4 Sintesis proteinas plasmaticas
Anuncio
Bioquímica hepática (IV) La síntesis de las proteínas plasmáticas Prof. J.V. Castell El plasma de la sangre contiene proteí proteínas (ca (ca.. 6.5 g/100 ml Suero Plasma • Agua • Sales minerales • Proteí Proteínas Fibrinó Fibrinógeno/Fibrina neutrófilos Sangre Blancas (leucocitos) • Polimorfonucleares eosinófilos • Monocitos basófilos • Linfocitos Células Rojas (eritrocitos) Plaquetas 1 Los grupos funcionales ácidos y básicos presentes en las cadenas laterales de los aminoácidos, al disociarse en el agua, confieren a la proteína cargas positivas y negativas + + - + + - - - + - + - - + + R-COOH+H2O↔R R-COO- + H3O+ R-NH2+H2O↔R R-NH3+ + OHLa carga neta de una proteína depende de la suma de cargas de ambos signos Sometidas a un campo elé eléctrico, las proteí proteínas son capaces de moverse en funció función de su carga y tamañ tamaño La movilidad electroforética es proporcional al cociente: carga/masa Aplicación de la muestra + - 2 Proteinograma normal del suero Albú Albúmina α1 α2 β γ + - Fracción de albúminas prepre-Albú Albúmina • Banda de mayor movilidad. Vida media muy corta. Indicador del estado nutricional y patologías con balance negativo de nitrógeno Albú Albúmina sé sérica • Banda mayoritaria (53-66%) del total del proteinograma 3 Fracción α1 globulinas: aumentan en el curso de la respuesta inflamatoria α1 glicoproteí glicoproteína ácida α1 antitripsina α1 antiquimiotripsina α1 fetoproteí fetoproteína (marcador de hepatocarcinoma primario) Fracción α2 globulinas α2 macroglobulina Ceruloplasmina (transporte del Cu2+) Haptoglobina (transporte de hemoglobina) Proteí Proteína C reactiva Fracción β globulinas Fibronectina Transferrina (transporte del Fe3+) Transcobalamina Fracción γ globulinas La fracción de las gammaglobulinas supone entre 10.3 y 20.8% del total de proteínas del suero. Incluye inmunoglobulinas (IgM (IgM,, IgA, IgG, IgE) IgE) que son sintetizadas por cé células del sistema inmune 4 Las células que, como los hepatocitos, sintetizan proteínas destinadas a la exportación poseen un retículo endoplásmico muy desarrollado RE rugoso Los microsomas son restos del RE que pueden aislarse tras homogenizació homogenización celular y centrifugació centrifugación homogenización Centrifugación en una solución densa de sacarosa Microsomas “lisas” y “rugosos” RE liso Los microsomas “lisos” tienen una densidad menor y flotan Los microsomas “rugosos tienen una densidad mayor y sedimentan Tubo de centrífuga con un gradiente de sacarosa 5 Un experimento que, utilizando microsomas hepáticos, reveló la existencia de un mecanismo singular para la síntesis de proteínas destinadas a la exportación La incubación de citosol (que contiene la maquinaria enzimática) con aminoácidos (radioactivos) + microsomas + mRNA, resulta en la síntesis de proteína (radioactiva), una parte importante de la cual se encuentra dentro de los microsomas. Cuando se incuban citosol + aminoácidos (radioactivos) + mRNA, y transcurridos unos minutos se añaden microsomas, resulta en la síntesis de proteínas, que se encuentran exclusivamente fuera de los microsomas En el primero de los casos, la asociación de ribosomas (presentes en el citosol) a microsomas del RE, hace que la síntesis de proteínas se dirija hacia el interior de los microsomas • • • •• • ••• • • • • • • • • • •• • • •• • • • • • • Citosol + Aminoá Aminoácidos + microsomas Adición de mRNA: Síntesis de proteínas Proteína en el interior de los microsomas • • • •• • • •• • • • • • • Citosol + Aminoácidos + mRNA: Síntesis de proteínas Adición de microsomas Proteína fuera de los microsomas 6 5´ Cuando la sí síntesis de proteí proteínas tiene lugar en el citoplasma celular Codón de iniciación (AUG) mRNA las proteí proteínas quedan solubles en el citosol mRNA Codón de terminación 50S 30S 3´ NH3+ COO Subunidad 60S - Met-tRNAiMET mRNA Complejo de iniciación 80S Peptidasa Subunidad 40S NH3+ Riboforina Luz del retí retículo endoplá endoplásmico Partícula de reconocimiento de la señal (SRP) Cadena polipeptídica naciente SRP Receptor de la SRP Riboforina Membrana del retículo endoplásmico Met-tRNAiMet mRNA 3´ Citosol Translocación a través de la membrana m7 G T -P Factores de iniciación Péptido señal 3´ Síntesis de proteí proteínas destinadas fuera del citoplasma celular 7 La hipó hipótesis del péptido señ señal 5´ mRNA 3´ 5´ ribosoma NH2 Receptor en la membrana del RER 3´ Péptido señal que aparece en la cadena polipeptídica CITOSOL 3´ 5´ 5´ 5´ RER 3´ COOH LUMEN del RER NH2 NH2 Eliminación péptido señal NH2 Proteína completa sin el péptido señal 8 Síntesis de proteínas ancladas a la membrana Péptido señal Receptor de la SRP SRP Riboforina Riboforina 5´ mRNA 3´ Citosol Membrana del retículo endoplásmico + H3N Péptido señal escindido 5´ 3´ H3N + Secuencia lipofílica Secuencia que se ancla a la membrana y retiene a la proteína COO Ejemplo de la estructura de una proteína anclada a la membrana y con dominios funcionales a ambos lados 9 N- y O-Glucoproteínas N-glicosí glicosídico CH2O H O OH CH2OH O OH ASN CH3 NH CO CH3 O-glicosí glicosídico CH2OH O N-acetil glucosamina OH O OH La mayor parte de las proteínas plasmáticas son N-glucoproteínas, excepción de la albúmina que no está glucosilada CO CH2 NH CO OH OH NH OH CH2 SER (THR) NH CO CH3 Azúcares implicados en la estructura glicídica de las glucoproteínas Generalmente hexosas y hexosas modificadas en C-2 y C-6 N-acetil glucosamina, Manosa y Nacetil neuramínico son los azúcares más frecuentes en las glicoproteínas20 10 Formació Formación de enlaces glicosí glicosídicos en proteí proteínas a partir de azú azúcares esterificados con nucleó nucleótidos La estructura de las NN-glicoproteí glicoproteínas es compleja Man Man Man Man Man Man Glc Glc Glc Man Man Glc NAc Man = O Glc NAc NH C N H CH2 C H O =C COOH NH2 Asparagina Se anclan sobre el N de la asparagina 11 N-glicosidació glicosidación de proteinas: proteinas: transferencia completa de la estructura glicosídica m7GTP OH m7GTP OH Citosol Membrana del retículo endoplásmico Luz del retículo endoplásmico Precursor de catorce hexosas unido al lípido dolicol + NH3 + NH3 Estructura bá básica de las NN-glicoproteí glicoproteínas Regió Región central Regió Región terminal A) Complejas GlcNAc GlcNAc Man aa aa Gal NANA GlcNAc Gal NANA GlcNAc Gal NANA Man Man Man aa Asn GlcNAc Man B) Ricas en manosa Man Man Asn aa GlcNAc GlcNAc Man Man 12 Síntesis de la estructura glicídica de las N-glicoproteínas, a través del dolicol y unidos a lípido de membrana Dolicol ATP ADP 2x 8x 3x UDP GDP Man Dol-P Man Dol-P Dolicol P Dolicol P GlcNAc P Dolicol P P Dolicol P P (GlcNAc)2 (GlcNAc)2 (Man)9 Glc (GlcNAc)2 (Man)9 (Glc)3 Unión al N de Asparagina Síntesis y traslocación de la estructura glucídica de las N-glucoproteínas 13 Retí Retículo Endoplá Endoplásmico Golgi cis P 1 2 3 P P P 5 4 6 En su tránsito del RE al aparato de Golgi, las glicoproteínas van siendo modificadas gradualmente pasando de “ricas en manosa” a “complejas” 7 12 11 9 8 10 13 Golgi trans Golgi intermedio Las proteínas destinadas al plasma llegan al exterior por tráfico de vesículas 14 Citosol Síntesis proteica Procesos que tienen lugar en el tránsito del retículo endoplásmico al Golgi Iniciación de la glicosilación Glicosilación adicional Luz del retículo endoplásmico liso Eliminación de algunos residuos de hidratos de carbono Citosol cis Vesícula de transferencia Finaliza la glicosilación Procesamiento proteolítico trans Procesamiento proteolítico adicional Concentración Secreción por exocitosis citosol Espacio extracelular Luz del complejo de Golgi Vesículas de secreción Membrana plasmática Localización intracelular del aparato de Golgi 15 Membrana plasmática apical Unión estrecha Secreción regulada Gránulo de secreción Secreción constitutiva Membrana plasmática basolateral Golgi trans Lisosoma Golgi cis Trá Tráfico vesicular para proteí proteínas cuyo destino es fuera del citosol Elementos transitorios del ER Transporte citosó citosólico de vesiculas desde el Golgi Coated transport vesicle containing cargo uncoating budding PLASMA MEMBRANE docking LUMEN OF GOLGI APPARATUS fusion Delivered cargo clathrin acceptor docking marker cargo receptor fusion cargo molecule dockine-marker acceptor budding clathrin molecule docking uncoating Lipid bilayer empty coated transport vesicle 16 Formación de las vesículas de secreción Un experimento de pulso y caza para demostrar el tiempo de tránsito vesicular de las proteínas destinadas a la exportación Durante un tiempo corto se incuban las células en cultivo con aminoácidos radioactivos. Las proteínas que en ese momento se estén sintetizando, serán radioactivas Acto seguido se lavan las células y se incuban con aminoácidos no radioactivos. La síntesis de proteínas continuará, las nuevas proteínas sintetizadas no serán radioactivas. A tiempos variables, placas de cultivo con células son lavadas (caza), (caza) fijadas para precipitar las proteínas y cubiertas con una emulsión fotográfica, dejándose exponer durante varios días. Revelada la emulsión fotográfica, se examinan al microscopio. Se observan puntos negros microscópicos de Ag, resultantes de la emulsión fotográfica, allí donde hay radioactividad. 17 Tiempo de síntesis y migración a través del aparato de Golgi 3 minutos: Las marcas se sitúan sobre el RER 20 minutos : Las marcas aparecen sobre el aparato de Golgi 90 minutos : Las marcas se encuentran en las vesículas secretorias Si todas las células del organismo poseen la misma información genética, por qué tienen un fenotipo distinto...? Páncreas Hepatocito Neurona 9 Las células de los distintos tejidos están especializadas en llevar a cabo funciones muy diferentes. 9 En última instancia esas diferencias radican en las proteínas que se expresan en cada célula, que son distintas. 9 Ello es consecuencia de diferencias de expresión de los genes. 18 Ciertos genes se expresan en todas las células. Otros, por el contrario, solo lo hacen en células muy determinadas • Por qué la albúmina sérica solo se expresa en los hepatocitos...? • Por qué la insulina solo se produce en las células beta...? Páncreas Hepatocito Neurona • Por qué el receptor del GABA solo se encuentra en las neuronas...? El control de la expresión génica en eucariotas Promotor TATAAT Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón n Stop AAAAAAAAAAA • Factores de transcripció transcripción hnRNA • Receptores nucleares mRNA • Inhibidores AAAAAAAAAAA Proteí Proteína 19 Tres genes que se expresan en tejidos diferentes debido a la diferente expresió expresión factores de transcripció transcripción tisulares Gen 1: solo se expresa en hí hígado Promotor TATAAT Gen 2: solo se expresa en pá páncreas Promotor TATAAT Gen 3: se expresa en ambas cé células Promotor TATAAT 20
