165
15
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDO CAPAZ DE UNIRSE AL DOMINIO DEL SH3 DE LA PROTEÍNA GAP.
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
20
(A) TIPO DE SOPORTE: Cinta
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
25
(D) PROGRAMA: Patentin Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 19 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
35
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORÍGEN: HÁMSTER
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
40
Val Met Glu Lys Pro Ser Pro Leu Leu Val Gly Arg Glu Phe Val Arg Gln
1
5
10
15
Tyr Ile
45
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 15 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
55
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORÍGEN: HÁMSTER
(ix) RASGO DISTINTIVO:
60
(D) OTRA INFORMACIÓN: El primer Xaa representa bien un resto alanina o treonina y el segundo
Xaa un aminoácido cualquiera.
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
65
Xaa Xaa Glu Gly Asp Asp Arg Asp Asn Arg Leu Leu Gly Pro
1
5
10
1
ES 2 248 800 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 17 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORÍGEN: HÁMSTER
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
15
20
Leu Pro Asn Phe Gly Phe Val Val Phe Asp Asp Ser Glu Pro Val
1
5
10
15
Gln Lys
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
25
(A) LONGITUD: 19 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
30
(vi) ORÍGEN: HÁMSTER
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
35
40
Ser Ala Thr Pro Ala Pro Ala Asp Val Ala Pro Ala Gln Glu Asp Leu
1
5
10
15
Arg Xaa Phe
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 68 aminoácidos
45
(B) TIPO: aminoácido
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
50
(vi) ORIGEN: HUMANO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
55
60
65
2
ES 2 248 800 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
(xi) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
5
(A) LONGITUD: 204 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NÚMERO DE CADENAS: doble
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NO
15
(iii) ANTISENTIDO: NO
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: Humano
20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
25
30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
(xi) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
35
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NÚMERO DE CADENAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
40
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iii) ANTISENTIDO: NO
45
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: Humano
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
50
GTIATGGAIA AICCITCCCC ICTICTIGTI GG
32
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
55
(xi) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
(A) LONGITUD: 26 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
60
(C) NÚMERO DE CADENAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
65
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iii) ANTISENTIDO: NO
3
ES 2 248 800 T3
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: Humano
5
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
GAATCATCGA AIACIACGAA ICCGAA
26
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 9:
10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 466 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
15
(C) NÚMERO DE CADENAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptidos
20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4
ES 2 248 800 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2129 pares de bases
45
(B) TIPO: nucleótido
(C) NÚMERO DE CADENAS: simple
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
50
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
55
60
65
5
ES 2 248 800 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
6