electroforesis del adn en geles de agarosa

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ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA
La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos
fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de
moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa,
acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo
eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el
grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro,
haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Posso
y Ghneim 2008).
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son
reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado
durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor
tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la
concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,
permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento
del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel
(Posso y Ghneim op cit.).
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción
con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración
mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes
fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido
nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin
embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser
manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes
alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados
específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
La técnica para la cuantificación de ADN consiste simplemente en la utilización de una
secuencia de concentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de
ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz
ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta,
incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse
sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de
imágenes (Posso y Ghneim op cit.).
La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño
del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total
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(proveniente de una extracción de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con
geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de
de 100pb a 500pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede
variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes
elevados más rápido corren las muestras.
La pureza de la agarosa y de la solución tampón (TAE o TBE) puede variar según la
finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solución de agarosa para fines de una simple
visualización de algún producto de PCR. No se debe reutilizar cuando con se va a cuantificar ADN
ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solución de agarosa se recomienda guardar el
gel en un envase con tapa, esto evita la evaporación y la entrada de polvo. En caso dado de que se
evapore algo de la solución se puede completar el volumen con solución tampón limpia.
PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA
PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN GEL AL 1% (250 mL)
1. Materiales
-Pipetas de 2-20uL y de 20-200uL
-Cámara de electroforesis horizontal
-Peines para las bandejas
-Bandeja para la preparación del gel
-Fuente de poder
-Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL
-Botella de vidrio con más de dos veces el volumen de la solución de agarosa a preparar.
-Guantes de látex
-Guantes para calor
2. Reactivos
-Syber safe o Bromuro de etidio
-Agarosa grado molecular
-TBE 10X
-Agua Destilada
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3. Preparación de soluciones
A) Preparación de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para diferentes
volúmenes
40
% Gel
2
1,5
0,8
Agarosa
(g)
0,80
0,60
0,32
Volumen del gel (mL)
120
TBE 10X
Agarosa TBE 10X (mL)
(mL)
(g)
2
2,4
6
2
1,8
6
2
0,96
6
250
Agarosa
(g)
5
3,75
2
TBE 10X
(mL)
12,5
12,5
12,5
B) Preparación de un litro de TBE 10X
Reactivo
Tris Base
Acido Bórico
EDTA 0.5M
Cantidades
108g
55g
40mL
Nota: Agregue todos los reactivos a 500mL de agua destilada mezcle bien y complete el volumen
con agua destilada.
4. Protocolo de preparación de un gel de agarosa al 1%
1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende del
modelo de cámara utilizado) y póngale los peines.
2. Pese 2,5 gr. de agarosa.
3. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y
caliente en el microondas o en el baño de María hasta su completa disolución.
4. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano,
agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución madre 10 mg. mL-1) o 25 uL de SYBR Green *1
(dilución final de la solución comercial es 1 en 10.000).
5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la
solución.
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6. Sirva la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por uno de los
extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área de corrida de las
muestras con una punta limpia.
7.
Deje polimerizar la agarosa
8. Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir
el gel.
9. Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje deseado y corra las
muestras.
Nota
1. El bromuro de etidio es un fuerte agente mutágeno y posiblemente también cancerígeno y
teratógeno. Debe ser manipulado con extrema precaución en el laboratorio. El uso de guantes,
lentes de protección y bata de laboratorio es obligatorio.
2. SYBR Green exhibe un efecto mutagénico mucho menor que el bromuro de etidio, sin embargo,
se recomienda el uso de protección personal durante su manipulación.
5. Bibliografía
Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores Microsatélites para la
Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.
Protocolos de laboratorio UEG 2009
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