Protocolo de la 1ª práctica

Análisis Genético, 3er curso (2012-13)
Prácticas de laboratorio
Nombre y apellidos del alumno:______________________________
Grupo:_________
Práctica 1: Amplificación por PCR y detección de la variación
1. Amplificación de una variación genética de inserción/deleción (indel)
Con el ADN extraído de las células procedentes de la boca, vamos a amplificar una región de nuestro
genoma que incluye un locus de inserción/deleción situado en el intrón 16 del gen de la enzima
convertidora de angiotensina, la angiotensina convertasa (ACE). Utilizaremos el ADN de cada uno de
los alumnos que comparten la mesa. DEBEN UTILIZARSE GUANTES A LO LARGO DE TODA LA
PRÁCTICA.
A. Preparar la mezcla de amplificación (por tubo):
Volumen (x nº alumnos en la mesa + 3)

Tampón de amplificación 5X …………………4 μl………………………………...............................

dNTPs (2mM de cada uno) ……………………2 μl...…………………………………………………..…….

Cebadores (10 pmol/ μl) ……………………..1 μl……………..………………………………………….

Agua miliQ estéril ………………...……………...9 μl ..………………………………………………………

ADN ……………………………………………………..4 μl

Taq polimerasa …………………………………….0,15 μl……………………………………………………….
Preparamos la mezcla de reacción (lógicamente sin añadir el ADN) para todas las muestras del
grupo como una solución madre que luego tenemos que alicuotear. Ahora preparamos alícuotas
de ____ uL y a cada uno de ellos añadiremos los 4 uL de ADN de cada alumno.
B. Condiciones de amplificación. Programar los siguientes pasos en el termociclador:

1er paso 98 °C 30’’

2º paso 98 °C 15’’

3er paso 64°C 15’’

4º paso 72 °C 15’’

5º paso repetir desde el paso 2 hasta el paso 4, 34 veces.

6º paso 72 °C 10’
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2. Preparación de geles de agarosa para separar los fragmentos amplificados por PCR.
Primero hay que preparar la cubeta que sirve de molde donde se va a polimerizar el gel de agarosa.
Para ello limpiamos bien el molde con agua del grifo y luego con agua destilada. Secamos bien con
papel de cocina absorbente. Sellamos los extremos del molde. Colocamos dos peines, uno en la
ranura más cercana a lo que será el extremo del gel y el otro a mitad del soporte y dejamos el molde
preparado sobre la mesa.
A continuación prepararemos el gel:
El volumen final será de 50 ml de gel a una concentración del 1,7% de agarosa (agarosa es un polvo
sólido) en tampón TBE 1X. Para ello, realizaremos una dilución partiendo de una solución de TBE 5X.
Teniendo en cuenta que una concentración de un 1% representa 1 gramo / 100 ml de solución.
Estime:
Cantidad de agarosa que hay que pesar:__________
Cantidad de TBE 5X necesario:___________
Una vez pesada la agarosa la vertemos en un matraz de 125 ml. A continuación añadimos el TBE 1X, y
dejamos reposar 2’, para que la agarosa se embeba bien del tampón. Colocamos el matraz en el
interior del microondas y calentamos la mezcla durante 2-3’ a máxima potencia. Cuando comience a
hervir, sacamos el matraz, agitamos suavemente en círculos y lo volvemos a introducir en el
microondas. Cuando vuelva a hervir, la agarosa estará totalmente disuelta. Retiramos la mezcla del
microondas y la dejamos enfriar durante unos minutos hasta que no nos queme. Añadimos 5 μl de
SYBR®Safe agitamos suavemente y a continuación vertemos sobre el molde con los peines ya
colocados y dejamos polimerizar (aproximadamente 20’).
3. Electroforesis horizontal
Una vez polimerizado, retiramos los peines con cuidado (si es necesario humedeciendo con un poco
de agua destilada) y colocamos el gel en la cubeta de electroforesis horizontal, con los pocillos
situados en la proximidad del polo negativo (color negro) y asegurándonos que queda totalmente
sumergido en el tampón:
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Carga de las muestras para su electroforesis.
Las muestras se depositan con mucho cuidado en los pocillos del gel. Para ello primero hay que
mezclar el producto de PCR con un tampón de carga. En una placa colocamos 2 μl del tampón de
carga a tantos pocillos como muestras vayamos a cargar, y posteriormente añadimos 8 μl del
producto de PCR. Con una pipeta P20 aspiramos todo el contenido del tubo. A continuación, nos
colocamos sobre el pocillo del gel y sin introducir la punta en el pocillo, sino simplemente
sumergiéndola en el tampón y dejándola encima del pocillo, presionamos lentamente pero de
manera continua, para introducir todo el contenido. Repetimos con todas las muestras. En el primer
pocillo vamos a cargar un marcador de peso molecular, cuyas bandas tienen una longitud conocida,
que ya está mezclado con el colorante, con lo cual cargaremos directamente 5 μl del marcador.
Tapamos la cubeta encajando los electrodos en su lugar correspondiente y conectamos los
cables a la fuente de voltaje. Aplicamos 120 Voltios constantes y dejamos que la electroforesis se
desarrolle hasta que el azul de bromofenol esté a unos 2 cm del final del gel.
Transcurrido este tiempo, paramos la fuente de voltaje, levantamos la tapa de la cubeta y
cogemos el gel de agarosa para visualizarlo en el transiluminador de luz ultravioleta. Si bien el SYBR®
Safe no es posee tanta capacidad mutagénica como otros compuestos utilizados normalmente
para la visualización del ADN (por ejemplo el bromuro de etidio), no debemos descuidar las
medidas de precaución.
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Anote a continuación los genotipos que ha encontrado en base al tamaño aproximado de los
fragmentos observados al compararlos con el marcador de peso molecular (inserción (I) = _____ pb;
deleción (D) = _____ pb) entre las muestras de su clase. Los utilizaremos para realizar cálculos de las
frecuencias alélicas del grupo de prácticas. Cuando hayan dado el equilibrio de Hardy-Weinberg en
las clases teóricas también deberán calcularlo para estos datos.
Muestra
Genotipo
¿Está la clase de prácticas en equilibrio de Hardy-Weinberg?
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4. Amplificación de secuencias de ADN repetidas en tandem (microsatélite) por PCR:
SUSTITUYE TUS GUANTES POR UN PAR NUEVO. Con el ADN extraído de las células procedentes de la
boca, vamos a amplificar también un microsatélite conocido del gen CD4, un pentanucleótido
(CCCCT) que se repite “n” veces. Utilizaremos nuevamente el ADN de cada uno de los alumnos que
comparten la mesa.
A. Preparar la mezcla de amplificación:
Volumen (x nº alumnos en la mesa + 3)

Tampón de amplificación 5X ...............

dNTPs (2mM de cada uno) ....................... 2 μl. ...........................................................

Cebadores (10 pmol/μl de cada uno)…….. 1 μl. ...........................................................

Agua .......................................................... 9 μl. .............................................................

Taq polimerasa .........................................

ADN ........................................................... 4 μl
4 μl. ...........................................................
0,15 μl. .........................................................
Preparamos la mezcla de reacción (lógicamente sin añadir el ADN) para todas las muestras del
grupo como una solución madre que luego tenemos que alicuotear. Ahora preparamos alícuotas
de ____ uL y a cada uno de ellos añadiremos los 4 uL de ADN de cada alumno.
B. Condiciones de amplificación. Programar los siguientes pasos en el termociclador:

1er paso 94 °C 2’

2º paso 94 °C 15’’

3er paso 62 °C 15’’

4º paso 72 °C 15’’

5º paso repetir desde el paso 2 hasta el paso 4, 34 veces.

6º paso 72 °C 5’
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