López, María Gabriela. 2010 "Complementación de baculovirus que

Complementación de baculovirus que no forman
cuerpos de oclusión mediante líneas celulares
establemente transformadas con el gen poliedrina
López, María Gabriela
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
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Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
“Complementación de baculovirus que no
forman cuerpos de oclusión mediante líneas
celulares establemente transformadas con el
gen poliedrina”
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área: Ciencias Biológicas
Lic. María Gabriela López
Director: Dr. Oscar Taboga
Consejero de estudio: Dr. Esteban Hopp
Laboratorio de Virus Animales
Instituto de Biotecnología
CNIA, INTA-Castelar
Buenos Aires, 2010
Complementación de baculovirus que no forman cuerpos de oclusión mediante líneas celulares
establemente transformadas con el gen poliedrina
Resumen
Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos. AcMNPV presenta un ciclo
de vida bifásico, con dos fenotipos virales: los virus brotantes y los virus derivados de los cuerpos de
oclusión (ODV). Los ODV, responsables de la infección primaria, se embeben en una matriz de
poliedrina, proteína que no es esencial para la propagación de los virus en cultivos celulares. Este
trabajo de tesis tuvo como objetivo desarrollar una línea transformada de insecto empaquetadora de
baculovirus defectivos en poliedrina, bajo la hipótesis de que es posible complementar esta
deficiencia en trans desde el genoma celular. Para ello, en primer lugar, se evaluaron diferentes
secuencias regulatorias del promotor del gen poliedrina controlando el gen reportero CAT, en
ensayos de transfección transitoria. Luego de la infección con un baculovirus occ-, los mayores
niveles de actividad reportera se obtuvieron con una región regulatoria de 2.735 pb que incluye el
promotor mínimo de poliedrina y secuencias con funciones de enhancer de la transcripción en
baculovirus (hr1, AcSp). Esta región fue seleccionada para regular la transcripción de poliedrina en
las líneas establemente transformadas. La infección de una de estas líneas, Sf9POL, demostró que la
morfogénesis de poliedros ocurre de manera similar a la de la infección natural y los baculovirus
resultantes mostraron además una infectividad similar a los salvajes, en larvas de Rachiplusia nu. Las
larvas infectadas oralmente mostraron sólo una progenie viral de genotipo pol- y fenotipo occ-,
incapaz de propagar la infección por vías naturales. Colateralmente, se describe una mutación en la
posición 130 del gen poliedrina, responsable de alteraciones en tamaño, morfología y capacidad de
oclusión de poliedros. En conjunto, los resultados y conclusiones de este trabajo contribuyen al
conocimiento de los mecanismos de morfogénesis de los cuerpos de oclusión en el baculovirus
AcMNPV, con importantes implicancias en el diseño de baculovirus recombinantes para el control de
plagas y la producción de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros.
Palabras clave: baculovirus, poliedrina, líneas estables, complementación occ-, larvas de lepidóptero.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
“Complementation of baculovirus that do not
form occlusion bodies by stably transformed
insect cell lines with polyhedrin gene”
Thesis presented to obtain the PhD degree
Lic. María Gabriela López
Director: Dr. Oscar Taboga
Advisor: Dr. Esteban Hopp
Laboratorio de Virus Animales
Instituto de Biotecnología
CNIA, INTA-Castelar
Buenos Aires, 2010
Complementation of baculovirus that do not form occlusion bodies by stably transformed insect cell
lines with polyhedrin gene
Abstract
Baculovirus is a diverse family of virus infecting arthropoda. AcMNPV has a bifasic life cycle, with
two viral phenotypes: budded virus and occlusion-derived virus (ODV). ODVs are responsible of
primary infection and occlude into a polyhedrin matrix to form polyhedra. Polyhedrin is a nonessential protein for multiplication in cell cultures. The main goal of this work was to develop a
transformed insect cell line for packaging polyhedrin defective virus, hypothesizing that it is possible
to complement this deletion in trans from the cellular genome. In this way, different polh gene
regulatory sequences driving CAT were evaluated by reporter gene assays. After infection of
transiently transformed insect cells with pol- baculovirus, the highest CAT levels were obteined
when a 2,735 bp regulatory region containing the minimum polyhedrin promoter preceded by hr1
and AcSp sequences with known enhancer activities, was positioned upstream CAT gene. This
region was selected to regulate the transcription of polyhedrin in stably transformed cell lines. The
infection of one line named Sf9POL demonstrated that morphogenesis of polyhedra occurred in a
similar way to the natural infection and that rendered baculovirus also showed similar infectivity for
Rachiplusia nu larvae. Oral infection of larvae with polyhedra from infection of Sf9POL line,
generated a viral progeny genotypically pol- and phenotypically occ-, unable to propagate the
infection by natural means. Colaterally, a mutation in the polyhedrin gene mapped in the position
130 and responsible for alterations in size, shape and capacity for virion occlusion, is described.
Together, results and conclusions presented here contribute to the knowledge of the morphogenesis
of occlusion bodies in AcMNPV, with important implicances in the design of recombinant
baculovirus for plague control and production of heterologous proteins in lepidoptera larvae.
Keywords: baculovirus, polyhedrin, stable lines, occ-complementation, Lepidoptera larvae.
“Cuando el hombre, inducido a una viva observación, comienza a mantener una lucha con la naturaleza, siente ante todo
el impulso irrefrenable de someter a sí mismo los objetos. Sin embargo, muy pronto éstos se le imponen con tal fuerza que
siente cuán razonable sea reconocer su poder y respetar su acción. Apenas se convenza de ese influjo recíproco, caerá en la
cuenta de un doble infinito: por parte de los objetos, la multiplicidad del ser, del devenir y de las relaciones que se
entrecruzan de un modo viviente; por parte de él mismo, la posibilidad de un perfeccionamiento ilimitado en la medida en
que sea capaz de adaptar, tanto su sensibilidad como su juicio, a formas siempre nuevas de recepción y de reacción. Esto le
proporciona un goce elevado, y decidiría la fortuna de su vida si obstáculos internos y externos no se opusiesen al bello
transcurso de ella hasta su culminación”.
Johann Wolfgang Von Goethe, “Teoría de la naturaleza”
Mi reconocimiento a la Universidad de Buenos Aires por la completa formación que me
otorgó, al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) por abrirme las puertas de
su Institución y brindarme el espacio para continuar mis estudios de postgrado y al Consejo
Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por haber hecho posible la
realización de este trabajo.
Agradecimientos
En primer lugar quiero agradecer a mi director, Oscar Taboga, por confiar en mí desde un primer momento.
Por orientarme hacia la buena ciencia, por enseñarme tantas cosas no sólo de biotecnología sino de “la vida” y
de la manera más divertida. Oski, gracias por todo lo que desinteresadamente me diste, por la buena onda de
todos los días… realmente me siento muy orgullosa de ser parte de tu grupo de trabajo, gracias por ayudarme
a llegar hasta acá!!
A la directora del Instituto, Elisa Carrillo, por todo lo que me brindó siempre, desde su confianza hasta su
preocupación porque nunca me falte nada y que logre mis metas de la mejor manera. Sinceramente sentir tu
apoyo me hizo mucho más fuerte para recorrer este camino… Gracias por todo, Lela!
A mis compañeras de laboratorio. A Victoria, mi “coequiper”, gracias por tus consejos y tus siempre acertadas
sugerencias (sobre todo por el tiempo que invertiste en las últimas correcciones, tu ayuda fue invaluable!).
Gracias además, Vic, por tu preocupación constante por mis cosas, tu seguridad, empeño y ese espíritu crítico
del que aprendí mucho. A Pauli, por todo lo que vivimos juntas dentro de este lab, por tus consejos y tu fuerza!
A Marie, la más nuevita de este grupo, por su buenísima disposición para colaborar en lo que sea, por el
interés, dedicación y cariño que ponés en todo lo que hacés. Y a Andre, que me conoce desde el comienzo y
fuimos mutuas testigos de un hermoso crecimiento personal! A las cuatro, mil gracias por estar siempre
dispuestas a ayudarme en lo que necesitara, por aportar tanto a esta etapa de mi formación, por nuestras
charlas de virología y de lo demás (aprendí mucho de maternidad, ahora sólo me falta experimentarla!), por
todo lo que compartimos día a día… Es un placer realmente trabajar con uds. También quiero agradecer a
Paola Chabay, una invitada de lujo! Por los días de trabajo compartidos, nuestras charlas de viajes y de cosas
de mujeres, tus buenos consejos, tus riquísimos mates! Me encantó haberte conocido, Pao! Gracias a las 5, las
quiero mucho, chicas!
A todo el grupo Virus Animales: a mis antiguas compañeritas del lab, Silvi, Eva y Sole, extraño nuestro día a
día pero se que sigo contando con uds siempre, gracias!! A Analía, Gaby, Flavia, Guido, Paula, Flor, Rubén,
Bernardo, Sebastián y Juan, por el lindo grupo que formamos, por la buenísima energía que siempre siento de
parte de uds, porque la pasamos bien, porque así vale la pena todo! Me siento orgullosa, además, de estar
rodeada por profesionales de tal calidad académica y humana. Gracias por su apoyo, sepan que es recíproco!!
A todo el Instituto de Biotecnología del INTA, porque me hacen sentir en casa! Por las buenas intensiones, los
buenos deseos, la buena onda que percibo de uds. Porque además de trabajar mucho, nos divertimos! Me
alegro de haberlos conocido. Gracias a todos!!
A las secres que son divinas y están siempre dispuestas a ayudarnos: Perla, Sandra y Cintia, gracias!
A la gente que nos ayuda día a día con el material: Isa, Vilma, Majo, Roxana, Fabián, Jorge y Haydee. Sin su
ayuda todo sería más difícil, gracias por todo lo que hicieron y hacen por nosotros!
A la gente del IMyZA. A María y Débora de Cría de Insectos por el mantenimiento de las larvas, fue
importante contar con ellas! A Alicia Sciocco por compartir sus conocimientos conmigo y por su gestión en
temas entomológicos. A Ricardo Salvador, otro tesista baculovirólogo, por tu buena onda! Y en especial
agradezco a Marcelo Berretta, por invertir parte de su tiempo en explicarme la regulación génica de
baculovirus, por su excelente predisposición y el aporte desinteresado a la discusión de estos temas y por
generar en mí el beneficio de la duda!
A las chicas del Laboratorio de Entomología del INTA Sáenz Peña, Chaco. A Marita Simonella, Mariela Fogar y
Elisa por enviarme larvas y por su recibimiento tan cálido cuando viajé para allá a buscarlas.
A Luis por mandarme en el día los papers que le pedía y a Ma. José Gravisaco por su colaboración con el
citómetro y por venir y aportar a los seminarios, gracias!!
A Blanca y Julián por su ayuda con las muestras y el microscopio electrónico.
A los chicos de la cátedra de Biotecnología de la facu de Farmacia y Bioquímica. A Victoria, Lucía, Gustavo y
Alexandra, compañeros del curso de baculovirus que nos ha traido tantas penas como alegrías… por la buena
onda con la que siempre me trataron. Gracias!
A Paola Talia del Instituto y a los doc Sergio Rodríguez Gil y Pablo Rebagliati de Exactas por la mano que me
dieron en la incursión de la técnica PRINS (que a pesar de no haberla empleado, la aprendí por ellos). Gracias
por el valioso tiempo que me dedicaron!!
A la gente de la cátedra de Farmacología de la Facultad de Odontología. En particular a los doc Carlos Mendez
y Lucila Busch por confiar en mí, por todo lo que me enseñaron de fármaco y de docencia. Realmente es un
placer trabajar con uds. Y a todos mis compañeros que son buenísimos conmigo: Betina, Silvia, Sabrina,
Gabriel, Florencia, Ale, Andrea, Dani, Fabi y especialmente a Alejandra Delgado y Gabriel Fiszman por las
clases compartidas y por su buenísima onda, me encantó haberlos conocido!
A mis amigos biólogos, Romi Petrigh, Caro Poncini, Caro Pontillo, Marce Cucher, Diego Urteaga y Diego
Kormes porque siempre están presentes como colegas y amigos, adoro nuestras charlas de biología y de la
vida, es esencial saber que cuento con uds en los momentos más importantes de mi vida, los quiero mucho
amigos!!
A Irene y Diego, por sus buenísimos viajes al INTA (me encantó ver crecer a Cata y conocer a Mateo!), porque
son excelentes personas y aprendí mucho de uds, gracias por su generosidad y cariño, amigos!! También
agradezco a Goyo, que nos conocemos desde la facu. Gracias por tus viajes y tu buena onda!
A mis amigos de la vida: Male, Mechi, Luján, Pia, Mei, María José y Martín, Conrado,Vero, Majo, gracias por
estar siempre! Comparto esto con uds!
A toda mi familia. Principalmente a mi mamá y a mi papá porque entre tantas cosas, de ellos aprendí que la
felicidad llega de hacer lo que a uno le apasiona y los logros, del esfuerzo diario. A mis hermanos Juan Pablo y
María Martha. A los 4 por todo el amor que me brindaron siempre, la comprensión y el apoyo incondicional
que me hacen sentir en todo momento, no alcanza un gracias! Les dedico lo que soy. A mis tíos y primos
también les agradezco el interés y los buenos deseos que siempre me dedican, es tan importante saber que
están, los quiero mucho!! Y a los Scovenna y Gallardo de Suipacha, les agradezco el inmenso cariño que me
dieron siempre y por hacerme parte de su hermosa familia. Los adoro!!
Y a mi amor Alexis, por TODO. Por ser mi compañero, mi inspiración. Por todo lo que compartimos! Gracias
por tu paciencia, por tu contención, por tus consejos (aprendo tanto de vos!), por aguantarme… y por hacerme
feliz cada día de mi vida!! Nada sería lo mismo sin vos…
En fin, a toda la gente que de una u otra manera me acompañó desinteresada y amablemente en esta etapa de
mi historia, tanto en lo laboral como en lo personal… Muchas gracias a todos!!
Gaby
Abril, 2010
Parte de los resultados de este trabajo de tesis han sido publicados en el siguiente artículo:
López, M.G., Alfonso, V., Carrillo, E., Taboga, O. (2010) “Trans-complementation of
polyhedrin by a stably transformed Sf9 insect cell line allows occ- baculovirus occlusion and
larval per os infectivity”. Journal of Biotechnology 145:199-205.
ÍNDICE
Abreviaturas ............................................................................................................................ II
Introducción.............................................................................................................................. 3
1. Los baculovirus: generalidades............................................................................................................................. 3
2. La oclusión, última etapa de la infección viral.................................................................................................. 14
3. Aplicaciones de los baculovirus.......................................................................................................................... 22
Objetivos................................................................................................................................. 35
Materiales y Métodos ............................................................................................................ 36
1. Virus........................................................................................................................................................................ 36
2. Células .................................................................................................................................................................... 36
3. Cepas bacterianas.................................................................................................................................................. 36
4. Metodología del ADN recombinante ................................................................................................................. 37
5. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida .................................................................................... 39
6. Identificación de proteínas mediante Western blot............................................................................................ 40
7. Obtención de los baculovirus recombinantes ................................................................................................... 41
8. Amplificación de los baculovirus recombinantes............................................................................................. 45
9. Titulación viral ...................................................................................................................................................... 46
10. Construcción de los plásmidos utilizados en transfecciones transitorias ................................................... 46
11. Expresión transitoria por las distintas regiones regulatorias de poliedrina ............................................... 51
12. Obtención de los vectores para transfecciones estables ................................................................................. 54
13. Transfecciones ..................................................................................................................................................... 56
14. Metodologías utilizadas con la línea estable que expresa poliedrina .......................................................... 58
15. Bioensayos............................................................................................................................................................ 61
Resultados............................................................................................................................... 64
CAPÍTULO I ............................................................................................................................. 65
1. Construcción de los baculovirus recombinantes utilizados en este trabajo.................................................. 65
2. Determinación de los elementos regulatorios mínimos necesarios río arriba de poliedrina: estudio de la
expresión transitoria de un gen reportero ............................................................................................................. 70
3. Obtención de una línea celular Sf9 establemente transformada con el gen poliedrina............................... 78
4. Caracterización de los poliedros obtenidos de la línea Sf9POL infectada con baculovirus pol- ............... 87
5. Estudio de la infectividad de los poliedros resultantes de la línea Sf9POL infectada con baculovirus pol-92
CAPÍTULO II............................................................................................................................ 97
1. Antecedentes.......................................................................................................................................................... 97
2. Construcción de un baculovirus con poliedrina mutante en el aminoácido 44: .......................................... 99
3. Caracterización de los poliedros anormales.................................................................................................... 100
4. Infectividad de los poliedros mutantes............................................................................................................ 103
Discusión .............................................................................................................................. 106
Desarrollo de una línea celular empaquetadora de baculovirus pol-.............................................................. 106
Caracterización de una mutanción puntual en el gen poliedrina .................................................................... 113
Potenciales aplicaciones de la línea Sf9POL ........................................................................................................ 117
Conclusiones ........................................................................................................................ 120
Anexo..................................................................................................................................... 121
Bibliografía ........................................................................................................................... 124
Abreviaturas
°C: grados centígrados (Celsius)
aa: aminoácido/s
AcMNPV: Autographa californica multiple nucleopoliedrovirus
ADN: ácido desoxiribonucleico
ADNc: ADN copia
ARN: ácido ribonucleico
ARNm: ARN mensajero
BEVS: del inglés Baculovirus Expression Vector System, sistema de expresión por baculovirus
BmMNPV: Bombyx mori multiple nucleopoliedrovirus
BV: baculovirus brotado
CAT: cloranfenicol acetil transferasa
CIP: del inglés calf intestinal phosphatase, fosfatasa alcalina intestinal
CPV: cipovirus
cpm: cuentas por minuto
DL50: dosis letal media
dpi: días post infección
dpt: días post transfección
DTT: ditiotreitol, inhibidor de proteasas
EDTA: ácido etileno diamino tetracético, quelante de iones bivalentes
GFP: del inglés green fluorescent protein, proteína verde fluorescente
GV: granulovirus
h: horas
hpi: horas post infección
hrs: del inglés homologous regions, secuencias de repetición homólogas
ies: del inglés immediate early factors, factores de expresión inmediata temprana
kDa: kilodaltons
kpb: kilo pares de bases
lefs: del inglés, late expression factors, factores de expresión tardía
min: minutos
MNPV: múltiple nucleopoliedrovirus
moi: multiplicidad de infección
NC: nucleocápside
nm: nanómetros
NPV: nucleopoliedrovirus
OB: del inglés occlusion bodies, cuerpos de oclusión
occ-/+: oclusión negativo o positivo
ODV: del inglés, occlusion derived virus, baculovirus derivado de oclusión
ORF: del inglés open reading frame, marco abierto de lectura
pb: pares de bases
PCR: del inglés polimerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa
pif: del inglés per os infection factors, factores de infectividad por vía oral
PMSF: phenyl methyl sulfonyl fluoride, inhibidor de serin-proteasas
POL: poliedrina
pol+/-: poliedrina positivo o negativo
pol/polh: gen poliedrina
POV: del inglés pre-occluded virus, baculovirus preocluido
PPBP: del inglés polyhedrin promoter binding protein, proteína de unión al promotor de poliedrina
pu: del inglés polyhedrin upstream, secuencia río arriba de poliedrina
rpm: revoluciones por minuto
s: segundos
SAP: del inglés shrimp alcaline phosphatase, fosfatasa alcalina
Sf9 o Sf21: Líneas celulares derivadas de Spodoptera frugiperda
SFB: suero fetal bovino
SNPV: simple nucleopoliedrovirus
TBP: del inglés TATA binding protein
U/μl: Unidades por microlitro
UV: ultravioleta
vlf-1: del inglés, very late factor, factor de transcripción de genes muy tardíos
VLP: del inglés virus like particles, partículas semejantes a virus
wt: del inglés wild type, tipo salvaje
μm: micrómetros
μM: micromolar
Introducción
Introducción
Introducción
1. Los baculovirus: generalidades
1.1 Descripción y clasificación
Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos, aislados de más de 600
especies de insectos del orden Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Orthoptera, Coleoptera,
Neuroptera, Thysanera y Trichoptera (Adams y McClintock, 1991; Herniou et al., 2003; Martignoni e
Iwai, 1986; Murphy et al., 1995; Tinsley y Kelly, 1985). Los baculovirus que infectan lepidópteros
son los más ampliamente descriptos. Presentan un genoma circular de ADN de doble cadena,
contenido en una nucleocápside (NC) de forma de bastón. El nombre baculovirus hace
referencia a la morfología de las partículas virales cuyo tamaño oscila entre los 30-60 nm de
ancho por 250-360 nm de largo, dependiendo del tamaño del genoma.
La familia Baculoviridae comprende este grupo de virus y a su vez se divide en dos
subfamilias: Eubaculovirinae (baculovirus ocluidos) y Nudibaculovirinae (baculovirus no ocluidos).
La primera subfamilia es capaz de producir estructuras cristalinas llamadas “cuerpos de
oclusión” (OB, del inglés Occlusion Bodies) y a su vez se puede subclasificar en dos géneros:
virus de la granulosis (GV por Granulovirus) y virus de la poliedrosis nuclear (NPV por
Nucleopoliedrovirus), que se distinguen según la proteína mayoritaria que conforma los
cuerpos de oclusión. Los NPV presentan OB de un tamaño aproximado entre 0,15 y 3 μm cuya
proteína mayoritaria es la poliedrina y los del género GV se caracterizan por producir OB más
pequeños, de geometría ovoide de entre 0,13 y 0,5 μm que normalmente contienen un solo
virión y cuya proteína mayoritaria es la granulina. Recientemente se ha propuesto una nueva
división para estos virus específicos de lepidópteros: Alphabaculovirus (NPV) y Betabaculovirus
(GV). Esta reclasificación se asocia con el aumento de evidencia molecular a partir de la cual se
infiere que estos virus pertenecen a grupos filogenéticamente distintos.
Los NPV se subdividen según el número de nucleocápsides que contienen: MNPV (del
inglés Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) para aquellos que contienen múltiples nucleocápsides
empaquetadas dentro de una membrana común y SNPV (del inglés Single Nuclear Polyhedrosis
Virus) si contienen una sola.
3
Introducción
1.2 Estructura
La capacidad de los baculovirus de replicarse eficientemente dentro del hospedante y diseminar
la infección dentro de una población de insectos se debe principalmente a la existencia de dos
fenotipos de partículas infectivas dentro del ciclo de vida del virus: virus ocluidos (ODV del
inglés Oclusion-Derived Virus) y virus brotantes (BV, del inglés Budded Virus) (Figura I1). Los
ODV son embebidos por una matriz cuasicristalina de poliedrina y son responsables de la
transmisión horizontal de la enfermedad entre los individuos susceptibles de una población así
como de iniciar la infección primaria en las células epiteliales del mesenterón (Granados y
Williams, 1986). Los BV son los responsables de la transmisión de la infección de una célula a la
otra y de un tejido a otro dentro del insecto.
Viriones
brotantes (BV)
Componentes
comunes de los
viriones
Viriones derivados de
cuerpos de oclusión (ODV)
Estructura apical
Cuerpo de
oclusión (OB)
ADN viral (circular
superenrollado)
Glicoproteina de
fusión de la
envoltura, gp64
cápside
Estructura
basal
Proteína básica de
unión al ADN (p6.9)
Proteínas principales
de la cápside (vp39,
p80, p24)
Proteína Terminal de la
cápside (ORF 1629)
Matriz de poliedrina
Figura I1. Comparación entre las estructuras de los dos fenotipos virales de MNPV.
A la izquierda se presenta la estructura de los viriones brotantes (BV) con su característica envoltura,
en cuya parte apical se encuentra la glicoproteína mayoritaria, GP64. La parte central del esquema
correlaciona los componentes estructurales de las nucleocápsides con los viriones derivados de
cuerpos de oclusión (ODV). Dentro de la envoltura, de distinto origen que la envoltura de los BV y por
lo tanto, de distinta composición proteica y lipídica, los ODV pueden coexistir de a grupos. Estos
“paquetes” de virus son los que, embebidos en una matriz de poliedrina, conforman el cuerpo de
oclusión (OB).
4
Introducción
Los miembros de la familia Baculoviridae se caracterizan por poseer un genoma circular cerrado
de doble cadena de ADN con tamaños que varían entre los 80 y 180 kpb, empaquetado dentro
de una cápside proteica (Theilmann et al., 2005). El ADN genómico se encuentra condensado
unas 100 veces por unión a la proteína del core p6.9 que neutraliza sus residuos ácidos y permite
su compactación.
La nucleocápside de los nucleopoliedrovirus presenta una típica forma de bastón asimétrica
con una base en un extremo y un ápice en el otro (Federici, 1986; Fraser, 1986) y está compuesta
mayoritariamente de la proteína VP39 (Figura I1). Asociada a la cápside también se encuentra
una proteína con actividad de quinasa que cataliza la fosforilación de la proteína básica p6.9
produciendo el desempaquetamiento del ADN y su liberación en el núcleo de la célula
hospedante para iniciar la replicación (Oppenheimer y Volkman, 1995).
En un momento dado de la replicación, las NC adquieren una envoltura lipoproteica cuyo
origen y composición de proteínas, lípidos y ácidos grasos difiere entre los fenotipos
baculovirales (BV u ODV) (Braunagel et al., 2003) y les confiere selectividad de infección. Los BV
adquieren la envoltura por brotación de la membrana plasmática de la célula infectada y
presentan en la misma dos proteínas mayoritarias: la glicoproteína GP64 y la proteína de fusión
F (Monsma, 1996; Westenberg, 2002; Westenberg, 2004; Pearson, 2001; Lung, 2002), las cuales se
ubican en un extremo del virón que se denomina peplómero, que coincide con el ápice de la
nucleocápside. Estas proteínas poseen N-glicosilaciones que son adquiridas en el tránsito por el
retículo endoplasmático y están involucradas en la entrada del virus a una nueva célula a través
de un mecanismo de endocitosis mediada por receptor (Hefferon, 1999; Blissard, 1992) (Figura
I2). Los NPV se clasifican en grupo I si poseen GP64 y grupo II si carecen de un homólogo de
GP64, como se observa en los GV. En ese caso, la fusión de la membrana dependiente de bajo
pH durante la entrada de viral ocurre mediada por la proteína F. Mientras que la proteína GP64
es exclusiva del grupo I de NPV, existen homólogos de la proteína F de envoltura no sólo en los
virus de insectos, sino también en algunos virus de vertebrados (Westenberg et al., 2004).
En etapas más tardías de la infección, las nuevas NC permanecen en el núcleo celular y
adquieren una membrana lipoproteica, dando lugar a los ODV. El origen de la membrana que
recubre este fenotipo viral no ha sido aún bien dilucidado. Algunos autores sugieren que es
sintetizada de novo (Blissard, 1996b), mientras que otros sostienen que el origen de la envoltura
está asociado a la formación de microvesículas a partir de invaginaciones de la membrana
nuclear interna (Slack y Arif, 2007). Se conoce que en este fenotipo baculoviral existen cinco o
5
Introducción
más proteínas de envoltura, entre las que se destaca P74 y otras que son probables componentes
de las mismas como los factores de infectividad por vía oral o factores pif (del inglés, per os
infection factors).
Más tarde en el ciclo de infección, grupos discretos de viriones dentro de una membrana
común se embeben en una matriz constituida principalmente por la proteína poliedrina para dar
lugar a los cuerpos de oclusión (comúnmente denominados poliedros), liberados al ambiente
una vez que ocurre la lisis de la célula infectada. Los OB resultan una forma de resistencia del
virus, ya que constituyen una protección mecánica de los viriones a las agresiones ambientales,
que les permite sobrevivir fuera de una célula hospedadora por períodos largos hasta ser
ingeridos por un insecto susceptible.
1.3 Ciclo viral
Como se hizo mención anteriormente, los baculovirus presentan dos fenotipos distintivos
durante su ciclo viral, los virus brotantes (BV) y los virus derivados de los cuerpos de oclusión
(ODV) (Blissard y Rohrmann, 1990), por lo tanto poseen un ciclo replicativo “bifásico”.
El ciclo de la infección comienza en los insectos cuando en la naturaleza las larvas ingieren
los poliedros presentes en las hojas que constituyen su dieta (Figura I2). Los mismos alcanzan el
intestino medio de la larva que posee un pH superior a 9.5 y la matriz de poliedrina se disuelve
en este ambiente alcalino liberando los ODV. Hay trabajos que sugieren que la disolución de la
matriz de los OB en el intestino podría verse facilitada por una proteasa alcalina viral
denominada "enhancina" (Lepore et al., 1996) cuya acción aumenta la susceptibilidad de las
larvas a las infecciones por baculovirus y disminuye su tiempo de supervivencia (Derksen y
Granados, 1988).
Los ODV atraviesan la membrana peritrófica, una red de proteínas y quitina secretada por
las células intestinales con el fin de proteger el intestino del contacto directo con los alimentos,
para luego entrar en las células epiteliales por fusión de la envoltura del virión con la membrana
celular (Granados, 1978; Horton y Burand, 1993). Los ODV son capaces de infectar con mucha
mayor eficiencia las células epiteliales del intestino de la larva que las de cualquier otro tipo
celular del insecto. Una vez dentro de la célula, las NC son transportadas hacia el núcleo, el
ADN se desnuda y se da comienzo a la transcripción y replicación. Esta se denomina infección
primaria.
6
Introducción
A
Tomado de Kalmakoff y Ward, 2003.
B
Estroma
Estroma
Virogénico
virogénico
Membrana plasm
ática
Membrana
plasmática
Membrana
nuclear
Membrana
nuclear
Poro
Poronuclear
nuclear
Envoltura
Envoltura
Oclusión
ón
Oclusión
Desnuda
Desnuda
miento
miento
Los poliedros se
Fusión
con
Fusión
con
las
lascélulas
céluas
intestinales
intestinales
Infección
Infección
primaria
primaria
liberan
al ambiente
por
Los
poliedros
se liberan al
lisis celular
y muerte
ambiente
por lisis
celular y
muerte
del hospedador
del insecto
Endocitosis
Endocitosis
Infección
Infección
secundaria
secundaria
brotación
brotación
Ingesta
por
el el
Ingesta
por
hospedador
hospedador
Virus
VirusBrotante
Brotante
(BV)
(BV)
Tomado de Lars Keld Nielsen,
Universidad de Queensland, Australia.
Solubilizaci
ón de de
Solubilización
los poliedros en el
los
poliedros
en el
intestino
intestino
Virus
Derivados
de
Virus
Derivados de
Cuerpos
Oclusión
Cuerpos
dede
Oclusi
ón (ODV)
(ODV)
Figura I2. Ciclo infectivo de MNPV. A) Esquema que ilustra la infección primaria de los ODV en el
intestino de las larvas hospedadoras. B) Esquema que ilustra los principales eventos del ciclo de los
nucleopoliedrovirus en células de insecto tanto en la etapa de infección primaria, como en la etapa de
infección secundaria.
7
Introducción
Posteriormente se producen viriones de fenotipo brotante que salen de la célula para infectar
nuevas células e iniciar lo que se denomina infección secundaria. Estos BV entran a la célula
hospedadora mayoritariamente por endocitosis, probablemente mediada por interacción de
GP64 con un receptor aún no identificado (Volkman y Goldsmith, 1985; Wickham et al., 1990;
Wickham et al., 1992). En el citoplasma, el endosoma se acidifica provocando la liberación de las
nucleocápsides por fusión de membranas. Las NC migran entonces al núcleo donde ocurre la
transcripción y el ADN es replicado y ensamblado en nuevas NC. En una etapa más tardía de la
infección, las NC salen del núcleo y se dirigen a la membrana plasmática de la cual brotan al
igual que en la infección primaria. En una etapa muy tardía de la infección, las NC adquieren su
envoltura en el núcleo y se convierten en ODV. Los ODV se ocluyen en una matriz paracristalina
de poliedrina para formar los OB maduros, que son liberados por lisis celular quedando
disponibles para iniciar un nuevo ciclo de infección. En la figura I3 se ilustran las distintas
etapas que sufren las células del insecto luego de la de la infección por NPV.
Figura
I3.
Evolución
de
la
infección por NPV en células de
insecto. Las NC son inicialmente
traslocadas a la membrana celular
para la producción de BV y en una
etapa más tardía de la infección son
retenidas en la zona nuclear en anillo
(nuclear ring zone) para la producción
de ODV. MNI significa membrana
nuclear interna, la que provee de
envoltura a los ODV.
Modificado de Slack y Arif, 2007
1.4 Regulación de la transcripción
Los baculovirus han sido extensamente estudiados a nivel molecular, en particular el virus de la
poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV). El mismo ha sido tomado como modelo
8
Introducción
para el estudio de la transcripción, ya que su genoma de 134 kpb con sus aproximadamente 150
genes ha sido totalmente mapeado y secuenciado (Ayres, 1994).
La expresión de los genes baculovirales ocurre de manera secuencial. Sus genes son
expresados en forma de cascada en la que se distinguen tres fases principales: fase temprana
(early) que es anterior a la replicación del ADN viral, fase tardía (late) y fase muy tardía (very late)
(Lu y Miller, 1995) (Tabla I1). Cada fase requiere de la transcripción de genes de las fases
anteriores (Hasnain et al., 1997). A continuación se describen brevemente las tres fases a fin de
distinguir los procesos que transcurren en cada una.
Fase temprana
El ADN viral entra en el núcleo de la célula hospedadora y comienza la transcripción de los
genes reconocidos por la ARN polimerasa II de la célula hospedadora. La expresión de los genes
virales tempranos ocurre en un periodo que abarca desde las 0 a las 6 horas post infección (hpi).
Dos tipos de genes son transcriptos en forma temprana: los denominados genes inmediatamente
tempranos (ie, de inglés immediate early), que no requieren de la síntesis de novo de otros factores
virales para su transcripción (como ie-0, ie-1, ie-2, pe38) ni utilizan elementos enhancers de la
transcripción y los genes llamados tempranos retrasados (delayed-early), que están involucrados
en la replicación del virus y la manipulación de funciones celulares del hospedador y requieren
la síntesis de factores virales como el IE-1, que unidos a enhancers llevan la transcripción al nivel
requerido para el progreso de la infección (Guarino y Smith, 1992; Guarino y Dong, 1991; Pullen
y Friesen, 1995). Estudios llevados a cabo por Guarino y Summers (1986) demostraron la
inducción mediada por IE-1 en ensayos de expresión transitoria del gen 39K.
La proteína IE-1 sintetizada inicialmente forma dímeros en el citosol y es transportada al
núcleo, donde se une a palíndromes de 28 pb presentes en regiones específicas del genoma,
denominadas secuencias homólogas (hrs, del inglés homologous regions) (Olson et al., 2002). La
interacción del dímero de IE-1 con las hrs recluta factores de transcripción celulares, actuando así
como un enhancer transcripcional de genes tempranos en cis. Por lo tanto, IE-1 se ve involucrada
tanto en la replicación viral (es un componente necesario en el complejo de replicación del ADN)
(Kool et al., 1994a), como en la regulación de la transcripción de genes tempranos. Otros
productos de la fase temprana como IE-0, IE-2 y PE38/PE34 también regulan la transcripción por
transactivación.
9
Introducción
Fases
Temprana (early)
Tardía (late)
Muy tardía (very
late)
Tiempo
0 h a 6-8h
6-8 h a 18-24 h
18-24 h a 76 h
Transcripción mediada
por:
ARN polimerasa II celular
Promotores utilizados
TATA
(A/G/T)TAAG
(A/G/T)TAAG
Secuencia de inicio de
la transcripción
CA(C/G/T)T
Primera A de la
secuencia TAAG
Primera A de la
secuencia TAAG
Motivos de unión a
proteínas involucradas
en la transcripción
(T/A)GATA(A/G)CACGTG
ie-0, ie-1, eap-1, iap-2,
me53, dna-pol, dna-hel,
lef-10, lef-1 (primasa), lef2, lef-3, lef-4, lef-8, lef-9,
p47, vlf-1, p6.9, vp39,
gp64, 39K, p74, ubi,
pp78/83, etc.
p10, polh, vp39, vchi, ubi, p74, gp41,
odv-e66, odv-ec27,
odv-e56, etc.
ARN polimerasa viral
Replicación del ADN
Genes transcriptos
ie-0, ie-1, ie-2, pe38, me53,
dna-pol, dna-hel, etl
(pcna)p47, lef-1, lef-3, lef-5,
lef-6, lef-7, lef-8, iap-1, iap2, p35, gp64, egt, etc.
Producción de BV
Producción de OB
Tabla I1. Etapas en la infección con NPV. La expresión de genes baculovirales se divide en tres
etapas: temprana, tardía y muy tardía. La transcripción de genes tempranos depende de la ARN
polimerasa celular. La replicación del ADN es un prerrequisito para la expresión de genes tardíos y muy
tardíos, los cuales se transcriben utilizando la ARN polimerasa viral.
La mayoría de los promotores de genes tempranos poseen una caja TATA seguida de un motivo
CABT [CA(C/G/T)T] a 20-40 nt río abajo que corresponde al inicio de la transcripción. La
proteína TBP (del inglés TATA Binding Protein) se une a la secuencia TATA y se reclutan factores
transcripcionales; se cree que la secuencia CABT influye en la afinidad por el factor de
transcripción TFIID (Blissard, 1996).
En cuanto a los cambios sufridos por la célula como consecuencia de la infección, se puede
considerar la acción de los factores de síntesis temprana que al bloquear la continuidad del ciclo
10
Introducción
celular dejan las células infectadas detenidas en fase S y G2/M (Braunagel et al., 1998; Ikeda y
Kobayashi, 1999). La estructura del citoesqueleto se reacomoda drásticamente como
consecuencia de la expresión de otros genes tempranos. Los filamentos de actina y los
microtúbulos son redistribuidos ocasionando la hipertrofia del núcleo y el cambio de morfología
celular (Charlton y Volkman, 1991). Por otro lado, la inhibición de la apoptosis es requerida para
una eficiente replicación y expresión génica, para lo cual el virus cuenta con el producto del gen
p53 que es un inhibidor de caspasas.
Fase tardía
Replicación
La etapa tardía de la infección transcurre entre las horas 6 y 12 post infección hasta la hora 18
aproximadamente. Comienza con la replicación del ADN viral, que resulta esencial para la
transcripción de genes tardíos. Para este proceso, el virus cuenta con los productos de los genes
tempranos.
La evidencia actual sugiere que la replicación del genoma de AcMNPV requiere de
elementos que actúan en cis y en trans. La existencia de orígenes de replicación (oris) requeridos
en cis ha sido comprobada por análisis de genomas defectivos obtenidos luego de varios pasajes
virales en cultivo de células de insecto (Kool et al., 1994b; Lee y Krell, 1994). La actividad ori se
encontró asociada con las regiones homólogas (hrs) (Cochran y Faulkner, 1983). AcMNPV
contiene ocho hrs: hr1, hr1a, hr2, hr3, hr4a, hr4b, hr4c y hr5 (Figura I4). Estas regiones contienen
secuencias palindrómicas interespaciadas con repeticiones directas cortas y se encuentran
dispersas a lo largo del genoma de baculovirus cumpliendo el rol de enhancers transcripcionales
(Friesen, 1997). Además de los oris del tipo hr se han identificado otros orígenes de replicación
no-hr mediante ensayos de replicación transitoria en AcMNPV (Kool et al., 1994b). Estos ori no-hr
consisten en secuencias que carecen de las estructuras palindrómicas y repeticiones propias de
los hrs, aunque poseen estructuras básicas que se encuentran en el contexto de los orígenes de
replicación eucariotas, tales como múltiples repeticiones invertidas y directas, palíndromes y
estructuras ricas en AT. La estructura secundaria de éstos es quizás más importante que la
secuencia en sí misma para la función de origen de replicación.
En ensayos previos fue posible lograr la replicación de un plásmido de origen bacteriano sin
inserciones genómicas baculovirales en células de insecto al ser cotransfectado con ADN viral
(Guarino y Summers, 1988; Wu et al., 1999). Estos grupos demostraron que la replicación del
11
Introducción
plásmido era independiente de la existencia de elementos en cis, pero que se iniciaba por la
maquinaria de replicación viral como concatémeros o integrados al genoma viral. Estos datos
sugieren un mecanismo de replicación del ADN del tipo círculo rodante.
Aún se desconoce el rol individual de los ocho orígenes identificados en AcMNPV en la
replicación y si son activos simultáneamente.
Los elementos requeridos en trans para la replicación incluyen algunos lefs (del inglés late
expression factors), la ADN polimerasa viral (dnapol) y la helicasa p143. En AcMNPV se han
identificado cinco genes esenciales (p143, ie-1, lef-1, lef-2, lef-3) y cinco genes estimulantes de la
replicación (dnapol, p35, ie-2, lef-7 y pe38) (Crouch y Passarelli, 2002).
Figura I4. Localización de los genes
involucrados en la replicación y las
regiones homólogas (hrs) en el
genoma de AcMNPV. Los números
indican la cantidad de repeticiones en
cada hr. Las flechas grandes y pequeñas
indican la orientación relativa de los
genes y hrs, respectivamente.
Tomado de Kool et al., 1995
Transcripción
La expresión de genes tardíos, la producción de proteínas estructurales y la formación de BV
ocurre ente las 8 y 24 hpi.
Los factores esenciales para la transcripción de genes tardíos son diecinueve (Rapp et al.,
1998) e incluyen los llamados lefs, cuatro de los cuales (lef-4, lef-8, lef-9 y p47) codifican para una
ARN polimerasa resistente a α-amanitina (Grula et al., 1981; Guarino et al., 1998). Esta enzima es
esencial para la transcripción de genes tardíos y muy tardíos y reconoce secuencias promotoras
con el consenso (A/T/G)TAAG. La fuerza de la expresión a partir de los promotores tardíos
depende del contexto de esta secuencia TAAG. Generalmente, en estos casos la transcripción se
inicia en la primera A de la secuencia consenso.
12
Introducción
En el transcurso de la fase tardía de la infección se forma en el núcleo una zona denominada
estroma virogénico (Harrap, 1972) donde las nucleocápsides se ensamblan (Bassemir et al., 1983).
Fase muy tardía
La expresión de genes muy tardíos transcurre entre las 18 y 76 hpi aproximadamente y se
caracteriza por un marcado incremento en la transcripción de los genes denominados muy
tardíos: p6.9, pol y p10 (Lu y Miller, 1995). Estos genes son transcriptos por la ARN polimerasa
viral a partir de promotores muy tardíos. En estos promotores, a diferencia de los tardíos, el
nivel de expresión no depende del contexto inmediato en el que se encuentra la secuencia TAAG
sino de una secuencia denominada burst sequence, una región rica en A+T de la secuencia 5´ no
codificante de sus ARNm. Esta región se localiza entre el sitio de inicio de la transcripción y el
codón de inicio de la traducción. Se ha observado que mutaciones en la burst sequence reducen la
expresión durante la etapa muy tardía de la infección unas 10 a 20 veces y más, tanto los niveles
basales de ARNm de poliedrina como la tasa de inicio de la transcripción a partir de su
promotor (Ooi et al., 1989). En contraste, mutaciones en la secuencia río arriba del motivo TAAG
del promotor de poliedrina tienen efectos menos drásticos en la regulación del gen pol (Weyer y
Posse, 1989). Esta secuencia burst interactúa con proteínas celulares que resultan imprescindibles
para alcanzar los altos niveles de expresión de genes como pol y p10 en NPV, y otros genes que
codifican proteínas necesarias para la formación de los cuerpos de oclusión.
El gen vlf-1 (del inglés very late factor) de AcMNPV cumple un rol importante en la expresión
muy tardía a partir de los promotores pol y p10. La presencia de vlf-1 en ensayos de expresión
transitoria estimula la transcripción mediada por promotores muy tardíos, no así la mediada por
promotores tardíos (Todd et al., 1996). Se observó posteriormente que el factor VLF-1 se une
directamente a las regiones no codificantes de los promotores pol y p10, provocando de manera
directa su transactivación (Yang y Miller, 1999).
Los OB se acumulan en el núcleo formando una zona en anillo (ring zone) entre el estroma
virogénico y la membrana nuclear y eventualmente pueden llenar todo el núcleo. La lisis celular
ocurre entre las 60 y 72 hpi. Como consecuencia de la infección, las células dejan de sintetizar
proteínas y entran en apoptosis. La figura I5 es un esquema simplificado de las distintas etapas
que sufre el ADN baculoviral dentro de la célula en el transcurso de la infección, en el modelo
AcMNPV.
13
Introducción
ADN primasa (LEF-1/LEF-2)
ADN ligasa (hospedador?)
ADN polimerasa
ARN
polimerasa
celular
Cebador
de ARN
Fragmento de Okazaki
IE1 +
enhancers
Topoisomerasa (hospedador?)
ADN polmerasa
Genes tempranos
helicasa
Proteína de unión al ADNsc (LEF-3)
Modificado de Rohrmann, 2008
Genoma viral
Replicación del ADN
Lefs virales
RNA
polimerasa
viral + VLF-1
Viriones ocluidos
Genes muy
tardíos
RNA pol viral
Genes
tardíos
viriones
ARN
polimerasa
viral
Modificado de Rohrmann, 2008.
Proteína de
unión a hr1
Otros factores
celulares
Factores Promotor POL
celulares
tipo Sp
VLF-1
Regulación transcripcional de poliedrina
Modificado de Ramachandran et al., 2001
Figura I5. Esquema simplificado de la cascada de transcripción de los genes de AcMNPV.
Dentro de la ilustración del ciclo del ADN baculoviral se detalla el proceso de replicación a partir de la
enzima ADN polimerasa viral y factores de la célula hospedadora y la regulación transcripcional de
poliedrina como modelo de gen muy tardío.
2. La oclusión, última etapa de la infección viral
En una etapa muy tardía de la infección, la mayoría de las nucleocápsides que se ensamblan son
destinadas a permanecer en el núcleo para su posterior envoltura y oclusión. La producción de
cuerpos de oclusión depende del tipo celular. Para algunos virus, las células intestinales no
permiten la formación de poliedros. Sin embargo, para otros virus la oclusión ocurre en esas
células, exclusivamente. La razón de esto no se conoce aún.
En las infecciones por nucleopoliedrovirus, los viriones que permanecen en el núcleo
adquieren su membrana a partir de la membrana interna nuclear a la cual modifican ciertas
proteínas específicas del fenotipo ODV, codificadas por el genoma viral (Braunagel y Summers,
2007).
14
Introducción
La última etapa de la replicación viral tiene lugar luego de que la mayor parte del ADN ha
sido replicado y ocurre una hiperexpresión de los genes muy tardíos aumentando
dramáticamente los niveles de las proteínas poliedrina y P10. Poliedrina se acumula en el núcleo
y en un momento cristaliza en una estructura que envuelve los viriones. No queda claro si la
oclusión viral resulta un evento dependiente de la concentración, es al azar, o si los viriones
sirven para enuclear la formación de cuerpos de oclusión. Se demostró que al menos una
proteína (Ac68) está involucrada en este proceso porque cuando se eliminó su ortólogo de
BmMNPV (Bm56), los viriones producidos no se incorporaron dentro de los poliedros (Xu et al.,
2008).
La proteína P10 forma estructuras tubulares que penetran tanto en el núcleo como en el
citoplasma (Patmanidi et al., 2003; Carpentier et al., 2008). Cuando los cuerpos de oclusión
maduran, las fibrillas de P10 se alinean en la superficie de los poliedros y se cree que están
íntimamente asociados al ensamblado de la envoltura de los mismos, otorgándole una superficie
de aspecto más plano y parejo.
2.1 Evolución de los cuerpos de oclusión
Ya se mencionó el origen de los poliedros como forma de resistencia de los baculovirus. Estas
estructuras otorgan protección mecánica y físico-química a los viriones mientras éstos se
encuentran en un ambiente desfavorable fuera del insecto. De hecho, las poblaciones de insectos
no tienen una estructura constante en el tiempo sino que se expanden y colapsan durante los
períodos cálidos y húmedos y los períodos fríos y secos, respectivamente. Esto se relaciona con
la disponibilidad de fuentes de alimento, presencia de predadores y ciclos de temperaturas
óptimas para la reproducción. Además de los cambios estacionales, bajo ciertas circunstancias en
las que se produce una combinación óptima de condiciones, las poblaciones de insectos pueden
expandirse dramáticamente. Estos períodos de expansión pueden estar separados por largos
períodos, a veces muchos años. Una implicancia trascendente de esta naturaleza cíclica de las
poblaciones de insectos es que los patógenos se quedan sin sus hospedadores de manera
estacional o por períodos aún mayores. Para esto, distintos patógenos desarrollaron diferentes
estrategias de supervivencia, como permanecer en pupas, huevos o en hospedadores
alternativos. Aunque existe alguna evidencia de persistencia dentro de sus hospedadores,
algunos virus han desarrollado los cuerpos de oclusión como una estrategia de sobrevida fuera
15
Introducción
de su hospedador. Dentro de estas estructuras cristalinas proteicas, lo virus son protegidos de
las adversidades del ambiente, principalmente del calor y la desecación, por muy largos
períodos. Esta estrategia puede ser tan ventajosa que ha sido incorporada en los ciclos de vida
de tres diferentes tipos de virus de insectos: en los reovirus (cipovirus, virus de ARN de doble
hebra con genomas segmentados), en los poxvirus (entomopoxvirus, virus de ADN de doble
hebra con replicación citoplasmática) y en los baculovirus. Se sugiere, por lo tanto, que la
existencia de dos fases dentro del ciclo de vida de los baculovirus refiere a una coevolución con
su hospedador.
2.2 Componentes de los cuerpos de oclusión
Además de los viriones que contienen, los cuerpos de oclusión se componen de una matriz y
una estructura en su superficie. Otras proteínas también se asocian con los poliedros, detalladas
en la tabla I2.
ORF/Proteína
Ac8 Poliedrina
Ac131 Envoltura/Cálix
Enhancina
Ac137 p10
Proteasas alcalinas
Distribución en NPV
Efecto de la deleción
Todos
Todos excepto CuniNPV
Algunos
Todos
Contaminantes, no baculovirales
Viable
Viable
Viable
Viable
Tabla I2. Proteínas asociadas a los cuerpos de oclusión de baculovirus. Las proteínas se listan con su
número de marco abierto de lectura, su distribución y los efectos observados de su deleción.
POLIEDRINA
Es la proteína mayoritaria de los cuerpos de oclusión de los NPV. En AcMNPV posee 246 aa y
un peso molecular aproximado de 29 kDa. Es una de las proteínas más conservadas de los
baculovirus.
El
ensamblaje
de
poliedrina
resulta
en
la
formación
de
estructuras
supramoleculares cúbicas que empaquetan viriones en una etapa tardía de la infección. El gen
pol no es esencial cuando los baculovirus se replican en cultivo celular, pero son de importancia
16
Introducción
vital en infecciones naturales a campo. La cubierta de poliedrina asegura la persistencia del
material genético, protegiendo al virión de la desecación y de los rayos UV.
CÁLIX
El OB está rodeado por una cubierta externa llamada Cálix o envoltura del poliedro (PE, del
inglés polyhedron envelope) formada principalmente por carbohidratos asociados a una proteína
de 34 kDa producto del ORF 131. Esta proteína le confiere a la matriz de poliedrina cobertura y
rigidez, otorgando al poliedro una mayor estabilidad.
En el laboratorio, cuando los poliedros se someten a tratamiento alcalino, la estructura
cristalina se disuelve, pero la envoltura persiste como una bolsa en la cual los viriones quedan
atrapados.
La proteína PE se asocia con las estructuras fibrilares formadas por P10.
P10
La proteína P10 no es la proteína mayoritaria de los cuerpos de oclusión, pero se sabe que se
requiere para el correcto ensamblado de la envoltura del poliedro. Los poliedros de virus que no
poseen el gen PE poseen una apariencia similar a los poliedros de virus que no poseen el gen
p10: ambos presentan una superficie rugosa o interrumpida y la envoltura del poliedro parece
estar fragmentada o no existir (Williams et al., 1989).
ENHANCINAS
Las enhancinas son una clase de metaloproteinasas codificadas por ciertos NPV de lepidópteros,
como LdNPV, CfNPV, MacoNPV y algunos GVs como AgGV, AsGV, etc. En un estudio sobre el
virus LdMNPV se encontró asociación de las enhancinas con las envolturas de ODV. Se cree que
estas proteínas facilitan la infección al degradar la mucina de la membrana peritrófica
permitiendo así el acceso de los viriones a las células intestinales (Wang y Granados, 1997).
PROTEASAS
Se hallaron proteasas asociadas a los OB, pero que poseían propiedades similares a las del
intestino medio de las larvas. Por otro lado, los poliedros aislados de cultivos celulares carecían
de estas proteasas asociadas (McCarthy et al., 1979). A pesar de que muchos baculovirus
codifican para una proteasa de la familia de las catepsinas (Ac127), ésta es más activa bajo
17
Introducción
condiciones ácidas (pH 5) (Slack et al., 1995). Por lo tanto, las proteasas asociadas a OB
probablemente son una combinación de enzimas derivadas de bacterias, intestinos de insectos y
el virus.
2.3 Morfogénesis de poliedros en AcMNPV
Sobre la estructura de poliedrina y el ensamblaje en poliedros
Como ya se mencionó, dos familias de virus no emparentadas producen poliedros en su ciclo de
multiplicación. Los cipovirus (CPV), cuyos poliedros a menudo presentan miles de viriones
icosaédricos en su interior (Yu et al., 2008) y los baculovirus. Estos últimos producen poliedros
que contienen menos cantidad de partículas virales y que se envuelven en una capa de
proteoglicanos (cálix), ausente en los poliedros de cipovirus. A pesar de las diferencias en
tamaño y forma de los OB y de los diferentes tipos de virión que contienen, se ha observado que
la simetría de los cristales formados por ambos grupos es muy similar.
Las proteínas poliedrina de baculovirus contienen entre 243 y 249 aa y están conservadas en
alrededor de un 50 % entre α- y β-baculovirus, mientras que las proteínas poliedrina de
cipovirus contienen entre 247 y 252 aa y existe una identidad de alrededor de un 20 % entre
clados. No se han hallado altos grados de similitud entre las secuencias aminoacídicas de las
proteínas de los cuerpos de oclusión de estos dos grupos de virus. Sin embargo, cuando se
analizó la estructura de los poliedros de cipovirus y de AcMNPV por difracción de rayos X, éstos
presentaron parámetros tan similares que sugieren una evolución conjunta de ambas proteínas
(Anduleit et al., 2005).
El advenimiento de nuevas técnicas cristalográficas, como la cristalografía de proteínas por
microdifracción (Riekel et al., 2005), permitió la resolución de la estructura cristalográfica de los
poliedros del cipovirus del gusano de seda, dando los primeros detalles de la organización de
esos cristales. La estructura reveló un intrincado arreglo de trímeros de poliedrina entrelazados
con α-hélices N-terminales. Esta estructura explicaría la notable estabilidad de los poliedros
(Coulibaly et al., 2007). Posteriormente, se utilizaron métodos similares para determinar la
estructura cristalográfica de los poliedros producidos por AcMNPV (Coulibaly et al., 2009). A
pesar de que no se ha podido brindar evidencia concluyente sobre las relaciones evolutivas entre
los poliedros de CPV y NPV, la estructura de la poliedrina de AcMNPV explica varios aspectos
18
Introducción
funcionales, incluyendo el desensamblado dependiente del pH y la adaptación de los
baculovirus a sobrevivir dentro de un poliedro.
Las últimas investigaciones describen que las moléculas individuales de poliedrina se
pliegan en un dominio β-sandwich con una proyección de 52 aa hacia el extremo N-terminal y
una proyección más corta de 10 aa hacia el extremo C-terminal. El dominio interno fue descrito
como un dominio “jelly-roll” clásico. Los residuos N-terminales 10 a 52 forman una horquilla β
seguida de una larga hélice curva (H1/2) que se extiende hacia el exterior del cuerpo principal de
la molécula y perpendicular al sandwich central (Figura I6).
Tomado de Caulibaly et al., 2009.
Figura I6. Estructura de la poliedrina de NPV. A) y B) Estructura terciaria de la molécula de
poliedrina. La cadena polipeptídica está coloreada en un gradiente de azul a rojo desde su extremo Nterminal a extremo C-terminal. C) y D) Trímeros de poliedrina. Vistas ortogonales.
19
Introducción
En los poliedros, cuatro trímeros idénticos se asocian íntimamente en un grupo de geometría
tetraédrica. En la periferia este ensamblaje se mantiene por dos loops que se extienden del
sandwich central. El área de contacto es pequeña pero involucra uniones fuertes, como puentes
disulfuro (Cys131-Cys131). En el centro del grupo tetraédrico, las proyecciones de los extremos Nterminales fortalecen el ensamblaje en un dominio de intercambio en el que las hélices H1/2 de
los trímeros interacciona entre sí. La figura I7 muestra un esquema de ese ensamblaje que
conforma la unidad con la que se construyen los poliedros.
Tomado de Caulibaly et al., 2009.
Figura I7. Grupos tetraédricos que conforman los poliedros de NPV. A) Con diferentes colores se
representan los cuatro trímeros que conforman el grupo tetraédrico. B) Vista detallada del área de
contacto entre los trímeros de poliedrina, donde se destacan las uniones entre residuos (recuadrado). C)
Detalle de las interacciones entre los cuatro trímeros, mediadas por el dominio de intercambio de los
extremos N-terminales de tres trímeros (rojo, amarillo y verde) con los dominios centrales tipo “jellyroll” del cuarto trímero (azul).
Importancia de la secuencia aminoacídica de poliedrina en la morfogénesis de los poliedros
No existe en la bibliografía información suficiente y completa acerca de los eventos que
desencadenan la morfogénesis de poliedros en una etapa tardía de la infección con baculovirus.
Se conoce que la formación de poliedros depende de la interacción entre poliedrina y otras
20
Introducción
proteínas presentes en la envoltura del virión (Woo et al., 1998). Sin embargo, la morfología de
los poliedros depende no sólo de las interacciones entre poliedrina y otras proteínas virales o de
la célula hospedadora, sino de su propia secuencia aminoacídica (Carstens et al., 1992; Cheng et
al., 1998; Hu et al., 1998).
El grupo de Ji en el año 2010 explicó, a partir de esquemas basados en la estructura
cristalográfica de poliedrina, cómo ocurre el ensamblaje de las unidades que conforman los
poliedros de AcMNPV (Ji et al., 2010). Ellos postularon que los cambios puntuales en la secuencia
aminoacídica de poliedrina pueden dar origen a virus mutantes que generan poliedros de
morfología distinta de los baculovirus salvajes. Se propuso un dominio requerido para el
ensamblaje supramolecular de los poliedros para poliedrina de AcMNPV (Jarvis et al., 1991) que
corresponde a la región entre los aminoácidos 19 y 110. Se han estudiado mutaciones dentro de
esa región que provocaban cambios en la morfogénesis de poliedros así como también efectos en
la oclusión de los baculovirus.
Se han hallado y caracterizado mutantes de AcMNPV, la mayoría de las cuales contienen
mutaciones puntuales en el gen poliedrina que provoca un fenotipo de poliedros alterado
(Carstens et al., 1992; Lin et al., 2000; Ribeiro et al., 2008). La tabla I3 muestra la posición de
distintos cambios aminoacídicos en la proteína poliedrina, en mutantes tanto de baculovirus
AcMNPV como de BmMNPV (Ribeiro et al., 2008).
Las diferentes mutantes puntuales en el gen poliedrina dan por resultado dos fenotipos
definidos en la bibliografía como: occ- cuando se observa una masa proteica dispersa que no
ocluye baculovirus en lugar de la formación de poliedros u occ+ cuando se observa la formación
de grandes estructuras cristalinas de forma cúbica que ocluyen deficientemente. Hasta el año
2008 en el modelo de AcMNPV se han caracterizado 5 mutaciones puntuales en el gen
poliedrina. El fenotipo occ- fue la consecuencia de mutaciones en la región carboxi terminal.
Cambios aminoacídicos en la posición 85 (Carstens et al., 1987), 118 (Ribeiro et al., 2008) y 183
(Carstens et al., 1992) producen la acumulación de abundantes cantidades de partículas
conformadas por poliedrina en el interior del núcleo de la célula infectada y ausencia de
formación de estructuras poliédricas. Sin embargo, las dos mutaciones puntuales halladas hacia
el extremo amino terminal correspondientes a cambios aminoacídicos en las posiciones 25 (Lin et
al., 2000) y 59 (Carstens et al., 1986) mostraron un fenotipo mutante caracterizado por la
presencia de poliedros anormalmente grandes, conformados por poliedrina que se ha
ensamblado de manera anormal. El hallazgo de estas mutantes y su descripción permitieron
21
Introducción
inferir que la estructura molecular de poliedrina juega un rol esencial en la correcta
morfogénesis de poliedros y la oclusión de baculovirus infectivos.
Nombre del mutante/
virus parental
Posición
aminoacídica
(wt/mut)
Oclusión
AcMNPVTkmt513/AcNPV
25 (Gly/Asp)
Occ+
M5/AcNPV
59 (Pro/Leu)
Occ+
# 220/BmNPV
58 (Asp/Asn),
222 (Ile/Thr)
Occ+
M29/AcNPV
85 (Leu/Pro)
Occ-
Masa proteica dispersa
Carstens et al. (1987)
vSynlitx1B12P/AcNPV
118 (Val/Phe)
Occ-
Masa proteica dispersa
Ribeiro et al. (2008)
# 136/BmNPV
141 (Leu/Phe)
Occ-
Masa proteica dispersa
Katsuma et al. (1999)
# 211/BmNPV
144 (Glu/Leu)
Occ+
# 128/BmNPV
171 (Leu/Pro)
Occ+
# 126/BmNPV
178 (Cys/Tyr)
Occ-
Formas irregulares o
pequeños
Similar a wt con poca o nula
oclusión viral
Masa proteica dispersa
M934/AcNPV
183 (Leu/Phe)
Occ-
Masa proteica dispersa
Morfología de poliedros
Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral.
Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral.
Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral.
Referencia
Lin et al. (2000)
Carstens et al. (1986)
Katsuma et al. (1999)
Katsuma et al. (1999)
Katsuma et al. (1999)
Katsuma et al. (1999)
Carstens et al. (1992)
Tabla I3. Lista de los baculovirus mutantes en poliedrina descriptos hasta el momento. Las
mutaciones en la secuencia aminoacídica de poliedrina de AcMNPV y BmMNPV se listan detallando el
cambio de aminoácido y su sitio, así como también los cambios fenotípicos que generan.
3. Aplicaciones de los baculovirus
Tanto las propiedades físicas como la biología molecular de los baculovirus han permitido su
utilización en múltiples aplicaciones.
En los últimos veinte años, el sistema de expresión por baculvirus se convirtió en uno de los
sistemas más utilizados en la producción de proteínas recombinantes (Possee, 1997). Numerosas
innovaciones tecnológicas se llevaron a cabo para mejorar el sistema y hoy en día resulta el de
elección por su practicidad y rapidez, así como por su bioseguridad y posibilidad de un fácil
escalado de la proteína de interés (Kost et al., 2005). Sin embargo, las aplicaciones
biotecnológicas del sistema baculovirus-células de insecto van más allá de la producción de
proteínas heterólogas funcionales de distintos orígenes en células de insecto en cultivo. Se trata
22
Introducción
de un sistema muy versátil cuyas múltiples funciones están siendo a su vez optimizadas. Hoy en
día este sistema se utiliza con éxito en la generación de partículas semejantes a virus (VLP del
inglés virus like particles) para el estudio de los procesos de ensamblado viral en ausencia de
virus infectivo o para la producción de inmunógenos y proteínas diagnósticas, e incluso para
transferencia de genes (Maranga et al., 2002; Petry et al., 2003). Por otro lado se desarrollaron
estrategias para la inclusión de péptidos heterólogos y proteínas en la envoltura de los
baculovirus, mediante fusión a la glicoproteína de superficie GP64 (Boublik et al., 1995; OkerBlom et al., 2003; Peralta et al., 2007). Por lo general, el vector se diseña de tal manera de poseer
tanto la copia salvaje de gp64 como la fusionada a la proteína heteróloga. Estos baculovirus
resultan muy efectivos como inmunógenos.
Como ya se mencionó, los baculovirus no son capaces de infectar células de mamífero pero sí
logran transducirlas (Hofmann et al., 1995) y esta propiedad fue aprovechada en el desarrollo de
tecnologías como el delivery de genes mediado por baculovirus (Kost y Condrey, 2002). El uso de
baculovirus recombinantes que contienen cassettes de expresión en células de mamífero fue
primero ensayado en células hepáticas. El sistema se denominó BacMam® y se encuentra
actualmente en auge ya que la innovación permitió avances en los campos de la genómica,
desarrollo de nuevos fármacos y terapia génica.
En los últimos años se ha demostrado que los baculovirus poseen propiedades adyuvantes
en el sistema inmune de los mamíferos, mediadas por la activación de la respuesta innata (Abe
et al., 2005). Este descubrimiento contribuye al empleo de los baculovirus como una excelente
plataforma para el desarrollo de vacunas.
3.1 El uso de los baculovirus como sistema de expresión
3.1.1 El sistema baculovirus-célula de insecto
Probablemente la expresión de proteínas a partir de baculovirus recombinantes sea la aplicación
más conocida y más utilizada de los baculovirus. Las características de los genes muy tardíos
tales como sus altos niveles de expresión y su carácter no esencial han permitido el desarrollo de
vectores de expresión de proteínas en sistemas eucariotas. El sistema de expresión de proteínas
más utilizado en células de insecto infectadas con baculovirus está basado en el reemplazo del
gen poliedrina en el genoma de baculovirus por un gen heterólogo mediante recombinación
23
Introducción
homóloga. Este nuevo gen queda bajo el control del promotor de poliedrina y generalmente se
expresa a niveles comparables a la proteína de oclusión. Como consecuencia de esa
recombinación, el baculovirus recombinante adquiere un fenotipo oclusión negativo (occ-), ya
que por reemplazo alélico se elimina la secuencia codificante de poliedrina y de esta manera el
baculovirus recombinante queda imposibilitado de ocluirse en poliedros.
El sistema de expresión por baculovirus (BEVS, del inglés Baculovirus Expression Vector
System) resulta ser uno de los sistemas de expresión de proteínas recombinantes más versátiles y
poderosos (Luckow y Summers, 1988). Ha sido utilizado para la obtención de proteínas
recombinantes de una gran diversidad de orígenes como bacterias (Bigi et al., 1999), hongos
(Germain et al., 1992), plantas (Srinivas et al., 2001), virus (Maranga, 2003) e incluso proteínas
humanas (Rose et al, 1993).
El baculovirus más utilizado como vector de expresión es el aislado del lepidóptero
Autographa californica, AcMNPV. Otro baculovirus empleado como vector es el que naturalmente
infecta el “gusano de seda” Bombyx mori, BmMNPV. Como ya se mencionó, se aprovechan de
estos nucleopoliedrovirus los promotores de las proteínas no esenciales poliedrina y P10 para
regular la expresión del gen de interés.
Varias líneas establecidas de células de insecto son susceptibles a la infección por AcMNPV.
Entre ellas están las provenientes de Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Las líneas más
utilizadas son Sf9 y Sf21, ambas obtenidas a partir de tejidos de ovario de S. frugiperda.
Existen características particulares del sistema de expresión baculovirus-células de insecto
que lo distinguen de los sistemas de expresión bacterianos. A menudo, las proteínas expresadas
en sistemas bacterianos son insolubles, se agregan o se pliegan espacialmente de manera
incorrecta. En contraste, las proteínas expresadas en este sistema son solubles y funcionalmente
activas en la mayoría de los casos.
Las ventajas del BEVS como sistema de expresión de proteínas recombinantes son listadas a
continuación, haciendo una breve referencia a las propiedades que hacen de este sistema el de
elección cuando se trata de la expresión de altos niveles de proteínas eucariotas de interés.
•
Sistema de expresión eucariótico. La expresión de genes en un sistema eucariota resulta
esencial para la producción de proteínas con actividad biológica. El BEVS provee del entorno
eucariota necesario para un correcto plegamiento, formación de puentes disulfuro,
oligomerización y otras modificaciones postraduccionales requeridas por ciertas proteínas
24
Introducción
para mantener su actividad biológica, tales como N- y O-glicosilaciones, acilaciones,
amidaciones, fosforilaciones, prenilaciones y carboximetilaciones. La eficiencia de esos
procesos está sujeta a la etapa de la infección, ya que en las etapas muy tardías las funciones
de la célula hospedadora se encuentran reducidas.
•
Muy altos niveles de expresión. Esta es la característica que distingue al sistema BEVS,
por basarse en el uso de los promotores fuertes p10 y pol. En particular, el promotor de
poliedrina en condiciones salvajes alcanza niveles de expresión de hasta el 50 % de las
proteínas totales de la célula. No se han alcanzado hasta el momento tan excepcionales
niveles de expresión de proteínas heterólogas, pero sí se han obtenido en algunos casos hasta
el 25 % de las proteínas totales, lo que es considerado un alto nivel en comparación a otros
sistemas de expresión eucariota (O´Reilly et al., 1994).
•
Capacidad de incorporar grandes inserciones de ADN. La capacidad de expansión de la
nucleocápside permite el empaquetamiento y expresión de genes de hasta 100 kpb. Sin
embargo, las inserciones encuentran limitaciones en la capacidad del vector de transferencia.
•
Expresión de múltiples genes. Se lograron expresar con éxito dos y más genes
simultáneamente dentro de una misma célula infectada. Esta capacidad hace especialmente
interesante el uso de BEVS para la obtención, por ejemplo, de partículas semejantes a virus
por coexpresión de las subunidades de la cápside y ensamblado de las mismas dentro de las
células hospedadoras (Belkyaev y Roy, 1993).
•
Capacidad de splicing. A pesar de que en la mayoría de los trabajos que emplean BEVS
se utiliza ADNc, se ha visto que las células de insecto tienen la capacidad de realizar splicing
de intrones y exones de genes de mamífero, siendo una herramienta poderosa para los casos
que no es factible la obtención de ADNc (Iatrou et al., 1989).
•
Simplicidad de tecnología. Dado que los baculovirus no requieren de virus helper, son
más sencillos de utilizar que otros vectores virales. Con este sistema es posible producir
proteínas recombinantes fácilmente en tan sólo semanas. La construcción de un baculovirus
recombinante se considera más rápida y sencilla que la obtención de líneas eucariotas
estables que expresan de forma satisfactoria una proteína de interés.
25
Introducción
•
Bioseguridad. Los baculovirus tienen un rango acotado de hospedadores, siendo
susceptibles principalmente los insectos del orden Lepidoptera. AcMNPV es capaz de
ingresar en células de mamífero pero no replicarse en ellas, lo que confirma la seguridad de
este baculovirus para ser utilizados como vector viral, biopesticida e incluso como vector
para terapia génica somática (Carbonell y Miller, 1987).
Clásicamente, la obtención de baculovirus recombinantes se basa en la transfección simultánea
de células de insecto con ADN de baculovirus y ADN de plásmido de transferencia llevando el
gen de interés, la recombinación dentro de las células de insecto llevada a cabo por la
maquinaria celular y la selección de los baculovirus recombinantes.
Como se mencionó, la infección con baculovirus salvajes resulta en la producción de cuerpos
de oclusión constituidos mayoritariamente por poliedrina en las células de insecto susceptibles.
Este fenómeno fue utilizado en el pasado para identificar baculovirus recombinantes con el gen
de poliedrina reemplazado por el gen de interés: los virus recombinantes que expresan la
proteína heteróloga en lugar de poliedrina no producen cuerpos de oclusión y las placas de lisis
producidas por éstos pueden ser fácilmente distinguibles de las producidas por virus salvajes.
Sin embargo, ya que los baculovirus recombinantes derivan de eventos de recombinación
homóloga entre el plásmido y el genoma viral a una baja frecuencia (Kitts et al., 1990), la gran
mayoría de los virus producidos no son recombinantes. Además, debido a que las placas de lisis
tempranas de virus salvajes muestran a menudo un fenotipo oclusión negativo, existe el riesgo de
seleccionar falsos positivos.
En los últimos años se han introducido numerosas mejoras a fin de aumentar la cantidad de
eventos de recombinación, facilitar la selección de recombinantes y aumentar la proporción de
estos últimos en relación a los virus salvajes. En principio, pudo producirse mediante técnicas de
ingeniería genética una deleción letal en el genoma viral, de manera que sólo aquellos genomas
virales que recombinaran con el vector de transferencia que llevara la secuencia afectada junto
con el gen de interés pudieran replicar dentro de las células de insecto. Esto llevó a la obtención
de poblaciones recombinantes homogéneas tras la cotransfección, además de aumentar el
número de eventos de recombinación por el hecho de que el genoma viral estuviera en forma
lineal, con las secuencias a recombinar en los extremos, en vez de estar en su conformación
natural, superenrollada (Kitts y Posse, 1993). Desde entonces, este sistema ha sido utilizado de
26
Introducción
rutina para la generación de baculovirus recombinantes, bajo el nombre comercial de
BaculoGoldTM.
Una alternativa al empleo de ADN genómico viral linealizado es la utilización de un
bácmido que lleva el genoma modificado del baculovirus AcMNPV. Esta construcción tiene la
ventaja de que puede replicarse en bacterias E.coli gracias a la presencia de un replicón miniF
(Luckow et al., 1993). El sistema se conoce comercialmente como Bac-to-Bac® y se basa en la
transposición sitio específica entre un vector de transferencia y un bácmido receptor dentro de la
bacteria modificada (DH10Bac®). El bácmido recombinante aislado de las bacterias se transfecta
en células de insecto, las cuales generan la progenie viral que se amplifica para obtener el stock
de uso. Estos baculovirus son también de fenotipo occ-, incapaces de ocluirse en poliedros.
Más adelante se diseñó un sistema para obtener baculovirus de genotipo pol+, también
basado en un bácmido que porta el genoma de AcMNPV (Je et al., 2001). Este bácmido,
denominado bAcGOZA, lleva una deleción en el ORF 1629 cuya expresión, como se mencionó,
es esencial para su replicación en células de insecto. La cotransfección del bAcGOZA y el vector
de transferencia que contiene el ORF 1629 intacto y secuencias de la región río arriba de
poliedrina que flanquean el gen de interés, permite la recombinación homóloga en las células de
insecto, recuperándose sólo virus recombinante, ya que a partir del ADN parental no es posible
obtener progenie viable. Luego de la recombinación, además de recuperar el ORF 1629
completo, el baculovirus resultante contiene el gen de interés bajo el promotor de poliedrina y
además, el gen de poliedrina bajo el promotor de p10. Estos baculovirus son de fenotipo occ+ y
por lo tanto se ocluyen en poliedros en una etapa tardía de la infección.
Según lo expuesto anteriormente, existen varias metodologías para la obtención de
baculovirus recombinantes, tanto si se busca que los mismos se ocluyan en poliedros, como si no
se requiere su fenotipo occ+. Para la construcción de los baculovirus utilizados en esta tesis se
utilizaron las tres técnicas descritas.
3.1.2 El sistema baculovirus-larvas de lepidóptero
Una de las ventajas que ofrecen las células de insecto es su capacidad de crecer en biorreactores
de manera análoga a los microorganismos y asegurar de esa forma la obtención de cantidades de
proteína industrialmente aceptables. Sin embargo, la producción de proteínas recombinantes en
cultivos celulares en suspensión resulta muy costosa, ya que requiere de grandes volúmenes de
27
Introducción
medio de cultivo rico en nutrientes, suero fetal bovino como suplemento e insumos que
encarecen el proceso. Algunas proteínas pueden producirse de una manera más económica en
larvas de insecto. Además de la conveniencia en cuanto al costo final del proceso, la ventaja de la
expresión in vivo radica en la posibilidad de realizar modificaciones post-traduccionales que no
son factibles en los sistemas celulares, como fue demostrado por Andersons y colaboradores en
el año 1991. La mayor eficiencia en la expresión de proteínas que requieren modificaciones posttraduccionales puede deberse a la existencia en las larvas de los “cuerpos grasos”, tejido que
juega un rol muy importante en la síntesis y maduración de las proteínas del insecto. Además,
las larvas poseen otros tejidos con capacidad de realizar diferentes modificaciones a las
proteínas sintetizadas por el insecto. La principal diferencia respecto a la producción en células
radica en que las líneas que se utilizan para cultivos in vitro están compuestas por un único tipo
celular. Se conoce por ejemplo que las células Sf9 fallan en la α-amidación de proteínas
heterólogas, mientras que ciertas especies de lepidópteros pueden realizar dichas modificaciones
normalmente (Hellers et al., 1991).
Las limitaciones de este sistema suelen tener lugar al momento de la purificación de la
proteína recombinante, ya que la extracción a partir de larvas es compleja y la presencia de
proteasas puede dar lugar a pérdidas de la función biológica. La expresión de proteínas
recombinantes utilizando este sistema se encuentra en permanente desarrollo, tanto en la
sofisticación tecnológica como en el número de laboratorios académicos y comerciales que lo
adoptan.
Uso de larvas como como “biofábricas” de proteínas heterólogas: antecedentes
Existen numerosos ejemplos publicados del uso de larvas de lepidóptero para la producción de
proteínas mediante el sistema BEVS. La utilización de larvas de lepidóptero como “minibiorreactores” comenzó en los años ‘80 en países asiáticos como Japón, China e India, con el
gusano de seda Bombyx mori, para la producción de α-interferón (Maeda et al., 1985) e
interleuquina- 3 murina (Miyajima et al., 1987), entre otros productos, utilizando como vector el
baculovirus BmNPV. Este insecto como hospedador sigue siendo ampliamente utilizado tanto
para investigación, como es el caso de la IgG murina (Reis et al., 1992) e Il-18 porcina (Muneta et
al., 2003), como así también para la producción comercial de proteínas tales como el interferón τ
(Nagaya et al., 2004) por la firma japonesa Katakura.
28
Introducción
Otros lepidópteros hospedadores han sido también utilizados en investigación para la
producción de proteínas, como la oruga del tabaco Manduca sexta (Gretch et al., 1991), la polilla
de cecropia Hyalophora cecropia (Hellers y Steiner, 1992), el gusano soldado Spodoptera exigua
(Ahmad et al., 1993), el gusano Heliothis virescens (Kuroda et al., 1989), la oruga medidora
Rachiplusia nu (Loustau et al., 2008) y probablemente la más utilizada, la plaga de la soja
Trichoplusia ni que es considerada especie exótica en Argentina, por lo que se suele emplear R.
nu como especie más representativa de ésta.
A pesar de que AcMNPV afecta un amplio rango de hospedadores, no todos los lepidópteros
son susceptibles a su infección. Entre los insectos resistentes a AcMNPV se encuentran B. mori y
tanto M. sexta como H. cecropia, S. exigua presentan una susceptibilidad mucho menor que H.
virescens (Groener, 1989) o S. frugiperda. T. ni es un excelente hospedador para AcMNPV y ha
sido extensamente utilizado para la expresión de numerosas proteínas tales como la Il-2 humana
(Pham et al., 1999) y la adenosina deaminasa humana (Medin et al., 1990).
Existen empresas dedicadas a la producción de proteínas en larvas de T. ni a escala
comercial. Ejemplos de ellas son Entopath, Easton, PA (www.entopath.com) y Chesapeake
PERL, Savage, MD (www.c-perl.com) que diseñaron sistemas sencillos que automatizan la
expresión en larvas para la producción a pequeña y mediana escala en el laboratorio.
Como ya se ha destacado, el sistema de expresión in vivo presenta más ventajas que las
células en cultivo, las que incluyen no sólo la reducción del costo total del proceso sino también
la simplicidad del escalado (scaling-up) con respecto a los requerimientos de un fermentador de
células de insecto. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la optimización de la expresión de
proteínas en larvas es compleja y algunos aspectos del proceso deben analizarse para cada caso
en particular.
Rachiplusia nu
Las larvas de la especie Rachiplusia nu son vulgarmente llamadas “orugas medidoras” debido a
su particular manera de desplazarse, arqueando su cuerpo a medida que avanzan con sus dos
pares de patas en los segmentos abdominales. Esta especie es una de las plagas más frecuentes
en cultivos de leguminosas en Argentina y su importancia es variable según el cultivo que dañe
(Arretz et al.,1985). Su ciclo natural presenta los brotes más importantes entre diciembre y marzo
y la etapa más destructiva de la larva como plaga desfoliadora se alcanza durante los últimos
estadios larvales (Figura I8).
29
Introducción
Figura I8. Larva de Rachiplusia
nu (oruga medidora) del último
estadio larval en una hoja de
Glycine max (soja).
Las hembras son capaces de oviponer entre 100 y 500 huevos en el envés de las hojas, los que
eclosionan entre los 7 y 8 días post oviposición. El ciclo larval presenta 5 o 6 estadios y
transcurre durante 15 a 25 días. Al final del último estadio, la larva deja de alimentarse y
comienza a formar un capullo sedoso dentro del cual pasa al estadio de pupa. Siete a 10 días
después emerge el estadio adulto del capullo, completando el ciclo.
La cría en el laboratorio de larvas de R. nu se basa en el conocimiento de los tiempos del ciclo
natural del insecto y de los requerimientos nutricionales mínimos para la formulación de una
dieta artificial apropiada para esta especie. Por lo general, se requiere de un fotoperíodo de 14 h
de luz y 10 h de oscuridad, una temperatura de entre 26 y 27 °C y humedad entre 65 y 70 %.
Infección de larvas con baculovirus recombinantes
Como se describió anteriormente, los ODV transmiten la infección entre los insectos mediante la
oclusión en OB y los BV transmiten la infección entre células del mismo insecto. Basados en este
paradigma, se utilizan básicamente dos métodos para iniciar la infección y producir proteínas
recombinantes en larvas de insecto: inyección intrahemocélica con baculovirus brotantes
(obtenidos de cultivos de células) o infección por vía oral por administración de poliedros en la
dieta del insecto. Variantes de estos dos métodos fueron descritas y probadas, como la
administración de OB en una gota líquida que la larva sorbe (Kunimi y Fuxa, 1996) o la
inoculación por aerosoles sobre el cuerpo de la larva (Jinn et al., 2009).
La infección por inyección de baculovirus genotipo pol- en la hemolinfa del insecto suele
rendir altos niveles de expresión de proteínas de interés (López et al., 2005), pero presenta la
desventaja de ser un proceso tedioso, ya que requiere la necesidad de infectar larva por larva y
además se genera una cierta variabilidad dada por el operador. Además, un porcentaje
considerable de larvas muere como consecuencia de la inoculación.
30
Introducción
La infección oral de larvas con poliedros recombinantes resulta una metodología más simple
y segura. A pesar de que AcMNPV ha sido utilizado en una amplia variedad de cultivos
celulares de lepidópteros (McIntosh et al., 2005), el número de especies de insectos susceptibles a
infección por este virus por vía oral es limitado. La resistencia a la infección en los hospedadores
semisusceptibles a menudo se asocia con los hemocitos, que juegan un rol crucial en la
transmisión de la infección dentro del insecto (Trudeau et al., 2001; Clarke y Clem, 2002).
El uso de proteínas fluorescentes como la proteína GFP (del inglés green fluorescent protein) o
la DsRed (Discosoma coral) se ha convertido en una herramienta útil para estudios de expresión
génica in vivo, movilización y localización de proteínas y microorganismos (Cha et al., 1999; Jinn
et al., 2005). En particular, en este trabajo se utilizó GFP como proteína reportera y modelo: las
células infectadas por un baculovirus recombinante que expresa GFP fluorescen al ser irradiadas
con luz azul, permitiendo una fácil diferenciación entre las células infectadas y las no infectadas.
De igual manera, su uso permite la detección de larvas infectadas simplemente por visualización
al microscopio óptico o bajo lupa con lámpara de luz azul.
Infección por vía oral
Las ventajas de la infección por vía oral de larvas de lepidóptero para la obtención de altos
niveles de proteínas de interés son amplias. La administración de poliedros sobre la dieta de los
insectos resulta una metodología inocua para las larvas y práctica en la medida de que se
pueden infectar grandes números de insectos en un solo evento. La producción del inóculo
puede realizarse tanto por infección de cultivos celulares con el baculovirus de interés como por
infección de larvas por inyección y aislamiento de poliedros de las mismas a tiempos muy
tardíos. Este último proceso permite obtener grandes cantidades de cuerpos de oclusión de una
manera fácil y económica.
Los fenotipos baculovirales que resultan infectivos por vía oral son el denominado POV o
virus preocluido, que se encuentra en el núcleo previo a la oclusión y los ODV incluidos en los
poliedros. Como ya fue mencionado, estos tipos virales presentan proteínas en su envoltura que
lo distinguen del fenotipo brotante o BV ya que varias de esas proteínas resultan esenciales para
la infección primaria de las células del intestino de la larva.
La obtención de baculovirus recombinantes que se basan en el reemplazo del gen poliedrina
por la secuencia del gen de interés resulta en baculovirus que no forman poliedros, ya que son
31
Introducción
de genotipo pol-. Esto se convierte en un impedimento para la inoculación de larvas por vía oral.
Sin embargo, se ha demostrado la infectividad de los baculovirus pol- en su fase POV aislados
del núcleo de la célula infectada, al ser inoculados por vía oral en forma líquida (droplet feeding
method, o método de la absorción de la gota) en larvas neonatas de Trichoplusia ni (Wood et al.,
1993).
Baculovirus occ- como inóculo de infección de larvas por vía oral
A pesar de la infectividad oral del fenotipo viral POV, la metodología para su obtención resulta
impráctica, ya que requiere la lisis celular y su extracción de los núcleos infectados. Así, la
oclusión de baculovirus que carecen del gen poliedrina para su utilización como inóculo de
infección por vía oral resulta un desafío biotecnológico. Para ello, se han descrito al menos dos
métodos que permitieron obtener baculovirus recombinantes ocluidos. La primera estrategia
consiste en la coinfección de células con baculovirus recombinantes occ- y baculovirus AcMNPV
wt para la obtención de cuerpos de oclusión de naturaleza mixta: en su interior coexisten ambas
poblaciones virales (Hamblin et al., 1990). La segunda estrategia consiste en la construcción de
un baculovirus recombinante de genotipo pol+ que porta el gen de interés bajo el promotor de
poliedrina y el gen poliedrina bajo el promotor de la proteína no esencial P10 de AcMNPV.
(Heldens et al., 1997; Je et al., 2001). Ambos métodos de obtención de poliedros recombinantes
presentan ventajas y desventajas con respecto al rendimiento. Los poliedros de naturaleza mixta
generan dos poblaciones virales diferentes dentro de la larva, donde posiblemente los
baculovirus salvajes tengan mayor aptitud frente a los recombinantes. (López, tesis de
licenciatura). Con la segunda estrategia se generan poliedros que sólo contienen baculovirus
recombinantes, pero que no alcanzan el máximo de expresión obtenido con los baculovirus occdebido posiblemente a la coexistencia en el mismo genoma del gen de interés y el gen
poliedrina. El promotor p10 es un promotor fuerte que también ha sido utilizado para la
expresión de genes heterólogos (Farrel et al., 1998; Wu et al., 2000). Sin embargo, el ARN
mensajero de poliedrina es muy estable y posee secuencias río arriba y río abajo del codón de
iniciación que le confieren una alta tasa traduccional. Compitiendo ambos mensajeros por la
maquinaria traduccional de las células infectadas, podría existir una ventaja en la traducción de
poliedrina, por lo que se observan menores niveles de expresión del gen de interés (López, tesis
de licenciatura). Una solución de compromiso entre estas dos metodologías consiste en la
32
Introducción
coinfección entre dos baculovirus recombinantes, uno occ- y otro occ+ para la obtención de
poliedros con mayor proporción de genoma recombinante.
3. 2 Empleo de los baculovirus como biopesticidas
En los últimos años, se ha puesto gran atención al uso de agentes entomopatógenos como
factores de regulación de algunas poblaciones de insectos, especialmente aquellas que afectan la
producción agrícola. Esta tecnología ofrece grandes ventajas sobre los conocidos pesticidas
químicos, como la seguridad que representan para la salud de humanos y otros organismos y la
reducción de residuos tóxicos, tanto en los alimentos producidos como en el suelo. Sin embargo,
la principal desventaja es que no alcanzan una alta eficacia a campo (Moscardi, 1999). En
condiciones naturales, existe un período relativamente largo entre la infección del insecto y su
efecto letal, durante el cual el insecto susceptible continúa alimentándose y causando daños en
las especies vegetales de interés. Este retardo en la acción, la susceptibilidad de los baculovirus a
la luz UV y el requerimiento de sistemas de producción con organismos vivos representan las
principales limitantes en la aplicabilidad del sistema. Actualmente se realizan grandes esfuerzos
para equiparar la potencia de los baculovirus a la de los pesticidas químicos. Estos desarrollos
apuntan a aumentar la virulencia y disminuir el tiempo de muerte, a mejorar la performance de
los baculovirus bajo distintas condiciones climáticas, a aumentar la eficiencia de producción y a
mejorar las formulaciones, entre otros objetivos (Lacey et al., 2001). La introducción en el genoma
de los baculovirus de genes que codifican proteínas que interfieren con el metabolismo del
insecto o la metamorfosis (por ejemplo, la hormona diurética o la hormona protoracicotrópica)
(Black et al., 1997) o toxinas específicas (por ejemplo TxP-I, AaIT, LqhIT1/2) ha mostrado una
importante mejora en la patogenicidad de los baculovirus como bioinsecticida.
Otro ejemplo de utilización de proteínas tóxicas para los insectos es la incorporación en el
genoma de AcMNPV del gen de la proteína Cry1A de Bacillus thuringensis que constituyó una
buena estrategia para el aumento de la dosis letal media (DL50) (Merryweather et al., 1990).
Afortunadamente, hasta el momento no existe evidencia que sugiera que los baculovirus
recombinantes de este tipo representen un riesgo, ni para el mundo animal ni para el ambiente,
mayor al que producen los baculovirus parentales (Szewczyk et al., 2006). Sin embargo, resulta
conveniente evitar que los baculovirus modificados se propaguen por generaciones en el campo.
Los baculovirus recombinantes que carecen de poliedrina en su genoma aparecen entonces
33
Introducción
como la alternativa más segura para el control biológico de plagas. Los conocimientos sobre la
biología de los baculovirus progresan en pos del mejoramiento de las formulaciones de
biopesticidas basadas en baculovirus porque no quedan dudas de que éstas poseen un riesgo
mucho menor para el ambiente que los clásicos pesticidas químicos.
34
Hipótesis y Objetivos
Hipótesis y Objetivcs
Hipótesis
La hipótesis en la que se basa este trabajo de tesis es que es posible complementar baculovirus
de genotipo pol- mediante la expresión en trans de poliedrina desde el genoma de células de
insecto, dotándolos de infectividad oral.
Objetivos
Objetivo general
El objetivo general de este trabajo consiste en determinar la mejor estrategia para la construcción
de una línea estable de células Sf9 que exprese poliedrina y evaluar su capacidad
empaquetadora de baculovirus de genotipo pol-.
Objetivos específicos
Para desarrollar el objetivo general se plantean los siguientes objetivos específicos:
Determinar las secuencias requeridas para regular de forma óptima la expresión del gen
poliedrina mediante ensayos de expresión transitoria de un gen reportero.
Obtener una línea establemente transformada con el gen poliedrina y sus secuencias
regulatorias, evaluar la expresión de poliedrina luego de la infección con un baculovirus poly estudiar la morfogénesis de poliedros en este sistema.
Analizar la oclusión de baculovirus pol- mediada por la línea establemente transformada.
Estudiar la infectividad por vía oral de los baculovirus ocluidos por la línea estable, en larvas
de Rachiplusia nu.
35
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
1. Virus
El baculovirus utilizado en este trabajo fue el virus de la poliedrosis nuclear Autographa
californica (AcMNPV). Su multiplicación se realizó en células Sf9 crecidas en forma de monocapa
a 27 °C. Los stocks virales de uso se obtuvieron luego de dos o tres pasajes de virus por células a
una baja multiplicidad de infección (moi).
2. Células
Se utilizaron células de insecto de la línea Sf9 (Invitrogen) que es un clon aislado de la línea
IPLBSF21-AE (Sf21), derivada de tejido ovárico del lepidóptero Spodoptera frugiperda. Las células
se crecieron a 27 °C en forma de monocapa en medio de cultivo Sf900II SFM (Gibco-BRL)
suplementado con 1 % de suero fetal bovino (SFB) (Gibco-BRL) y una solución de antibióticoantimicótico (penicilina 10.000 U/ml, estreptomicina 10 mg/ml, anfotericina B 25 µg/ml, GibcoBRL).
3. Cepas bacterianas
Para las estrategias de clonado se utilizó la cepa DH5α de E. coli de genotipo: supE44 thi-1 recA1
gyrA (NaIr) relA1 ∆(lacIZYA-argF)U169 deoR (φ80dlac∆lacZ)M15.
Para la generación de bácmidos recombinantes se utilizó la cepa de E. coli DH10Bac
(Invitrogen) cuyo genotipo es: F- mcrA ∆ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1
endA1 araD139 ∆(ara, leu) 7697 galU galK λ-rpsL nupG/ bMON14272/pMON7124.
Los cultivos líquidos se realizaron en medio LB (5 g/l Triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10
g/l NaCl), con agitación constante de 200 rpm a 37 °C.
36
Materiales y Métodos
4. Metodología del ADN recombinante
4.1 Preparación de ADN plasmídico de alta calidad
Para la obtención de ADN plasmídico de alta calidad se utilizaron las columnas de intercambio
aniónico comerciales QIAGEN. La purifiación del ADN plasmídico se realizó a partir de 3 ml de
sobrenadante de cultivo saturado de bacterias transformadas, rindiendo aproximadamente 20
µg de ADN que fue eluido de la columna con 100 µl de una solución de Tris-HCl 10 mM pH 8.
4.2 Digestión con enzimas de restricción
Para las digestiones de los diferentes plásmidos se utilizaron 500 ng de ADN, 5 U de enzima de
restricción (provistas por New England Biolabs o Promega), buffer apropiado y un volumen final
de 20 µl. Las reacciones se incubaron 2 h a la temperatura recomendada para cada enzima.
4.3 Defosforilación de los extremos 5’ fosfato
La reacción de remoción de los grupos fosfato de los extremos 5’ de los plásmidos digeridos se
realizó utilizando 5 U de la enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP, New England
Biolabs) agregada directamente al volumen de reacción de digestión. La reacción se incubó por
15 min a 37 °C. En algunos casos se optó por utilizar la enzima SAP (shrimp alcaline phosphatase)
(Promega) para lo cual se adicionó 1 U de SAP al volumen de reacción, 1X final de buffer SAP
10X y se incubó 15 min a 37 °C. Para inactivar esta enzima se calentó la reacción a 65 °C por 15
min.
4.4 Incorporación de nucleótidos a fragmentos cohesivos de ADN
Para el emparejamiento de las hebras en fragmentos de ADN producto de digestiones con
enzimas de restricción que generaron extremos cohesivos, se procedió al “llenado” de los
nucleótidos faltantes utilizando el fragmento klenow de la enzima ADN polimerasa (New
England Biolabs). Para esto se incubó por cada μg de ADN molde, 2,5 mM de cada uno de los
dNTPs y 10 U del fragmento klenow directamente en la reacción de digestión. La reacción se
incubó 30 min a 37 °C.
37
Materiales y Métodos
4.5 Electroforesis en geles de agarosa
Se realizaron geles de agarosa de concentraciones entre 0,8 % y 1,5 %. Los geles se corrieron en
buffer TAE (Tris-acetato 10 mM, EDTA 1 mM) a 5-10 V/cm a temperatura ambiente. Con el fin de
visualizar las bandas de ADN se utilizó bromuro de etidio a una concentración de 0,5 µg/ml de
gel.
Para sembrar las muestras se utilizó un buffer de siembra de concentración 10X (glicerol 50
%, TAE 10X, azul de bromofenol 1 %).
Los marcadores de peso molecular uilizados fueron 1 kb y 1 kb Plus (Invitrogen).
Los geles fueron fotografiados utilizando un equipo Fotodyne y el programa Collage
(Macintosh).
4.6 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
Las bandas de ADN resueltas mediante geles de agarosa se escindieron del gel mediante el uso
de bisturí y se purificaron utilizando el kit “QIAEX II purification system” (QIAGEN). El ADN
obtenido se resuspendió en una solución de Tris-HCl 10 mM pH 8 siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
4.7 Reacciones de ligado molecular
Para el ligado molecular de los diferentes insertos a los plásmidos correspondientes, se
utilizaron entre 50 y 100 ng de vector y diferentes relaciones molares vector: inserto (1:1 y 1:3).
La reacción se llevó a cabo en un volumen de 10 µl, en presencia de buffer de ligado (Tris-HCl 50
mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, dithiothreitol 10 mM, dATP 1 mM, seroalbúmina bovina 25 µg/ml) y
10 U de enzima T4 ADN ligasa (New England Biolabs). La reacción se incubó a 16 °C toda la
noche, incluyendo un control de vector sin inserto.
4.8 Transformación de bacterias
Las bacterias E. coli DH5α se hicieron competentes para la transformación mediante el método
de Hanahan (1985) y se mantuvieron congeladas a –70 °C hasta su uso. Entonces se
descongelaron y se mantuvieron en hielo por 10 min. A 50 µl de bacterias se agregaron 5 µl del
38
Materiales y Métodos
producto de las diferentes reacciones de ligado, se mezcló suavemente y se incubó en hielo por
30 a 45 min. Posteriormente se realizó un choque térmico a 42 °C por 90 s y se dejó en hielo por 2
min adicionales. Luego, se agregaron 200 µl de medio LB, se incubó a 37 °C con agitación suave
y se plaqueó en medio LB agarizado conteniendo ampicilina a una concentración final de 100
μg/ml. Las placas se incubaron a 37 °C toda la noche y las colonias se picaron con escarbadientes
esterilizados, que se usaron para inocular cultivos de 3 ml de LB/Ampicilina.
4.9 Minipreparaciones de ADN
Se utilizó el método de Birnboim y Doly (1979) con ligeras modificaciones. Se partió de 3 ml de
cultivo de bacterias en medio LB/ampicilina crecido toda la noche a 37 °C. Las bacterias se
cosecharon por centrifigación a 10.000 x g en una microcentrífuga de mesa y se resuspendieron
en 200 µl de Solución I (Tris-HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM). Luego, se
agregaron 200 µl de Solución II (NaOH 0,2 N, SDS 1 %) se mezcló suavemente por inversión y se
incubó 5 min a temperatura ambiente. Finalmente se agregaron 200 µl de Solución III (acetato de
potasio 3 M) y se mezcló por inversión. Se centrifugó el floculado a 10.000 x g durante 10 min. Se
tomó el sobrenadante libre de floculado y se traspasó a un tubo de microcentrífuga limpio
donde se precipitó el ADN plasmídico por el agregado de 0,6 volúmenes de isopropanol y
centrifugación a 10.000 x g durante 20 min. Se enguajó el precipitado con etanol 70 %, se secó
bajo vacío y se resuspendió en 50 µl de H2O conteniendo ARNasa (100 ug/ml).
Para verificar la presencia, integridad y orientación de los diferentes insertos en cada
estrategia de clonado, se digirieron de 2 a 6 µl de esta solución con las enzimas de restricción
apropiadas.
4.10 Secuenciación de ADN
Se realizó en el Servicio Interno de Genotipificación y Secuenciación Automática (SIGYSA) del
Instituto de Biotecnología mediante secuenciación automática.
5. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida
Se utilizaron geles desnaturalizantes de poliacrilamida de concentraciones 10 %, 12 % y 15 %,
dependiendo del tamaño de la proteína a ser visualizada en cada caso. El grado de
39
Materiales y Métodos
entrecruzamiento acrilamida:bisacrilamida utilizado fue 29:1. Se utilizaron minigeles (6 x 9 cm,
Miniprotean III, Biorad), los que se corrieron a una corriente constante de 100V en buffer Trisglicina-SDS (Tris-HCl 25 mM pH 8,8, glicina 190 mM, SDS 0,1 %).
6. Identificación de proteínas mediante Western blot
6.1 Electrotransferencia
Luego de efectuada la electroforesis, los geles de poliacrilamida se equilibraron durante 2 min
con buffer de transferencia (Tris-HCl 25 mM pH 8,8, glicina 190 mM, metanol 20 %). Entonces se
cortó un rectángulo de nitrocelulosa (S&S BA 0,45 µm, Schleicher & Schuell) de tamaño algo
mayor que el del gel y se hidrató durante 5 min. Se dispuso sobre la cara del cassette de
transferencia correspondiente al electrodo negativo (Bio-Rad): una esponja del tipo Scotch Brite
(Bio-Rad), un papel de filtro Whatmann 3 mm, el gel de poliacrilamida, el filtro de nitrocelulosa,
un papel de filtro Whatmann 3 MM y una esponja del tipo Scotch Brite. Se montó el cassette
dentro de la cuba de transferencia (Bio-Rad), se llenó con buffer de transferencia y se
transfirieron las proteínas del gel al filtro de nitrocelulosa aplicando una corriente constante de
200 mA a 4 °C por 1,5 h.
6.2 Detección inmunológica de proteínas
Se bloquearon los filtros 1 h a temperatura ambiente en buffer TBS-Tween-leche 5 % (Tris-HCl 50
mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 0,005 %, leche descremada 5 %). Luego, se lavaron con
buffer TBS-Tween y se incubaron con diluciones apropiadas de los anticuerpos específicos
(1:1.000 para el suero de pollo anti-poliedrina, GenTex®; 1:2.000 para el monoclonal anti-VP39,
Whitt y Manning, 1988; 1:20 para el monoclonal N25 8c anti-P74, Faulkner et al., 1997 y 1:1.000
para el anticuerpo monoclonal AcV5 anti-GP64, Hohmann y Faulkner, 1983) en TBS-Tweenleche descremada 3 %. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, se
lavaron los filtros 3 veces con solución de lavado TBS-Tween por 10 min y se incubaron con el
segundo anticuerpo en TBS-Tween-leche 3 % (cabra anti-pollo conjugado con la enzima fosfatasa
alcalina 1:30.000, AXELL; cabra anti-ratón conjugado con la enzima fosfatasa alcalina 1:15.000,
SIGMA; cabra anti-ratón conjugado con la enzima peroxidasa 1:2.000, SIGMA). Para los
anticuerpos conjugados a fosfatasa alcalina, tras 1 h de incubación a temperatura ambiente con
40
Materiales y Métodos
agitación suave se lavaron los filtros 3 veces con solución de lavado por 10 min, una vez con el
buffer de revelado de fosfatasa alcalina (Tris-HCl 100 mM pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM)
por 10 min y se agregaron 5 ml de solución de revelado [10 ml de buffer de revelado, 66 µl de
Nitro blue tetrazolium (NBT, 50 mg/ml en dimetilformamida 70 %, Promega)] y 33 µl de bromocloro-indoil-fosfato (BCIP, 50 mg/ml en dimetilformamida 100 %, Promega). Se incubó con
agitación suave por 3 a 15 min con luz tenue, hasta visualizar las bandas de interés. La reacción
de revelado se detuvo por lavados con agua y los filtros se secaron al aire y se resguardaron de
la
luz.
Para
el
anticuerpo
conjugado
a
peroxidasa,
el
revelado
se
realizó
por
quimioluminiscencia utilizando el kit comercial Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo
Scientific), según el protocolo sugerido.
7. Obtención de los baculovirus recombinantes
7.1 Metodologías utilizadas
Para la construcción de los baculovirus recombinantes AcGFPpol-, AcGFPpol+, AcPOL- y
AcPOLE44G se utilizaron distintas metodologías, ya descritas en la Introducción.
Los baculovirus AcGFPpol- y AcPOLE44G fueron obtenidos mediante el sistema Bac-to-Bac®
(Invitrogen), que consiste en la obtención de un vector de transferencia basado en la inserción
del gen de interés en el plásmido pFastBac-1 (Invitrogen), para la transposición con el genoma
completo de baculovirus que contienen las bacterias modificadas DH10Bac.
El baculovirus AcGFPpol+ se obtuvo mediante la co-transfección en células de insecto del
bácmido bAcGOZA y el vector de transferencia pBacPAK8 portando el gen poliedrina.
El baculovirus AcPOL- se construyó por la técnica BaculoGoldTM, utilizando el vector
pVL1393 (BD Biosciences) modificado (pVL1629).
7.2 Construcción de los vectores de transferencia
Para la construcción del vector de transferencia pFastBacGFP necesario para la obtención del
baculovirus AcGFPpol-, se amplificó el gen de la proteína fluorescente verde GFP utilizando
como templado el plásmido PCDNA-GFP obtenido previamente en el laboratorio.
El oligonucleótido sentido (GFP-for 5´ TTCTAGAGTATGGTGAGCAAGGGC 3´) fue
diseñado incluyendo el triplete propio de iniciación de la traducción de GFP y sitios de
41
Materiales y Métodos
reconocimiento para la enzima de restricción XbaI (subrayada). Además, se consideraron las
secuencias consenso que rodean el ATG para una óptima traducción en el sistema
baculovirus/células de insecto (ANYATGNY). El oligonucleótido antisentido (GFP-rev 5´
TTCTAGACTTGTACAGCTCGTC 3´) fue diseñado incluyendo el codón de terminación de la
traducción y la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI.
La reacción de PCR se realizó utilizando aproximadamente 100 ng de templado y las
siguientes concentraciones finales de reactivos: 0,3 mM de cada uno de los oligonucleótidos, 1X
PCR buffer (Promega), 0,3 μM de cada dNTP y 1 U de GoTaq (Promega) en un volumen de
reacción final de 20 µl. El ciclo de temperaturas utilizado fue: 94 °C, 5 min; (94 °C 30 s, 58 °C 30 s,
72 °C 1 min) x 35 ciclos, 72 °C 7 min. El fragmento amplificado de GFP resultó de 716 pb, el que
fue purificado por gel de agarosa 1 % y extraído del mismo con el kit de purificación de ADN de
tacos de agarosa QIAEX II. Este producto de PCR se ligó al vector pGEMT-easy (Promega) y se
transformaron bacterias DH5α que fueron plaqueadas en medio LB agarizado en presencia de
ampicilina 100 µg/ml, IPTG 40 µg/ml y X-Gal 100 µg/ml. Se seleccionaron las colonias blancas y
se analizó la presencia del inserto mediante digestión con enzimas de restricción. Para constatar
la identidad de los genes obtenidos se secuenciaron las regiones de interés del pGEMT-GFP
utilizando los oligonucleótidos comerciales T7 y SP6.
Posteriormente se digirieron los plásmidos pFastBac-1 y pGEMT-GFP con la enzima XbaI, se
removieron los grupos 5’ fosfato del vector, se resolvieron los fragmentos mediante
electroforesis en geles de agarosa y se purificaron las bandas de ADN del tamaño esperado (716
pb GFP y 4.700 pb pFB). Luego, los fragmentos vector e inserto se ligaron molecularmente en
una relación V:I de 3:1 durante toda la noche y se utilizaron 5 µl de la reacción de ligación para
transformar 50 µl de bacterias E.coli DH5α competentes. Se seleccionaron las bacterias
transformadas mediante plaqueo en medio LB-agar con ampicilina. Se analizó la presencia y
orientación de GFP en varios clones por digestión con enzimas de restricción y posterior
secuenciación. Se obtuvo así el vector pFastBacGFP.
De manera similar se obtuvo de vector pFastBacPOLE44G, utilizado en la construcción del
baculovirus AcPOLE44G. La secuencia codificante de poliedrina con la mutación en el nucleótido
130 (sustitución de A por G) fue amplificada a partir del vector en la cual se detectó la
mencionada
mutación,
utilizando
el
oligonucleótido
sentido
POL-ATG
(5´
TAAATATGCCGGATTATTCA 3´) que incluye el codón de iniciación de la traducción (en
negrita) y el antisentido POL-STOP (5´ TTTTAATACGCCGGACCAGT 3´) que incluye el codón
42
Materiales y Métodos
terminación de la traducción (en negrita). La reacción de PCR se realizó utilizando
aproximadamente 100 ng de templado y las siguientes concentraciones finales de reactivos: 1X
Pfx Amplification buffer (Invitrogen), 0,3 μM de cada dNPT, 1 mM de MgSO4, 1 U de Platinum®
Pfx ADN polimerasa (Invitrogen) y agua bidestilada hasta un volumen final de 20 μl. El ciclado
se llevó a cabo a las siguientes temperaturas: 94 °C 10 min; (94 °C 15 s, 55 °C 30 s, 68 °C 1 min) x
35 ciclos, 68 °C 10 min. El producto de PCR de tamaño esperado se purificó de agarosa y se
clonó en el vector pGEMT-easy. Se seleccionó un clon por análisis de restricción y se corroboró
la presencia del gen mutado por secuenciación.
A continuación se digirieron los plásmidos pFastBac-1 y pGEMT-POLE44G con la enzima
EcoRI, se removieron los grupos 5’ fosfato del vector, se resolvieron los fragmentos mediante
electroforesis en geles de agarosa y se purificaron las bandas de ADN del tamaño esperado (740
pb POLE44G y 4.700 pb pFB). Luego, se ligaron los fragmentos vector e inserto y se transformaron
50 µl de bacterias E.coli DH5α competentes. Se seleccionaron colonias de bacterias que crecieron
en medio LB-agar con ampicilina y se analizó la orientación y presencia de la mutación de POL
en varios clones por digestión con enzimas de restricción y posterior secuenciación. Se obtuvo
así el vector pFastBac-POLE44G.
El vector pBacPAK-GFP utilizado en la construcción del baculovirus AcGFPpol+ se obtuvo
por digestión del plásmido pBacPAK8 (Clontech) con la enzima BglII y digestión del plásmido
pGEMT-GFP con la enzima BamHI. Luego de remover los grupos 5’ fosfato del vector se
obtuvieron los fragmentos de peso molecular esperado (5.500 pb pBP y 650 pb GFP), se
purificaron y se ligaron toda la noche. A continuación, se transformaron bacterias competentes
con el producto de ligación y se seleccionaron varios clones resistentes a ampicilina. El análisis
de la integridad del vector se realizó por PCR utilizando el oligonucleótido sentido pHEcoRV (5´
GTTGCTGATATCATGGAG 3´) que hibrida dentro del promotor de poliedrina y el
oligonucléotido antisentido GFP-rev. Se utilizó la enzima GoTaq y el ciclado se realizó de la
siguiente manera: 94 °C 5 min; (94 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 40 s) x 35 ciclos, 72 °C 7 min.
Para la construcción del baculovirus AcPOL- se generó un vector de transferencia sin
regiones de poliedrina, denominado pVL1629, que posee el ORF 1629 intacto. Para ello se partió
del plásmido comercial pVL1393 (BD Biosciences), del cual se eliminaron por digestión con las
enzimas BamHI y SnaBI, los restos de secuencia de poliedrina. Como resultado de la digestión se
desprendieron 690 pb que incluyen la secuencia de poliedrina desde el nt 174. El fragmento de
77 pb del ORF 1629, que se perdió en ese evento de digestión (desde el nt 4.834 al 4.911 del
43
Materiales y Métodos
genoma de AcMNPV), se obtuvo por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 1629FOR
(5´ AGGATCCACGATACATTGTT 3´) que posee el sitio para la enzima BamHI (subrayado) y
1629REV (5´ATACGTACAACAATTGTCTG 3´) que posee el sitio de corte para la enzima SnaBI
(subrayado). Como templado se utilizó ADN de baculovirus wt. Se utilizó para la la reacción de
PCR la enzima Gotaq y el siguiente ciclo de temperaturas: 94 °C 10 min; (94 °C 20 s, 50 °C 30 s,
72 °C 10 s) x 35 ciclos, 72 °C 10 min. Una vez clonado en el vector pGEMT-easy, el fragmento se
desprendió por digestión con las enzimas BamHI y SnaBI y se subclonó en el vector pVL1393
digerido con las mismas enzimas. La identidad del plásmido pVL1629 fue comprobada por
restricción y posterior secuenciación.
7.3 Generación de los bácmidos recombinantes por el método Bac-to-Bac
Se transformaron 50 µl de bacterias E. coli DH10Bac con los plásmidos de transferencia pFastBacGFP o pFastBac-POLE44G. La selección de las bacterias que incorporaron el plásmido se realizó en
placas con LB agar con los antibióticos kanamicina, tetraciclina y gentamicina a concentraciones
finales de 50 μg/ml, 7 μg/ml y 7 μg/ml respectivamente. El evento de transposición fue
seleccionado por el color de la colonia (fenotipo blanco), en presencia de IPTG 50 μg/ml y Bluogal 40 μg/ml. Se seleccionaron varias colonias blancas que se crecieron en LB líquido en
presencia de los tres antibióticos y los bácmidos se extrajeron con el protocolo de
minipreparaciones de ADN, teniendo en cuenta que el tamaño del mismo es de
aproximadamente 140 kpb (O'Reilly, 1994). Posteriormente, se confirmó la presencia del cassette
transpuesto en el bácmido recombinante mediante PCR con los oligonucleótidos específicos
universales M13 for y M13 rev. Para esta reacción se utilizó la polimerasa Taq Platinum
(Invitrogen) y el ciclo de amplificación fue: 95 °C 10 min, (94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 5 min) x 35
ciclos, 72 °C 15 min. Una vez confirmada la identidad de los bácmidos recombinantes, se
procedió a transfectarlos en células Sf9.
7.4 Obtención de los baculovirus recombinantes
Los baculovirus recombinantes AcGFPpol- y AcPOLE44G se obtuvieron por transfección de
bácmidos recombinantes por el método de transfección con lípidos catiónicos (Cellfectin®,
Invitrogen, o también llamada Celfectina). Brevemente, se mezcló 1 µg de ADN de bácmido
recombinante contenidos en 1 ml de medio Sf900II SFM con 10 μl de Celfectina, en un tubo de
44
Materiales y Métodos
1,5 ml. La mezcla se incubó 30 min a temperatura ambiente y se agregó sobre monocapas de
células Sf9 crecidas en placas de seis pocillos a una densidad de 1 x 106 células/pocillo. Las
placas se incubaron por 4 h a 27 °C, se removió el medio de transfección y se agregaron 3 ml de
medio SF900II SFM-1 % SFB. Tras 6 días de incubación a 27 °C se colectaron los sobrenadantes
en forma estéril y se clarificaron por centrifugación a 1.000 x g a 4 °C. Con una dilución 1/5 de
esos primeros pasajes virales se infectaron botellas de 25 cm2 conteniendo 1,6 x 106 células en
monocapa. A los 5 dpi, se colectaron los sobrenadantes, se clarificaron por centrifugación a 1.000
x g y se conservaron a 4 °C al resguardo de la luz, hasta su uso.
7.5 Obtención del baculovirus recombinante por el método bAcGOZA
El baculovirus AcGFPpol+ se obtuvo por co-transfección de células Sf9 con el vector de
transferencia pBacPAK-GFP y ADN del bácmido bAcGOZA (Je et al., 2001) en medio Sf900II
SFM mediante la técnica de lípidos catiónicos, tal cual fue descrito en el punto 7.4.
7.6 Obtención del baculovirus recombinante por el método BaculoGold
El baculovirus AcPOL- se construyó por co-transfección de células Sf9 con ADN lineal de
Baculovirus (BD Biosciences) y el vector de transferencia pVL1629 utilizando el lípido catiónico
Celfectina de igual manera a lo descrito en el punto 7.4.
8. Amplificación de los baculovirus recombinantes
Para aumentar el título viral se realizaron tres pasajes por células Sf9. Brevemente, se infectaron
1 x 106 células Sf9, crecidas en frascos de 25 cm2 con 100 µl de los sobrenadantes de transfección
o infección. Luego de 1 h de adsorción, se agregaron 4 ml de medio de cultivo SF900II SFM-1 %
SFB y se incubaron las células por 6 días a 27 °C. Los sobrenadantes de infección se colectaron de
forma estéril, se clarificaron por centrifugación a 1.000 x g a 4 °C y se mantuvieron refrigerados
protegidos de la luz. El tercer pasaje, realizado en un frasco 175 cm2, constituyó el stock viral.
45
Materiales y Métodos
9. Titulación viral
La titulación de los baculovirus se realizó mediante los métodos dilución a punto final y número
de placas de lisis.
9.1 Titulación por placas de lisis
Para titular los baculovirus recombinantes, se infectaron monocapas de células Sf9 crecidas en
placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 105 células/pocillo, con 0,5 ml de diluciones seriadas
de los stocks virales en medio de cultivo (10-5 a 10-9). Tras 1 h de adsorción, se agregaron 3 ml de
medio de cultivo-SFB conteniendo 0,5 % de agarosa SeaKem (FMC) y se incubaron las células
por 5 días a 27 °C. Sobre la primera capa de medio con agar se agregaron 3 ml de medio con agar
conteniendo el colorante vital rojo neutro a una concentración final de 50 μg/ml. Tras dos días de
incubación a 27 °C, se contaron las placas de lisis y se calculó el título viral, expresado en
unidades formadoras de placa por unidad de volumen de stock viral (ufp/ml).
9.2 Titulación por dilución a punto final
Los baculovirus que expresan GFP fueron titulados por este método mediante la visualización
de pocillos con células fluorescentes.
Brevemente, se agregaron 300 µl de diluciones desde 10-3 a 10-9 de los stocks virales a 2,7 ml
de células Sf9 a una densidad de 2,5 105 células/ml para la preadsorción del virus a las células.
Luego, 200 µl de cada una de estas siete suspensiones fueron colocados en 12 pocillos (una fila)
de una placa de de 96 pocillos, mientras que en la fila restante se colocaron células sin infectar
(control negativo).
La placa se incubó por 4 a 5 días en cámara húmeda a 27 °C y se contaron pocillos infectados
por visualización al microscopio en presencia de luz azul. El título viral se calculó según lo
descripto por Reed y Muench (1938).
10. Construcción de los plásmidos utilizados en transfecciones transitorias
Para los ensayos de transfección transitoria, se construyeron plásmidos en base a los vectores
comerciales pIB/V5-His/CAT (Invitrogen) y pVL1393 (Invitrogen) (Figura M1). El vector pIB/V5-
46
Materiales y Métodos
His/CAT fue denominado pCCAT porque posee el promotor baculoviral constitutivo OpIE2
guiando la transcripción del gen reportero cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Este vector
cuenta con un sitio de múltiple clonado río abajo del promotor OpIE2, para introducir la
secuencia de interés. Además porta resistencia al antibiótico ampicilina para su selección en
bacterias. El promotor de poliedrina y sus regiones regulatorias fueron tomados del vector
pVL1393. Las modificaciones sobre el vector pCCAT consistieron en el reemplazo del promotor
constitutivo por regiones promotoras de poliedrina de distinta complejidad. La figura M2
muestra un esquema de las construcciones obtenidas y los nombres asignados a las mismas para
su fácil reconocimiento. A continuación se detalla la obtención de cada una de ellas.
Figura M1. Plásmidos utilizados para obtener las construcciones reporteras con distintas regiones
promotoras de poliedrina, probadas en ensayos de transfección transitoria.
10.1 Obtención del plásmido pLCAT
El vector pLCAT (4.026 pb) se obtuvo sustituyendo el promotor constitutivo OpIE2 del plásmido
pCCAT por el promotor de poliedrina delimitado por el sitio NaeI, 222 pb río arriba de la región
promotora básica (L por fragmento largo del promotor, que comprende del nucleótido 3.497 al
4.196 del genoma secuenciado de AcMNPV). Para ello, se obtuvo por PCR la secuencia del
promotor de poliedrina del vector pVL1393 con el oligonucleótido sentido POLseqFOR (5´
ATCATGAATAGTACGCAGCTTCTTC 3´) que posee un sitio de reconocimiento de la enzima
BspHI (subrayado) y el oligonucleótido antisentido POLseqREV (5´ TTTCCTTGAAGAGTGAG
47
Materiales y Métodos
3´). La reacción se llevó a cabo utilizando 1 U de la enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen) con
un ciclo de temperaturas de: 95 °C 5 min, (94 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 1 min) x 35 ciclos, 72 °C 5
min. El producto de 432 pb fue purificado a partir del gel de agarosa y clonado en el vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen). Este vector al igual que el pGEMT-easy, permite la diferenciación
colorimétrica de las colonias de bacterias que poseen vector con inserto, por lo que al crecer en
placas de LB agarizado en presencia de ampicilina, IPTG y X-Gal fue posible aislar colonias
blancas. La presencia del inserto en los clones seleccionados fue confirmada por restricción. El
plásmido con el fragmento largo del promotor fue posteriormente digerido con las enzimas
BspHI y BglII para desprender el fragmento de 415 pb que fue purificado, cuantificado y clonado
dentro del plásmido pCCAT digerido con BspHI y BamHI. De esta manera se obtuvo el plásmido
con 222 pb río arriba del promotor mínimo de poliedrina.
EcoRV SpeI
pSCAT
XhoI
CAT
95 bp
BspHI
pLCAT
657 pb
NaeI
CAT
222 bp
pXLCAT
XXLrev
BspHI
AcSp
XLfor
CAT
30 pb
pXXLCAT
700 bp
BspHI
hr1REV
hr1
AcSp
CAT
881 pb
hr1FOR
1537 bp
2640 bp
Figura
M2. Esquema
que p
representa
las distintas regiones regulatorias ubicadas río arriba del gen
10.2
Obtención
del vector
XLCAT
reportero CAT para ser evaluadas en ensayos de expresión transitoria.
48
Materiales y Métodos
Para la construcción del vector pXLCAT (4.276 pb), se modificó el plásmido pLCAT agregándole
otra sección de la secuencia regulatoria existente río arriba del promotor de poliedrina. Para ello
se diseñaron un par de oligonucleótidos para amplificar una región de 700 pb río arriba del sitio
NaeI que delimitaba el promotor L. Utilizando como templado el vector pVL1393, se amplificó el
fragmento
de
700
pb
por
PCR
con
el
oligonucleótido
sentido
XLFOR
(5´
AATCATGAAACATATTGTACAAAACCGACGA 3´), con sitio de corte para la enzima BspHI
(subrayado)
y
el
oligonucleótido
antisentido
XXLREV
(5´
AATCATGATTGCAAACGTGGTTTTCGTGTGC 3´), también provisto del sitio de corte para la
enzima BspHI (subrayado). La reacción se llevó a cabo utilizando la polimerasa GoTaq con los
reactivos ya descritos y se utilizó el siguiente ciclado: 95 °C 5 min, (95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 1
min) x 35 ciclos, 72 °C 5 min. El producto de esta reacción fue purificado y clonado en el vector
pCR-2.1 TOPO. La presencia del inserto en el plásmido TOPO-XL fue analizada por restricción y
el mismo fue aislado mediante digestión con la enzima BspHI. Por otro lado se digirió el
plásmido pLCAT con la misma enzima, se purificó el vector linealizado y se realizó la
desfosforilación de sus extremos 5´ con la enzima CIP. El vector y el inserto fueron ligados
molecularmente en una relación V:I de 3:1 y se aislaron colonias de bacterias resistentes a
ampicilina. Los clones positivos se reconocieron por restricción y una posterior secuenciación
confirmó la identidad del vector con el promotor de poliedrina XL (por extra largo).
10.2 Obtención del vector pSCAT
El vector con el promotor mínimo de poliedrina fue obtenido a partir del plásmido pLCAT, por
restricciones secuenciales. El vector pSCAT (S por short, corto en inglés) debía poseer solamente
la región promotora básica de 95 pb, delimitada por el sitio EcoRV. La restricción del plásmido
pLCAT con las enzimas BspHI y EcoRV permitió eliminar las secuencias río arriba de ese
promotor mínimo. Debido a que la enzima EcoRV presenta dos sitios de corte en el vector
pLCAT, fue necesario realizar una digestión parcial para obtener el vector digerido en el sitio
deseado, pero intacto en el otro, y luego digerir con BspHI para obtener el fragmento necesario
para la religación. Brevemente, la digestión parcial con EcoRV se llevó a cabo en varias
reacciones utilizando diluciones seriadas al medio de enzima, desde 1 μl a 0,015 μl para aislar el
vector linealizado, es decir, digerido sólo en un sitio EcoRV. Las reacciones se incubaron a 37 °C
por 2 h y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Se logró purificar el vector
49
Materiales y Métodos
digerido en el sitio deseado, por reconocimiento del tamaño esperado, utilizando como
referencia el marcador de peso molecular 1 kb Plus. Luego, el vector linealizado fue sometido a
restricción por la enzima BspHI, para eliminar el fragmento de 222 pb río arriba del promotor
mínimo de poliedrina. El producto de la digestión total con BspHI se sometió a electroforesis en
gel de agarosa y se aisló el vector linealizado de 3.804 pb. El siguiente paso fue el rellenado de
extremos cohesivos utilizando nucleótidos y el fragmento klenow de la polimerasa, como fue
descrito en el punto 4.4 de Materiales y Métodos. De esta manera, se pudo ligar molecularmente
este fragmento que no posee regiones regulatorias de poliedrina río arriba del promotor básico
delimitado por el sitio EcoRV. La identidad de este vector fue analizada por restricción con las
enzimas BglII y XbaI (esperándose un patrón de tres bandas de 738 pb, 1.217 pb y 1.849 pb) y
posterior secuenciación.
10.3 Obtención del vector pXXLCAT
El vector con la región regulatoria más extensa río arriba del promotor mínimo fue obtenido
utilizando como base al plásmido pLCAT. En primer lugar, se amplificó la secuencia de la región
homóloga hr1 (nucleótidos 133.696 al 682 del genoma secuenciado de AcMNPV) (Guarino et al.,
1986) que sería introducida a manera de enhancer transcripcional. Se diseñaron los
oligonucleótidos hr1FOR (5´ ATTGATCATCATGAATCGATGATTGACCCCAACAAAA 3´)
que posee sitios de corte para las enzimas BclI (subrayado) y BspHI (negrita) y hr1REV (5´
ATTGATCAATCGATTATTGCTCCAATACTAG 3´) que posee sitio de corte para la enzima BclI
(subrayado).
Utilizando
como
molde
ADN
de
baculovirus
AcMNPV
salvaje,
los
oligonucléotidos hr1FOR y hr1REV y la enzima Gotaq, se amplificó una secuencia de 881 pb
utilizando el siguiente ciclado de temperaturas: 95 °C 5 min, (95 °C 40 s, 56 °C 40 s, 72 °C 50 s) x
35 ciclos, 72 °C 5 min. La banda del peso molecular esperado fue escindida del gel de agarosa,
purificada utilizando el kit comercial QIAEX II y clonada en el vector pGEMT-easy. El fragmento
de la región hr1 se recuperó por digestión con la enzima BclI. Esta enzima de restricción es
sensible a la metilación dam ya que su sitio de reconocimiento incluye la secuencia GATC,
donde la metilasa dam agrega un grupo metilo (sobre el nitrógeno 6 de la adenina). El ADN
aislado a partir de bacterias dam+ contiene Gm6ATC y no es digerido por BclI. Por lo tanto, se
seleccionaron 2 clones que poseían el inserto y con ellos se transformaron bacterias de genotipo
dam- , incapaces de metilar. De igual manera se procedió con el plásmido pVL1393. Una vez
50
Materiales y Métodos
aislados el nuevo plásmido pGEMT-hr1 y el vector pVL1393 no metilados, se procedió a la
digestión de ambos con la enzima BclI a 50 °C por 2 h. Se corrieron los productos de digestión en
geles de agarosa 1 % y se purificaron las bandas correspondientes al vector pVL1393 linealizado
y del fragmento de 881 pb. Se desfosforilaron los extremos 5´ con la enzima CIP y luego de su
purificación se los ligó molecularmente en una relación V:I de 3:1. Se analizó por restricción un
grupo de clones positivos, para corroborar la presencia del inserto en la orientación correcta. Se
seleccionó un clon, cuya identidad fue confirmada por secuenciación. A este plásmido se lo
llamó pVL-hr1. De este vector se extrajo la región regulatoria de 1.537 pb río arriba del promotor
de poliedrina más la región hr1 de 881 pb, es decir, una secuencia de 2.418 pb que fue
denominada región XXL. Una vez obtenida, se introdujo en el vector pLCAT. Para ello, se
amplificó la región XXL a partir del plásmido pVL-hr1, utilizando los oligonucleótidos hr1FOR y
XXLREV y la enzima Gotaq con un ciclo de temperaturas de: 95 °C 5 min, (95 °C 30 s, 53 °C 30 s,
72 °C 1 min 30 s) x 35 ciclos, 72 °C 7 min. El producto de la reacción de PCR fue corrido en gel de
agarosa 1 % y purificado para ser clonado en el plásmido pCR-2.1 TOPO. Una vez analizada la
integridad del inserto en el vector intermediario, se lo liberó por digestión con la enzima BspHI y
se lo subclonó en el vector pLCAT digerido con la misma enzima y al cual se le desfosforilaron
los extremos 5´ utilizando la enzima SAP (Promega). Los clones obtenidos fueron analizados
para corroborar la orientación del inserto XXL mediante ensayos de PCR, utilizando los
oligonucleótidos hr1FOR y SBR (5´ TAACGGTTCGTACAACA 3´ que hibrida en una región del
promotor de poliedrina existente en el plásmido pLCAT). Una vez reconocido el clon que
portaba el inserto en orientación correcta, se lo secuenció para corroborar su identidad. Así se
obtuvo el plásmido pXXLCAT de 6.448 pb con una región regulatoria de 2.640 pb río arriba del
promotor mínimo de poliedrina.
11. Expresión transitoria por las distintas regiones regulatorias de poliedrina
11.1 Transfecciones e infecciones para la expresión transitoria del gen reportero
Las transfecciones con los plásmidos anteriormente descritos se llevaron a cabo en células Sf9
cultivadas en placas de 24 pocillos. Brevemente, se sembraron 10 placas con 1,5 x 105 células por
pocillo en medio Sf900II SFM sin agregado de suero fetal y se las dejó adherir 1 h a temperatura
51
Materiales y Métodos
ambiente. Las transfecciones se realizaron utilizando dos placas por plásmido a ensayar. De
ambas, una sólo fue transfectada y la otra transfectada e infectada. Las transfecciones se
realizaron por triplicado por cada plásmido y por cada tiempo de cosecha: desde el 1° al 7° día
post transfección (dpt). Se transfectaron los vectores pSCAT, pLCAT, pXLCAT, pXXLCAT y como
control pcCAT, utilizando el lípido catiónico Celfectina. Por cada pocillo, se agregó un volumen
total de mezcla de transfección de 100 μl conteniendo 0,8 μg de vector más 2,5 μl de Celfectina
en medio Grace´s (Gibco). Se dejó incubando a 27 °C. Debido a que el promotor de poliedrina es
activado por factores virales tardíos, 4 h después de la transfección a las células de la segunda
placa de cada construcción se les retiró el medio de transfección y se las infectó con el
baculovirus AcPOL- a una moi de 1. Se dejó adsorber el virus durante 1 h a 27 °C y luego se
retiró el inóculo y se agregó a las células medio fresco suplementado con 3 % SFB. En una placa
separada se incluyeron los siguientes controles: i) células sin transfectar ni infectar; ii) células
mock transfectadas (transfectadas utilizando Celfectina sin ADN); iii) células mock transfectadas e
infectadas; iv) células sólo infectadas. Luego del tratamiento, las células fueron incubadas a 27
°C. La cosecha de las muestras se realizó a los 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 dpt (Figura M3).
D7
D7
D7
D7
Figura
D7
D7
M3.
Diseño
del
experimento para analizar la
expresión del gen reportero
D7
D7
CAT utilizando los plásmidos
con
distintas
regiones
regulatorias de poliedrina.
D7
D7
52
Materiales y Métodos
11.2 Análisis de la actividad del gen reportero CAT
11.2.1 Cosecha de las muestras
Desde el día 1 hasta el día 7 post transfección se cosecharon las células correspondientes a los
triplicados de ambos eventos: transfección o transfección-infección de cada plásmido. Los
controles se cosecharon a los 3 dpt.
A cada tiempo, se retiró el medio de transfección, se lavaron las células tres veces con PBS
pH 6,2, libre de Ca++ y Mg++ con cuidado de no despegar las células y se agregó 80 μl de Reporter
Lysis Buffer 1X (Promega) en cada pocillo. Se incubó 15 min a temperatura ambiente agitando
cada tanto y se colectó el contenido de cada pocillo en tubos de 1,5 ml, en hielo. Se agitó cada
muestra utilizando vortex por 15 s y se calentó a 60 °C durante 10 min para inactivar la actividad
de desacetilasas. Luego de esa incubación, se centrifugó 2 min a 8.000 x g y se pasó el
sobrenadante a nuevos tubos. Las muestras fueron guardadas a - 80° C hasta que fue realizado
el ensayo de medición de actividad del reportero.
11.2.2 Ensayo de CAT
La expresión y actividad de la enzima CAT se determinó cuantitativamente a través de la
combinación de los sustratos
14
C-cloranfenicol y n-butiril CoA (Promega). El producto de
reacción (n-butiril-cloranfenicol) se separa del cloranfenicol libre por ser soluble en solventes
orgánicos. Los extractos celulares fueron diluidos al cuarto para evitar saturación enzimática y
fueron medidos en un contador de centelleo líquido EG&G/Wallac 1414-001 WinSpectral, con un
protocolo para el isótopo 14C.
Brevemente, por cada 75 μl de muestra diluida en Reporter Lysis Buffer, se agregaron 50 μl de
una mezcla de 3 μl n-butirilCoA 5 mg/ml y 5 μl de
14
C-cloranfenicol 60 mCi/mmol en agua
bidestilada. En paralelo se realizó una curva de actividad de CAT, utilizando la enzima en cinco
concentraciones distintas. Partiendo de una concentración inicial de 0,1 U/μl, se ensayaron las
diluciones 1/16, 1/64, 1/264 y 1/1.024. A un volumen de 5 μl de cada dilución de enzima CAT se
le agregó una mezcla de 120 μl con 3 μl n-butirilCoA y 5 μl de
14
C-cloranfenicol en agua
bidestilada. Todas las muestras fueron incubadas durante 3 h a 37 °C, para que proceda la
reacción.
53
Materiales y Métodos
11.2.3 Extracción y medición de radioactividad
Una vez transcurrido el tiempo de reacción, se tomaron las muestras y se les extrajo la fracción
acetilada mediante el agregado de una fase orgánica en la cual quedarían retenidas. Se utilizó
para ello 300 μl de una mezcla de xilenos (MP Biomedicals) por tubo de reacción y se extrajo 3
veces, recuperando la fase orgánica y agregando 100 μl de Tris-HCl pH 8 frío para eliminar todo
resto de sustrato libre. Por último, se agregaron 200 μl de muestra en tubos para contador de
centelleo (Polistor) y se agregaron 1,5 ml de líquido de centelleo (SIGMA) para ser medidos en el
contador.
Los resultados de la medición de actividad de CAT obtenidos en cuentas por minuto (cpm)
fueron promediados para los triplicados de cada muestra y se realizó el cálculo del desvío
estándar.
12. Obtención de los vectores para transfecciones estables
La transformación de células de insecto para la expresión de poliedrina se llevó a cabo con el
sistema InsectSelectTM BSD (Invitrogen). Se obtuvieron construcciones basadas en los plásmidos
pXXLCAT (Figura R4) y pIB/V5-His (Invitrogen) (Figura M4). El plásmido pIB/V5-His posee el
promotor constitutivo OpIE2 río arriba de un sitio de múltiple clonado y posee resistencia al
antibiótico blasticidina S (Invitrogen) para su selección en células de insecto.
Figura M4. Vector utilizado para
obtener
las
construcciones
finales
empleadas en la transformación de
células Sf9.
54
Materiales y Métodos
12.1 Construcción del plásmido pXXLPOL
El vector con el gen poliedrina bajo el control de una región regulatoria de 2.640 pb río arriba del
promotor mínimo se obtuvo a partir del plásmido pXXLCAT. Para su construcción, la secuencia
codificante de poliedrina fue amplificada por PCR a partir del genoma de baculovirus utilizando
el oligonucleótido sentido POL-ATG, que incluye en su secuencia el codón de inicio de la
traducción, y el antisentido POL-STOP, que incluye el codón te terminación de la traducción de
poliedrina. La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando la enzima Gotaq y el siguiente ciclo de
temperaturas: 95 °C 5 min, (95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s) x 35 ciclos, 72 °C 7 min. Una banda
de 736 pb correspondiente al gen pol se purificó del gel de agarosa y se clonó en el vector pCR2.1 TOPO. Posteriormente, el vector TOPO-POL fue digerido con la enzima EcoRI para
desprender el gen de interés. Por otro lado, se digirió al vector pXXLCAT con las enzimas SpeI y
XhoI para eliminar del vector la secuencia del gen reportero CAT. Ambos fragmentos de tamaño
esperado (vector de 5.345 pb e inserto de 736 pb) fueron purificados del gel de agarosa, tratados
con el fragmento Klenow de la enzima ADN Pol II para rellenar los extremos cohesivos y ligados
molecularmente en una relación V:I de 3:1, previo tratamiento del vector con la enzima SAP. El
producto de ligación fue transformado en bacterias DH5α. La presencia del inserto en los clones
resistentes seleccionados se analizó por restricción y se confirmó por secuenciación.
12.2 Construcción del plásmido pCPOL
El plásmido pCPOL, equivalente a pCCAT, fue construido por inserción de poliedrina bajo el
control del promotor constitutivo OpIE2 de baculovirus en el vector pIB/V5-His. Brevemente, la
secuencia codificante de poliedrina fue amplificada por PCR a partir de ADN de baculovirus
salvaje
utilizando
el
oligonucleótido
sentido
POL-ATGk
(5’
TAAATATGGCGGATTATTCATACCGTCC 3´) que contiene, rodeando el codón de inicio de la
traducción (subrayado), el consenso de Kozak para la expresión a partir de promotores
baculovirales tempranos (en negrita) (Kozak, 1987); y el oligonucleótido antisentido POL-STOP.
La reacción se llevó a cabo con la enzima Gotaq y el siguiente ciclo de temperaturas: 95 °C 5 min,
(95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s) x 35 ciclos, 72 °C 7 min. La banda correspondiente a la
secuencia codificante de poliedrina fue escindida del gel, purificada y clonada en el vector pCR2.1 TOPO. Se digirieron los vectores TOPO-POLk y pIB/V5-His con la enzima EcoRI. El vector
receptor fue tratado con la enzima SAP y las reacciones se corrieron en un gel de agarosa 1 %.
55
Materiales y Métodos
Los fragmentos de tamaño esperado (760 pb de POL y 3.521 de pIB/V5-His) fueron purificados y
tanto vector como inserto fueron ligados molecularmente a 16 °C toda la noche. Con el producto
de ligación se transformaron bacterias competentes y se aislaron colonias resistentes a
ampicilina. Los clones positivos fueron reconocidos por restricción y posterior secuenciación.
13. Transfecciones
13.1 Construcción del vector pCGFP para el cálculo de la eficiencia de transfección
Para la construcción del vector pcGFP, la secuencia codificante de EGFP se obtuvo por digestión
del plásmido pCDNA-EGFP (previamente construido en el laboratorio) con las enzimas HindIII
y XbaI y se ligó al vector pIB/V5-His digerido con las mismas enzimas. Los clones positivos por
restricción con la enzima BamHI fueron confirmados por secuenciación.
13.2 Determinación de la eficiencia de transfección bajo distintas condiciones
Se probaron distintas condiciones de transfección en células crecidas en placas de 24 pocillos.
Brevemente, se sembraron 2 x 105 células por pocillo en medio Sf900II SFM sin agregado de
SFB y se dejaron adherir aproximadamente 1 h a temperatura ambiente. En cada pocillo se
ensayó una combinación distinta de ADN y Celfectina. En una placa de 96 pocillos se realizaron
las combinaciones que permitieron ensayar las siguientes cantidades de Celfectina: 1; 1,5; 2; 2,5;
3 y 3,5 μl y las siguientes cantidades de ADN: 0,2; 0,4; 0,8 y 1 μg. Las mezclas de transfección se
realizaron en un volumen final de 200 μl y se incubaron a temperatura ambiente por 15 min. Las
células de la placa de 24 pocillos fueron lavadas con medio fresco una vez y se les agregó el
volumen total de cada mezcla de tranfección. Se incubó la placa a 27 °C por 5 h y se les retiró el
medio de transfección para agregar medio Sf900II SFM fresco, suplementado con SFB.
Luego de 24 horas post transfección (hpt) se observó fluorescencia al microscopio óptico y se
determinó el número de células fluorescentes y de células totales por campo, para calcular el
porcentaje de células transfectadas en cada condición.
56
Materiales y Métodos
13.3 Transfecciones transitorias
Como primera aproximación al estudio de la expresión de poliedrina a partir de los plásmidos
obtenidos, se realizaron transfecciones transitorias de células Sf9. Para ello, se sembraron placas
de 6 pocillos con 7x105 células en cada uno y se transfectaron con: pCPOL o pXXLPOL, por
duplicado. La mezcla de transfección contenía 2,5 μg de plásmido y 5 μl de Celfectina para cada
pocillo, en un volumen final de 1 ml. Para el cálculo de la eficiencia de transfección se transfectó
1 pocillo de células con el vector pCGFP bajo las mismas condiciones. A las 4 hpt, se retiró el
medio de transfección y se infectó uno de los duplicados para cada plásmido con el baculovirus
AcGFPpol-, a una moi de 1, lo que permitió monitorear el curso de la infección mediante
visualización de fluorescencia al microscopio. A los 4 dpt las células fueron cosechadas para el
análisis de expresión del transgén.
13.4 Determinación de la concentración mínima inhibitoria del antibiótico de selección
Las construcciones derivadas del plásmido pIB/V5-His contienen la secuencia que confiere
resistencia al antibiótico blasticidina S que será utilizado como agente selectivo para obtener
líneas transformadas. Se ensayaron diferentes concentraciones de blasticidina en células Sf9 para
determinar la concentración mínima inhibitoria del mismo. Para esto se sembraron 2 x 105
células por pocillo en placas de 24, en medio Sf900II SFM-3 % SFB y se trataron con distintas
concentraciones del antibiótico (20, 40, 60, 80, 100 μg/ml). La viabilidad celular se evaluó en el
transcurso de 4 días mediante la técnica de exclusión del colorante azul tripán.
13.5 Transformación estable de células Sf9
Las transfecciones estables se realizaron en placas de 6 pocillos con 7 x 105 células Sf9 en cada
uno, utilizando 2,5 μg de plásmido y 5 μl de Celfectina por reacción. Los controles del
experimento consistieron en i) células mock transfectadas ii) células sin tratamiento iii) células
sólo infectadas. Paralelamente, se transfectaron células Sf9 con el plásmido pCGFP para el
cálculo de la eficiencia de transfección.
A las 48 hpt, se retiró el medio y se agregó medio nuevo con 60 μg/ml de blasticidina, para la
selección de las células establemente transformadas. Para establecer las líneas celulares
policlonales, las monocapas confluentes se transfirieron consecutivamente a soportes de mayor
57
Materiales y Métodos
tamaño (frascos de 25 y 75 cm2) en medio de cultivo Sf900II SFM y blasticidina en concentración
decreciente con los pasajes, hasta mantenerlas con una concentración constante de 10 μg/ml.
Una vez alcanzada esta concentración de antibiótico, parte de las células fueron congeladas en
N2 líquido y otra parte fue utilizada en posteriores ensayos de caracterización de la línea
establemente transformada.
14. Metodologías utilizadas con la línea estable que expresa poliedrina
14.1 Extracción de ADN de células Sf9
Para aislar ADN total de células de insecto se procedió a resuspender las células provenientes
de un frasco de 75 cm2 en 3 ml de buffer RSB-1 % NP40 (Tris-HCl pH 7,4 10 mM; NaCl 10 mM;
MgCl2 1,5 mM; NP40 1 %), pipeteando hasta que no queden grumos. Luego de incubar el lisado
por 30 min en hielo, se centrifugó por 30 s a 8.000 x g para precipitar los núcleos celulares. El
sobrenadante se descartó y se resuspendió el pellet en 1,5 ml de buffer de proteinasa K (200 mM
Tris-HCl pH 7,5; 25 mM EDTA; 300 mM NaCl; 2 % SDS; en agua). Se agregó 1,2 mg de la enzima
proteinasa K (60 μl de un stock de 20 mg/ml) y se incubó por 2 h a 50 °C.
Luego se extrajo la fracción soluble con un volumen de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
(25:24:1) y se centrifugó 3 min a 10.000 x g para recuperar la fase acuosa. El ADN se precipitó
con dos volúmenes de etanol, previa incubación a -70 °C al menos 30 min. El pellet se obtuvo por
centrifugación 20 min a 10.000 x g, se lavó con etanol 70 %, se secó y se resuspendió en 200 μl de
TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM) 0,1X con ARNasa A a una concentración final de 40
μg/ml.
14.2 PCR de muestras de ADN de la línea Sf9POL
Para corroborar que el transgén se insertó en el genoma de las células Sf9, se realizó una PCR a
partir de ADN de la línea Sf9POL utilizando los oligonucleótidos que permitieron amplificar la
secuencia completa de poliedrina de 737 pb de longitud (POL-ATG y POL-STOP). La reacción se
llevó a cabo utilizando la enzima Gotaq y con un ciclo de temperaturas como en el descrito en el
item 12.1
58
Materiales y Métodos
14.3 RT-PCR
La extracción de ARN total a partir de células Sf9 se realizó utilizando el kit comercial RNeasy
Mini Kit (QIAGEN), siguiendo el protocolo sugerido por el comerciante. En un primer paso el
ARN se sometió al a la acción de ADNasas, incubando 2 μg de ARN con 1 U de DNAsaI
(Invitrogen) en 1X final de buffer DNAsa. La reacción se incubó 15 min a temperatura ambiente y
se inactivó la enzima por agregado de 25 mM EDTA y calentamiento a 65 °C por 15 min.
En un segundo paso se realizó la transcripción reversa. Brevemente, al ARN tratado con
DNAsaI se lo desnaturalizó junto al oligonucleótido específico POL-STOP a 70 °C por 5 min, y
luego se lo mantuvo en hielo. La reacción de transcripción reversa se llevó a cabo por agregado
de 1X final de MMLV buffer, 0,1 M de DTT, 10 mM de una mezcla de los 4 deoxi-nucleótidos y 1
U de la enzima transcriptasa reversa (MMLV-RT, Promega). Esta reacción se incubó 1 h a 42 °C y
luego fue colocada en hielo.
El paso final fue la amplificación por PCR a partir de 3 μl de ADNc, como se describió en el
punto 12.1.
14.4 Inducción de la expresión de poliedrina por infección
A partir de la segunda semana de selección con blasticidina, se procedió a infectar las líneas
estables con el baculovirus AcGFPpol- o AcPOL- a una moi de 1. Se investigó la presencia de
cuerpos de oclusión al microscopio óptico a partir de las 48 h.
14.5 Cinética de expresión de poliedrina
Para estudiar la expresión de poliedrina, en placas de 6 pocillos se sembraron 2 x 106 células Sf9
por pocillo y en otras placas se sembró el mismo número de células de la línea Sf9POL por
pocillo. Las células se infectaron con los baculovirus AcMNPV wt y AcPOL-, respectivamente a
una moi de 10. Las cosechas se realizaron a las 6, 18, 24, 30, 42, 48, 54 y 66 hpi, por duplicado. Se
retiró el medio de cultivo y se resuspendieron las células en 1 ml de PBS pH 6,2. Luego de
centrifugar 2 min a 8.000 x g, las células se resuspendieron en 500 μl de H2O bidestilada y se
disolvieron los poliedros existentes en las muestras por agregado de 0,1 M de Na2CO3. Luego se
agregó un volumen adecuado de buffer cracking 4X (Tris-HCl 200 mM pH 6,8, glicerol 40 %, SDS
8 %, 2-mercaptoetanol 400 mM, azul de bromofenol 0,1 %). Los extractos se guardaron a -20 °C
59
Materiales y Métodos
hasta que fueron sometidos a SDS-PAGE y Western blot utilizando un anticuerpo policlonal de
pollo anti-poliedrina y como segundo anticuerpo un anti-pollo conjugado con fosfatasa alcalina.
14.6 Aislamiento de OB
Los cuerpos de oclusión a partir de la línea Sf9POL se obtuvieron infectando 1,2 x 107 células
totales en botellas de 175 cm2 con los baculovirus AcPOL- o AcGFPpol-. A los 5 dpi los poliedros
se purificaron según O´Reilly (O´Reilly et al., 1994). Brevemente, las células fueron sedimentadas
a 5.000 x g por 5 min y resuspendidas en 7 ml de SDS 0,5 %. El lisado fue centrifugado por 10
min a 5.000 x g y resuspendido en el mismo volumen de NaCl 0,5 M. Finalmente los poliedros
fueron sedimentados a 5.000 x g por 5 min, resuspendidos en 1 ml de H2O bidestilada y
contados en una cámara de Neubauer.
14.7 Muestras de ADN extraídas de poliedros
El ADN de los virus ocluidos se obtuvo según O´Reilly (O´Reilly et al., 1994). Los poliedros
fueron sedimentados y disueltos agregando Na2CO3 0,1 M a una concentración de 1 x 109
poliedros/ml por 30 min a temperatura ambiente. Se agregó Tris-HCl 1 M pH 7,6 a una
concentración final de 0,1M, se clarificó la suspensión a 8.000 x g por 10 min y se agregó EDTA y
SDS a concentraciones finales de 10 mM y 25 %, respectivamente. Finalmente, se agregó 500
μg/ml de proteinasa K y se dejó proceder la digestión 6 h a 37 °C. El ADN se purificó por
extracciones secuenciales con fenol, fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y cloroformo. Se
precipitó con etanol y se resuspendió en 100 μl de TE.
14.8 Determinación de la presencia de VP39 en los poliedros como prueba de oclusión de la
línea Sf9POL
Se tomaron 50 μl de solución de poliedros salvajes (wt) y de la línea Sf9POL (ambas soluciones
contenían el mismo número de poliedros) y se les colocó un volumen adecuado de buffer cracking
4X. La muestra se calentó a 65 °C por 10 min para desprender los baculovirus que pudieran
quedar adheridos a la superficie de los poliedros. A continuación se centrifugó, se separó el
sobrenadante (S) y se procedió a disolver la poliedrina de los pellets (P) con una solución alcalina
60
Materiales y Métodos
de Na2CO3 0,5 N. Las muestras S y las P se corrieron en geles de poliacrilamida 12 % y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa para ser enfrentadas con un anticuerpo monoclonal
anti-VP39. A continuación, se incubó con un segundo anticuerpo anti-ratón acoplado a fosfatasa
alcalina y se reveló con el reactivo NBT-BCIP.
14.9 Microscopía electrónica de transmisión
Las células se fijaron en glutaraldehido al 2,5 % en buffer Millonig pH 7,2 (Millonig, 1961), luego
se lavaron 3 veces con el mismo buffer, centrifugando a 2.000 x g cada vez. Luego, se realizó una
post fijación en tetróxido de osmio 2 % en agua durante 2 h, se lavaron 3 veces con agua
bidestilada por centrifugación a 2.000 x g y se empaquetaron en agar. Las muestras así
empaquetadas se deshidrataron en etanol de concentración ascendente (50, 70, 96, 100 %) y
acetona y se realizó una preinclusión en resina durante toda la noche (1 volumen de acetona y 1
volumen de resina Spurr). Al siguiente día, se realizó la inclusión en un taco de resina Spurr
pura, que polimeriza durante 72 h a 56 °C. El taco fue tallado y se realizaron cortes de 60-90 nm
con un ultramicrótomo. Los cortes se recogieron en grillas de cobre y se contrastaron con sales
pesadas (coloración de Uranilo-Reynold's), para luego observarse en el microscopio electrónico
de transmisión JEOL 1200EX-II del Servicio de Microscopía Electrónica del Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria (INTA), Castelar.
15. Bioensayos
15.1 Larvas
Las larvas de Rachiplusia nu fueron mantenidas en el Laboratorio de Cría de Insectos del
Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMyZA) del INTA-Castelar según métodos
clásicos para la especie. Se las alimentó con una dieta artificial, en base a porotos de soja y
vitaminas. Cuando las larvas alcanzaron el tercer estadio, fueron separadas en placas de 24
compartimientos. En la figura M5 se puede observar una placa de mantenimiento con larvas del
último estadio.
61
Materiales y Métodos
Figura M5. Larvas de Rachiplusia nu
mantenidas
en
placas
de
24
compartimientos, ingiriendo cubos de
dieta artificial.
15.2 Prueba de infectividad en larvas de Rachiplusia nu
15.2.1 Condiciones de infección
Se eligieron al azar 3 grupos de 6 larvas del tercer estadio de R. nu y se los infectó oralmente con
distintas fuentes de inóculo: poliedros obtenidos por infección de células con el baculovirus
recombinante AcGFPpol+, poliedros wt y poliedros obtenidos de la línea celular Sf9POL
infectada con el baculovirus AcGFPpol-. Luego de hambrear las larvas durante toda la noche, se
colocaron 1 x 105 poliedros totales por inóculo, embebidos en la dieta artificial. Las larvas se
colocaron separadas en placas de 6 pocillos, a 26 °C y en oscuridad. Día a día se las monitoreó
bajo lupa y microscopio óptico con luz UV, para observar fluorescencia de GFP como signo de
infección.
15.2.2 Medición de fluorescencia
Al día 4 post infección se realizaron extractos larvales para medición de fluorescencia.
Brevemente, se pesó cada larva en tubos de 1,5 ml y se le agregó dos volúmenes de buffer de lisis
con inhibidores de proteasas (DTT 5 mM, Tritón X-100 0,5 %, EDTA 1 mM, PMSF 10 mM y
leupeptina 10 g/ml en PBS pH 6,2). Se homogeneizó cada muestra y se clarificó dos veces por
centrifugación, 5 min a 10.000 x g. El sobrenadante, libre de cutícula y otros componentes de la
larva, fue separado. Se dosaron proteínas totales de cada muestra con el kit Protein Assay Kit
(Biorad) que se basa en el método de Bradford y se sembraron cantidades iguales de proteínas
en placas de 96 pocillos negras opacas. La lectura de la fluorescencia, a la longitud de onda que
corresponde a GFP, se realizó en el fluorómetro Spectra MAX Gemini EM (Molecular Devices).
62
Materiales y Métodos
15.2 Curvas de mortalidad
Se realizaron curvas de mortalidad en larvas de R. nu infectadas oralmente con poliedros de
distinta composición: AcPOLE44G, AcPOL- ocluido por la línea Sf9POL (AcPOL-/Sf9POL) y
AcMNPV wt. Para ello, se seleccionaron al azar larvas del tercer estadio. Se individualizaron en 8
placas de 6 compartimientos y se las mantuvo en ausencia de alimento por 6 h hasta el momento
de la infección. La dosis de inóculo ensayada fue 1 x 105 poliedros totales depositados sobre
cubos de alimento artificial de 3 mm2. Se infectaron 12 larvas por inóculo. A dos grupos de 6
larvas se le administró el mismo volumen de PBS como control negativo. Luego de la infección
las placas se incubaron a 26 °C y fueron monitoreadas diariamente para determinar el porcentaje
de muertes, hasta que todas las larvas inoculadas con PBS llegaron al estado de pupa.
63
Resultados
Resultados
Resultados
Este trabajo de tesis propone ampliar los conocimientos acerca de los requisitos necesarios para
situar el gen de poliedrina con sus regiones regulatorias en el genoma de células de insecto, de
manera de lograr que se produzca la síntesis de poliedrina luego de la infección con baculovirus
pol- y que los mismos se ocluyan en poliedros.
El Capítulo I describe los resultados obtenidos en el desarrollo de una línea celular de
insecto que expresa poliedrina. Se trata sobre la eficiencia de las regiones promotoras diseñadas
para guiar la transcripción del gen pol y ensayadas en transfecciones transitorias, la expresión y
capacidad de acople de poliedrina para conformar los cuerpos de oclusión y los bioensayos para
evaluar la eficiencia de la línea transformada para ocluir baculovirus infectivos.
En el Capítulo II se describe el efecto de una mutación puntual en el gen poliedrina que
produce poliedros morfológicamente diferentes a los que se observan por infección con un
baculovirus salvaje, posiblemente como consecuencia de un defecto en el ensamblaje de las
proteínas que conforman el cuerpo de oclusión.
64
Resultados- Capítulo I
Capítulo I
Oclusión de baculovirus pol- por trans-complementación de poliedrina
en una línea Sf9 establemente transformada
1. Construcción de los baculovirus recombinantes utilizados en este trabajo
1.1 Obtención del baculovirus AcGFPpolEl baculovirus AcGFPpol- fue construido por reemplazo alélico de poliedrina por el gen de la
proteína verde fluorescente (GFP) a fin de facilitar el seguimiento del proceso de infección,
mediante la visualización de la fluorescencia emitida por GFP cuando es irradiada por fotones
de una longitud de onda de 450-490 nm. En cultivos in vitro de células Sf9, la infección con el
baculovirus AcGFPpol- genera el efecto citopático característico de los baculovirus occ- visible a
luz blanca y al ser irradiado con luz azul, el citoplasma de las células fluoresce de color verde
intenso. Este baculovirus fue empleado no sólo en el seguimiento de la infección de líneas
celulares, sino también para la evaluación de la infección de larvas inoculadas por vía oral.
1.1.1 Construcción del vector de transferencia pFastBacGFP
Para la construcción del vector de transferencia pFastBacGFP empleado en la obtención del
baculovirus AcGFPpol- por la metodología Bac-to-Bac, la secuencia del gen GFP de 716 pb se
clonó en el vector pFastBac-1 según se describe en Materiales y Métodos. La presencia de GFP en
varios clones aislados se analizó por digestión enzimática y posterior secuenciación (no
mostrado). La figura R1 muestra el vector de transferencia pFastBac-GFP.
Tn7L
Origen f1
SV40 pA
Promotor bla
XbaI
Amp(R)
GFP
Figura R1: Esquema del vector de
pFastbac-GFP
XbaI
5499 bp
Promotor POL
transferencia
construido
para
la
obtención del baculovirus AcGFPpol-.
Origen pUC
Promotor Pc
Gm(R)
Tn7R
65
Resultados- Capítulo I
1.1.2 Obtención del baculovirus recombinante
Para obtener el bácmido recombinante que porta el gen GFP bajo la regulación del promotor de
poliedrina, se transformaron bacterias E. coli DH10Bac con el plásmido de transferencia
pFastBac-GFP. Se seleccionaron bacterias resistentes a los antibióticos kanamicina, tetraciclina y
gentamicina y un número discreto de colonias blancas se cultivó en medio líquido con los tres
antibióticos mencionados.
Los bácmidos de aproximadamente 140 kpb fueron extraídos y la presencia del cassette
transpuesto se confirmó mediante PCR con oligonucleótidos específicos amplificándose en el
caso de los bácmidos recombinantes una banda de aproximadamente 3.300 pb en contraste con
una de 300 pb correspondiente al producto de amplificación de los bácmidos que no
recombinaron (Figura R2).
Una vez confirmada la identidad del bácmido recombinante, se procedió a la transfección de
células Sf9 como fue descrito en Materiales y Métodos. A los 5 días post-transfección (dpt) el
sobrenadante de transfección se separó y con éste se infectaron nuevas células en botellas de 75
cm2, para la generación de un stock viral de trabajo. Al microscopio, las células infectadas con el
baculovirus AcGFPpol- no presentaron poliedros y fluorescieron. El inóculo fue titulado por la
técnica de dilución a punto final, rindiendo un título de 3,8 x 107 ufp/ml.
M
-
B
B/A A
Figura R2: Análisis por PCR de los bácmidos
3054
~3300 pb
2036
recombinantes aislados para la construcción
del
1636
baculovirus
AcGFPpol-.
(-),
control
negativo de la reacción; B, colonia blanca; B/A,
506
~300 pb
colonia “mixta”; A, colonia azul.
1.2 Obtención del baculovirus AcGFPpol+
Como control positivo para la infección oral de larvas se construyó un baculovirus recombinante
capaz de formar cuerpos de oclusión (occ+) que transporta el gen GFP bajo la regulación del
66
Resultados- Capítulo I
promotor de poliedrina y conserva el gen poliedrina bajo la regulación de otro promotor tardío,
p10.
El baculovirus AcGFPpol+ fue construido según la técnica desarrollada por Je y
colaboradores (Je et al., 2001) que consiste en la cotransfección de un plásmido de transferencia
con ADN de un bácmido portador del genoma baculoviral, denominado bAcGOZA, con
capacidad de replicación en bacterias E. coli.
1.2.1 Construcción del vector de transferencia pBacPAK-GFP
Para la construcción del vector de transferencia se obtuvo la secuencia de GFP a partir del vector
pGEMT-GFP y se insertó en el vector pBacPak8 bajo el control del promotor de poliedrina,
manteniendo un copia de la secuencia codificante de poliedrina bajo el promotor p10. El análisis
de la integridad del vector pBacPAK-GFP se realizó por PCR utilizando los oligonucléotidos
PHEcoRV y GFPrev, que amplifican desde el sitio EcoRV del promotor de poliedrina hasta el
final del gen GFP, esperándose una banda de 800 pb, aproximadamente (Figura R3).
Seq AcNPV
Ori
+
-
M
Promotor POL
Amp(R)
pBacPAK-GFP
6354 pb
GFP
~800 pb
850
650
Origen f1
6xHis
Señal PolyA
ORF 1629
Figura R3: Esquema del vector de transferencia pBacPAK-GFP utilizado en la construcción del
baculovirus recombinante AcGFPpol+. A la derecha se muestra el análisis por PCR con los
oligonucleótidos PHEcoRV y GFPrev que confirma la identidad del vector.
1.2.2 Construcción del baculovirus recombinante
El baculovirus AcGFPpol+ se obtuvo a partir de la cotransfección de células Sf9 con el plásmido
pBacPAK-GFP y ADN del bácmido bAcGOZA. Este bácmido fue amplificado en bacterias E. coli
67
Resultados- Capítulo I
y purificado a partir de las mismas. Luego de 5 dpt fue posible observar efecto citopático en las
células, caracterizado por la presencia de cuerpos de oclusión. Con el sobrenadante de
transfección se infectaron nuevas células en botellas de 75 cm2. Se realizaron dos pasajes del
virus en células hasta obtener el stock de trabajo, el cual fue titulado por dilución a punto final
rindiendo un título de 2,2 x 10 7 ufp/ml y fue utilizado en subsiguientes ensayos. En la figura R4
se esquematiza el genoma del baculovirus AcGFPpol+ obtenido mediante esta metodología.
Promotor P10
Promotor POL
Seq AcNPV
POLIEDRINA
Señ al Po lyA
GFP
ORF 1629
Figura R4: Esquema del baculovirus recombinante occ+, AcGFPpol+. Este baculovirus fue obtenido
por Obtención
cotransfección
células Sf9
con el bácmido bAcGOZA y el vector pBAcPAK-GFP.
1.2.2
deldebácmido
recombinante
1.3 Obtención del baculovirus AcPOLCon el objetivo de obtener un baculovirus que no pueda recombinar con secuencias del gen
poliedrina, se construyó el baculovirus AcPOL- mediante la técnica BaculoGold. El diseño de
este baculovirus se basó en la eliminación de todas las secuencias remanentes de poliedrina en el
vector de transferencia.
1.3.1 Construcción del vector de transferencia pVL-1629
El plásmido pVL-1629 se construyó a partir del plásmido pVL1393, del cual se eliminaron por
digestión 690 pb que incluyen la secuencia de poliedrina a partir del nucleótido (nt) 174. Debido
a que esta metodología elimina una región del ORF 1629 esencial para la viabilidad de los
baculovirus, se amplificó por PCR el fragmento faltante y se lo subclonó en el vector pVL1393
delecionado. La correcta inserción del fragmento del ORF 1629 en el vector pVL1393 se confirmó
68
Resultados- Capítulo I
por restricción con la enzima HindIII. El fragmento del ORF 1629 interrumpe un sitio de corte de
esta enzima en el vector pVL1393, esperándose un patrón de tres bandas en lugar de las cuatro
que se observan por digestión del vector solo. El producto final de la estrategia de clonado y el
ColE ori
in d
29 H
l-16
pV
Amp(R)
pV
L13
93 H
in d
II I
II I
patrón de restricción que confirma la identidad del vector pVL-1629 se ilustran en la figura R5.
M
4494 pb
5000
3422 pb
3000
pVL-1629
2000
1650
9029 bp
1036 pb
1000
850
650
500
Promotor POL
ORF 1629
200
F1629
Figura R5: Esquema del vector de transferencia pVL-1629 utilizado en la construcción del baculovirus
AcPOL-. A la derecha se muestra el análisis por restricción con la enzima HindIII.
1.3.2 Obtención del baculovirus recombinante por el método BaculoGold
El baculovirus AcPOL- se obtuvo por cotransfección de células Sf9 con ADN lineal de
baculovirus y el vector de transferencia pVL-1629.
Luego de 5 dpt, habiéndose observado efecto citopático en las células, se recolectó el
sobrenadante de transfección, se clarificó y se realizó una dilución al décimo con la que se
infectó nuevamente células Sf9 en monocapa, para obtener el stock viral de trabajo. El mismo fue
titulado por el método de placas de lisis rindiendo un título de 1,5 x 107 ufp/ml y conservado a 4
°C para utilizarse en ensayos posteriores.
69
Resultados- Capítulo I
2. Determinación de los elementos regulatorios mínimos necesarios río arriba
de poliedrina: estudio de la expresión transitoria de un gen reportero
La regulación transcripcional del gen muy tardío poliedrina (POL) en AcMNPV es un proceso
complejo que aún no fue desentrañado con exactitud. Como se describió en el apartado 1.4 de la
Introducción, se conoce que este proceso involucra factores tanto del baculovirus como de la
célula hospedadora.
Con el objetivo de definir las regiones regulatorias necesarias para una óptima expresión de
poliedrina, se diseñaron vectores con distintas regiones del promotor POL regulando el gen
reportero cloranfenicol acetil transferasa (CAT) para ser utilizados en ensayos de expresión
transitoria. Las construcciones se obtuvieron a partir del plásmido comercial pIB/V5-His/CAT
(Invitrogen) que lleva el gen reportero bajo la regulación del promotor temprano y constitutivo
baculoviral OpIE2. Las modificaciones consistieron en el reemplazo del promotor OpIE2 por las
distintas regiones regulatorias de poliedrina a ensayar.
2.1 Construcción de los plásmidos reporteros
2.1.1 Obtención del plásmido pLCAT
El vector pLCAT, de 4.026 pb, se obtuvo sustituyendo el promotor constitutivo OpIE2 del
plásmido pIB/V5-His/CAT por el promotor de poliedrina delimitado por el sitio NaeI, 222 pb río
arriba de la región promotora básica (L por fragmento largo del promotor), con la estrategia
ba
I
descrita en Materiales y Métodos. El vector se esquematiza en la figura R6.
Ampicilina(R)
M
CAT
4052 bp
XbaI (1178)
Blasticidina(R)
V5
650
Esquema
vector
reportero
222
pb
río
arriba de la secuencia
promotora mínima. A
1000
850
R6.
pLCAT,
4000
3000
pLCAT
Figura
del
p
XbaI (396)
LC
A
T/
X
Promotor L
782 pb
la derecha se muestra el
6xHis
OpIE2 PolyA
Promotor OpIE1
pUC Ori
análisis por restricción
con la enzima XbaI.
70
Resultados- Capítulo I
2.1.2 Obtención del plásmido pXLCAT
Para la construcción del vector pXLCAT de 4.726 pb, se modificó el plásmido pLCAT agregándole
una secuencia regulatoria adicional de 700 nucleótidos río arriba del promotor de poliedrina.
Esta secuencia contiene una región cuyo motivo CACCC se une a la proteína Sp1 de la célula
hospedadora denominada AcSp. La estrategia de construcción se describe en Materiales y
/B
sp
HI
Métodos y sus principales características se detalla en la figura R7.
p
XL C
Región XL
Ampicilina(R)
AT
BspHI (1)
M
BspHI (706)
Promotor L
pXLCAT
4751 bp
Blasticidina(R)
CAT
Promotor OpIE1
V5
6xHis
pUC Ori
OpIE2 PolyA
Figura R7: Esquema del vector reportero pXLCAT con el promotor de poliedrina de 1.129 pb. Este
vector posee 700 pb de una secuencia regulatoria río arriba del pL. A la derecha se muestra el análisis
por restricción con la enzima BspHI.
2.1.3 Obtención del plásmido pSCAT
El vector con el promotor mínimo de poliedrina fue obtenido a partir del plásmido pLCAT, por
restricciones secuenciales. El vector pSCAT (S por short, corto en inglés) posee la región
promotora básica de 95 pb, delimitada en el genoma por el sitio EcoRV. La restricción del
plásmido pLCAT con las enzimas BspHI y EcoRV permitió eliminar las secuencias río arriba de
ese promotor mínimo. Su construcción se detalla en Materiales y Métodos y las características
más salientes se detallan en la figura R8.
71
I/X
ba
I
glI
I/X
ba
I
Resultados- Capítulo I
XbaI
3815 bp
6xHis
Blasticidina(R)
OpIE2 PolyA
2000
TB
1650
1849
1000
1217
850
738
650
Promotor EM7
p
EcoRV
pSCAT
BglII
M
CAT
p
Ampicilina(R)
L CA
BglII
S CA
TB
glI
ex EcoRV
Promotor S
pUC Ori
Promotor OpIE1
Figura R8: Esquema del vector reportero pSCAT, con el promotor mínimo de poliedrina de 95 pb. A la
derecha se muestra el análisis de restricción con las enzimas BglII y XbaI que confirma la identidad del
vector.
2.1.4 Obtención del vector pXXLCAT
Para construir el vector con la región regulatoria más extensa río arriba del promotor mínimo se
empleó como base el plásmido pLCAT.
La secuencia de hr1 de 881 pb se encuentra en el genoma a una distancia aproximada de 5
kpb, por lo que fue necesario colocarla a menor distancia del promotor de poliedrina. Para ello
se obtuvo dicha región por PCR a partir del genoma de baculovirus AcMNPV y se la insertó en
el plásmido pVL1393. El plásmido obtenido, denominado pVL-hr1, fue utilizado como molde
para la amplificación por PCR de la región regulatoria de 2.418 pb. El plásmido pXXLCAT de
6.448 pb, que porta una región regulatoria de 2.640 pb río arriba del promotor mínimo de
poliedrina, se originó por inserción en el plásmido pLCAT. Un esquema simplificado de los
vectores obtenidos se presenta en la figura R9.
72
Resultados- Capítulo I
hr1
1537 pb
pVL-hr1
Promotor POL
(10489 bp)
Amp(R)
ORF 1629
ColE ori
M (-) 1 2 3
5000
PCR hr1FOR/ XXLREV
hr1
BspHI
2000
1650
XXL
1537 pb
Fragmento XXL
(2418 pb)
Ampicilina(R)
Promotor XXL
Blasticidina(R)
pXXLCAT
Promotor EM7
7144
bp
6448 pb
Promotor OpIE1
pUC Ori
OpIE2 PolyA
6xHis
CAT
V5
Figura R9. Esquema que ilustra la obtención de la región XXL. Esta secuencia se obtuvo a partir del
vector pVL-hr1. Se muestra a continuación el vector reportero final pXXLCAT, que porta una región
regulatoria de 2.640 pb río arriba del promotor mínimo de poliedrina.
73
Resultados- Capítulo I
2.2 Optimización de las condiciones de transfección
Una vez obtenidos los vectores reporteros a ser utilizados en ensayos de transfección transitoria
de células Sf9, fue necesario establecer las condiciones óptimas de transfección. Para ello, en
primer lugar se construyó el plásmido reportero pCGFP para el cálculo de la eficiencia de
transfección, según se detalla en Materiales y Métodos y se representa en la figura R10.
Promotor OpIE2
Ampicilina (R)
M
HindIII (558)
pCGFP
XbaI
XbaI (612)
4000
3000
EGFP
pCGFP
2000
1650
4252 bp
Basticidina (R)
XbaI (1337)
XbaI (1369)
V5
1000
850
GFP
650
6xHis
Promotor OpIE1
Origen pUC
Figura R10. Esquema de clonado para la obtención del plásmido pCGFP utilizado para el cálculo de la
eficiencia de transfección de células Sf9. A la derecha se muestra el análisis por restricción con la
enzima XbaI.
Determinación de la eficiencia de transfección bajo distintas condiciones
Se ensayaron distintas combinaciones de Celfectina: 1; 1,5; 2; 2,5; 3 y 3,5 μl y las siguientes
cantidades de ADN: 0,2; 0,4; 0,8 y 1 μg. Luego de 24 horas de transfección se observó
fluorescencia al microscopio óptico y se determinó el número de células totales y de células
fluorescentes por campo, para calcular el porcentaje de células transfectadas en cada condición.
De esta manera, se determinó que la máxima eficiencia obtenida fue de 32 % de células
transfectadas (fluorescentes) en la condición óptima definida por 2,5 μl de Celfectina y 0,8 μg de
ADN por pocillo. Estas condiciones fueron utilizadas en todas los experimentos de transfección.
74
Resultados- Capítulo I
2.3 Ensayo de expresión transitoria del gen reportero CAT regulado por distintas
regiones promotoras de poliedrina
2.3.1 Transfecciones e infecciones para la expresión transitoria del gen reportero
Se transfectaron células Sf9 con el objeto de comparar la actividad de CAT alcanzada con cada
una de las construcciones reporteras entre el 1° y el 7° dpt.
Se emplearon los vectores pSCAT, pLCAT, pXLCAT, pXXLCAT y pcCAT. Debido a que el
promotor de poliedrina es activado por factores virales tardíos, 4 horas más tarde, parte de las
células transfectadas con cada construcción fueron infectadas con el baculovirus AcPOL- a una
moi de 1. En una placa separada se incluyeron los siguientes controles: i) células sin transfectar
ni infectar; ii) células mock transfectadas (transfectadas utilizando Celfectina sin ADN); iii)
células mock transfectadas e infectadas; iv) células sólo infectadas. El ensayo se llevó a cabo por
triplicado.
2.3.2 Ensayo de actividad de CAT
Antes de medir las muestras y para determinar la cinética enzimática de CAT en este sistema, se
realizó una curva de actividad utilizando la enzima en cinco concentraciones distintas, partiendo
de una concentración inicial máxima de 0,1 U/μl. La figura R11 muestra la curva de calibración,
con la cual se determinó que la actividad máxima registrada fue entre 180.000 y 200.000 cuentas
por minuto (cpm). Se utilizaron diluciones ¼ de los extractos para aproximar los valores
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Figura R11. Curva de calibración de
0,1
T
CA
1/
4
T
CA
6
CA
T
1/
1
4
1/
6
T
CA
/2
54
T1
CA
an
c
o
actividad de CAT.
Bl
Cuentas por minuto 14C (cpm)
máximos medibles a ese rango y evitar la saturación enzimática y subestimación de datos.
Diluciones CAT
75
Resultados- Capítulo I
La expresión y actividad de la enzima CAT se determinó cuantitativamente a través de la
combinación de los extractos celulares lisados con los sustratos 14C-cloranfenicol y n-butiril CoA.
Se les extrajo la fracción acetilada (n-butiril-cloranfenicol) y se midieron en el contador de
centelleo líquido. La actividad de CAT obtenida en cpm fueron promediados para los triplicados
de cada muestra y se calculó el desvío estándar para cada una. El resultado para todos los
plásmidos medidos se muestra en la figura R12.
Los resultados mostraron que en ausencia de infección sólo con el promotor constitutivo se
registró actividad del gen reportero. En células transfectadas con las construcciones de los
promotores inducibles, pXXLCAT mostró los niveles más altos de expresión de CAT después de
la infección con baculovirus, que alcanzó un máximo a los 3 dpt y se mantuvo constante a lo
largo de 7 días. Dichos niveles fueron comparables a los que se observaron para el plásmido con
el promotor constitutivo, pCCAT, en ausencia de infección. El resto de los vectores con
promotores inducibles mostraron niveles de expresión menores, que alcanzaron un nivel
máximo de actividad de CAT al día 6 post transfección y luego decayeron.
14
Actividad CAT (cpm C)
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
2
4
6
Días post transfección (dpt)
8
pXXL +
pC +
pC pXL +
pL +
pS +
pXXL pXL pL pS Sf9 +
Mock +
Mock Sf9 s/t
(-)
Figura R12. Actividad transitoria de CAT registrada desde el 1° al 7° dpt para los plásmidos
reporteros con distintas regiones regulatorias de poliedrina. Los signos + y - indican infección con el
baculovirus AcPOL- a las 4 hpt o ausencia de la misma, respectivamente.
76
Resultados- Capítulo I
A pesar de que a los 6 dpt los niveles alcanzados con las construcciones pXLCAT y pXXLCAT
parecen ser similares, al 7º dpt la actividad de CAT para la construcción pXLCAT decae
abruptamente y la de pXXLCAT se mantiene constante. La figura R13 muestra la actividad
relativa de CAT a los 7 dpt para cada una de las muestras ensayadas.
(-)
S/T S/I
Mock
Mock +
Sf9 +
Muestras
pC
pC +
pS
pS +
pL
pL +
pXL
pXL +
pXXL
pXXL +
0
50000
100000
150000
200000
Actividad de CAT relativa (cpm 14C) al 7º dpt
Figura R13. Actividad transitoria de CAT registrada a los 7 dpt para los plásmidos reporteros con
distintas regiones regulatorias de poliedrina. Los signos + indican infección con el baculovirus occ- a
las 4 hpt. Las actividades alcanzadas en presencia de infección se representan con barras negras.
77
Resultados- Capítulo I
Los niveles de expresión alcanzados por la construcción pXXLCAT luego de la infección se
mantienen cercanos a los obtenidos con el promotor constitutivo en ausencia de infección (barra
gris), incluso luego de una semana de transfección, mientras que con las demás construcciones
no fue posible alcanzar ni mantener dichos niveles. Luego de la infección, las células
transfectadas con la construcción llevando el promotor constitutivo mostraron un descenso en
los niveles de expresión del gen reportero, probablemente debido al shut-down que ocurre en la
célula durante la infección viral.
3. Obtención de una línea celular Sf9 establemente transformada con el gen
poliedrina
En base a los resultados obtenidos, se decidió utilizar la región regulatoria XXL de 2.640 pares de
bases río arriba del promotor mínimo de poliedrina para guiar la transcripción de poliedrina en
el desarrollo de una línea Sf9 establemente transformada. Con ese fin, se construyó el vector
pXXLPOL que porta la secuencia codificante de poliedrina bajo la región regulatoria XXL y como
control se construyó un vector que contiene el gen poliedrina bajo la regulación del promotor
constitutivo OpIE2.
3.1 Construcción de los vectores pXXLPOL y pCPOL
El vector con el gen poliedrina bajo el control de la región regulatoria XXL se obtuvo utilizando
el plásmido pXXLCAT como base. Para su construcción, la secuencia codificante de poliedrina (nt
4.515–5.261 de AcMNPV) fue insertada en el vector pXXLCAT en reemplazo de la secuencia de
CAT para obtener el vector pXXLPOL. El plásmido pCPOL fue construido por clonado de la
secuencia de poliedrina bajo el control del promotor constitutivo en el vector pIB/V5-his. Para
ello se tuvo en cuenta el agregado en la secuencia del consenso óptimo para la expresión a partir
de promotores baculovirales tempranos rodeando el inicio de la traducción, según se detalla en
Materiales y Métodos. Los vectores finales y su análisis por restricción se representan en la
figura R14.
78
Resultados- Capítulo I
pXXLPOL SacI/BamHI
Ampicilina(R)
1
*
2
*
3
M
5000
Blasticidina(R)
Promotor EM7
Promotor XXL
pXXLPOL
Promotor OpIE1
2000
1650
6556 bp
1000
850
~ 560
650
500
~ 250
pUC Ori
200
OpIE2 PolyA
BamHI
Bam
HI
6xHis
V5
Sac
II
SacI
BamHI
POL
BamHI
* clones positivos
Promotor OpIE2
Ampicilina (R)
M
KpnI (568)
pCPOL
KpnI
KpnI
4000
pCPOL
POL
2000
1650
4258 bp
KpnI
Basticidina (R)
3000
KpnI (1236)
1000
V5
850
6xHis
650
POL
Promotor OpIE1
Origen pUC
Figura R14. Esquema de los plásmidos pXXLPOL y pCPOL utilizados para transfectar establemente
células Sf9. A la derecha de cada uno se muestra el análisis por restricción con las enzimas específicas.
3.2 Transfecciones transitorias
Con el objeto de evaluar, en primer lugar, si la proteína poliedrina codificada fuera del genoma
viral es capaz de expresarse en células Sf9 infectadas, se llevaron a cabo experimentos de
transfección transitoria del plásmido pXXLPOL e infección con el baculovirus AcGFPpol-.
Para ello, se utilizaron células en monocapa que se transfectaron con pCPOL o pXXLPOL
utilizando Celfectina de acuerdo a las proporciones óptimas ya determinadas. Los controles
consistieron en la mock transfección de las células utilizando la misma cantidad de Celfectina
79
Resultados- Capítulo I
pero sin ADN y células sin transfectar. Para el cálculo de la eficiencia de transfección se
transfectó un pocillo de células con el vector pCGFP bajo las mismas condiciones ensayadas para
los plásmidos con poliedrina. Este control se utilizó en cada evento de transfección realizado,
dando valores de eficiencias de transfección de entre 16 % y 35 % (Figura R15 A1). A las 4 hpt se
infectó uno de los duplicados para cada plásmido con el baculovirus AcGFPpol-, monitoreando
diariamente el curso de la infección mediante visualización de fluorescencia al microscopio
óptico.
Al 5 dpt se registraron fotografías de las células al microscopio óptico bajo luz blanca y de
fluorescencia. Como se observa en la figura R15 A2 y 3, los controles sin infección no
presentaron estructuras similares a poliedros ni modificaciones en la forma o en el crecimiento
celular con respecto a las células mock transfectadas, indicando que la mera transfección de los
plásmidos que expresan poliedrina no genera cuerpos de oclusión ni ningún agregado
intracelular que sugiera la acumulación de poliedrina. Al ser infectadas con el baculovirus occque expresa GFP, fue posible observar la presencia de estructuras poliédricas en los núcleos de
las células transfectadas con el plásmido pXXLPOL en las que coincidieron la transfección e
infección identificada por flurescencia (Figura R15 C8 y 9). En las células transfectadas con el
plásmido pCPOL no se observaron modificaciones más allá del efecto citopático típico tras la
infección con baculovirus (Figura R15 B5 y 6).
80
Resultados- Capítulo I
A
B
C
I
Figura R15. Visualización al microscopio de células Sf9 transfectadas transitoriamente al 5 dpt. A)
Controles. 1) Células transfectadas con el plásmido pCGFP para el cálculo de la eficiencia de
transfección; 2) Células mock transfectadas; 3) Células sin tratamiento. B) Células transfectadas con el
plásmido pCPOL 4) en ausencia de infección; 5) infectadas con el baculovirus AcGFPpol- a moi=1
visualizadas bajo luz blanca. 6) El mismo campo que 5 pero visualizado bajo luz azul. C) Células
transfectadas con el vector pXXLPOL 7) en ausencia de infección. 8) infectadas con el baculovirus
AcGFPpol- a moi=1 visualizadas bajo luz blanca. 9) El mismo campo que 8 pero visualizado bajo luz
azul. La flecha muestra las estructuras poliédricas refringentes en el interior de los núcleos. I) Detalle
de células transfectadas con el plásmido pXXLPOL e infectadas que presentaron estructuras poliédricas
en su interior.
81
Resultados- Capítulo I
Para corroborar que las estructuras poliédricas observadas dentro de las células transfectadas
con pXXLPOL e infectadas con baculovirus estaban conformadas por la proteína poliedrina, se
realizaron ensayos de Western blot con extractos de células transfectadas con ambas
construcciones e infectadas. En cada caso se realizaron extractos celulares y como control se
utilizó un extracto de células infectadas con AcMNPV salvaje. Las muestras se resolvieron en
geles de poliacrilamida 12 % y se reveló la presencia de poliedrina por ensayos de Western blot
con un suero policlonal anti-poliedrina. El resultado se muestra en la figura R16.
pCPOL
-
+
pXXLPOL
-
+
Sf9
wt
Poliedrina
Figura R16.
Detección de poliedrina en muestras de células transfectadas transitoriamente.
Extractos de células transfectadas con los plásmidos PCPOL y pXXLPOL fueron enfrentadas a un
anticuerpo anti-poliedrina. Los signos + y – indican infección con baculovirus pol- o ausencia de la
misma, respectivamente.
Fue posible detectar una banda nítida de movilidad electroforética correspondiente a poliedrina
únicamente en el caso de las células transfectadas con pXXLPOL e infectadas con el baculovirus
pol-. De esta manera se confirmó que existe expresión de poliedrina a partir de un plásmido,
inducida por infección viral. Esta observación sugiere que las estructuras refringentes
observadas en el núcleo de algunas células están conformadas por poliedrina. No se detectó
expresión de poliedrina en las células transfectadas con la construcción de promotor
constitutivo.
82
Resultados- Capítulo I
3.3 Establecimiento de líneas transformadas con poliedrina
Una vez confirmada la expresión transitoria de poliedrina por el plásmido pXXLPOL, se continuó
con la transformación estable de células Sf9 con la misma construcción y la caracterización de
estas líneas. Adicionalmente, se transformaron células establemente con la construcción pCPOL
como control.
3.3.1 Determinación de la concentración mínima inhibitoria del antibiótico de selección
Para determinar la concentración mínima inhibitoria del antibiótico empleado como agente
selectivo y elegir la concentración a utilizar en la selección, se ensayaron diferentes
concentraciones de blasticidina S en células Sf9. Las células se trataron con 20, 40, 60, 80 y 100
μg/ml de blasticidina y la viabilidad celular se evaluó en el transcurso de 4 días mediante la
técnica de exclusión del colorante azul tripán. La figura R17 muestra la mortalidad de las células
a las distintas concentraciones de antibiótico.
La concentración de 60 μg/ml de antibiótico resultó la mínima que presentó más del 50 % de
mortalidad celular al segundo día post tratamiento y que alcanzó un 100 % al cuarto día. Así, se
determinó que esta concentración sería la utilizada para la primera selección de las líneas
120
100
muertas)
Muerte celular (% células
transfectadas.
Dia 1
80
Dia 2
60
Dia 3
40
Dia 4
20
0
0
20
40
60
80
100
Concentración de blasticidina (ug/ml)
Figura R17. Mortalidad celular frente a blasticidina. Se grafican los porcentajes de mortalidad frente
a distintas concentraciones del antibiótico utilizado en células Sf9 hasta el cuarto día post tratamiento.
La flecha muestra la concentración que mató más del 50 % de las células al 2° día post tratamiento.
83
Resultados- Capítulo I
3.3.2 Transformación estable de células Sf9
Una vez confirmada la producción de estructuras poliédricas empleando la construcción
pXXLPOL en ensayos de expresión transitoria, se utilizó el plásmido pXXLPOL para transformar
células Sf9 de manera estable. En el mismo evento también se transfectaron células con la
construcción PCPOL. Los controles del experimento consistieron en i) células mock transfectadas
ii) células sin tratamiento iii) células sólo infectadas. Paralelamente se transfectaron células Sf9
con el plásmido pCGFP para el cálculo de la eficiencia de transfección.
A las 48 hpt, se retiró el medio y se agregó medio nuevo conteniendo 60 μg/ml de
blasticidina para la selección de las líneas celulares establemente transformadas. Para establecer
las líneas celulares policlonales (Sf9POL y pCPOL), las monocapas confluentes se transfirieron
consecutivamente a soportes de mayor tamaño en medio de cultivo y blasticidina en
concentración decreciente con los pasajes, hasta mantenerlas con una concentración constante de
10 μg/ml.
Para confirmar la presencia del gen poliedrina en el genoma de las líneas transformadas, se
realizó un ensayo de PCR utilizando los oligonucleótidos POL-ATG y POL-STOP a partir de
ADN genómico extraído de las líneas obtenidas. La figura R18 muestra la amplificación de un
producto del tamaño esperado para poliedrina a partir de los genomas de células de ambas
líneas. El control positivo corresponde a la misma reacción utilizando como templado al
plásmido pGEMT-POL, y el negativo a ADN de células Sf9 sin transfectar.
PXXL
PC
-
+
M
6108
Figura R18. Detección del gen poliedrina
3054
en el genoma de las líneas establemente
2036
1636
transformadas. Se observa la presencia de un
850
producto
de
amplificación
del
tamaño
esperado para poliedrina a partir de ADN
POL
506
genómico de las líneas estables Sf9POL y
pCPOL.
84
Resultados- Capítulo I
Para determinar la transcripción del gen poliedrina en las líneas celulares, se realizó un ensayo
de RT-PCR utilizando el oligonucleótido específico POL-STOP para la retrotranscripción. La
reacción se llevó a cabo en presencia y en ausencia de la enzima DNAsaI. Como control se
realizó la PCR (sin retrotranscripción) sobre las muestras de ARN, para detectar una posible
amplificación debida a la presencia de ADN contaminante. El resultado se muestra en la figura
R19. Se demostró la presencia de ARNm de poliedrina sólo en la línea Sf9POL infectada con el
baculovirus AcPOL-.
RT-PCR
pCPOL
PCR
ARN
Sf9POL
- +
pCPOL
Sf9POL
POL
AcPOL-
-
+
-
+
-
+
-
+
DNAsa I
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
Figura R19. Ensayo de RT-PCR para evaluar la existencia de ARN mensajero de poliedrina en la
línea estable. Se observa la presencia de ARNm de poliedrina sólo en el caso de la línea Sf9POL
infectada con el baculovirus AcPOL- .
A partir de la segunda semana de selección, se evaluó la capacidad de la línea estable Sf9POL de
expresar poliedrina luego de la infección con un baculovirus de genotipo pol-. Con el objeto de
descartar la posibilidad de que el baculovirus AcGFPpol- adquiera un fenotipo occ+ por
recombinación homóloga con las secuencias de poliedrina en el genoma celular, se construyó el
baculovirus AcPOL- que no posee ninguna secuencia homóloga a este gen (ver punto 1.3 de
Resultados). La infección de la línea Sf9POL se llevó a cabo a una moi de 1 y a partir de los 3 dpt
se visualizaron cuerpos de oclusión, como lo muestra la figura R20.
85
Resultados- Capítulo I
A
C
B
D
E
Figura R20. Fotografías de células Sf9 establemente transformadas con la construcción pXXLPOL:
línea celular Sf9POL. A) Línea Sf9POL sin infectar. B) Línea Sf9POL infectada con el baculovirus
AcPOL-. La flecha muestra los poliedros refringentes en el interior de una célula infectada. C), D) y E)
Visualización al microscopio de células de la línea Sf9POL infectada, tres campos distintos de un mismo
cultivo infectado.
Como se puede observar en las fotografías, los poliedros resultaron morfológicamente similares
a los observados en las transfecciones transitorias y se los halló, a diferencia de lo que ocurre en
la expresión transitoria, en un mayor porcentaje de células totales.
Las líneas establemente transformadas se mantuvieron estables y capaces de producir
poliedros tras la infección con baculovirus pol-, por al menos 30 pasajes.
Para determinar en qué momento de la infección comienza a producirse la proteína
poliedrina codificada en el genoma celular, se realizó una cinética de expresión cosechando
células de la línea Sf9POL infectadas a distintos tiempos y comparando esa expresión con la de
AcMNPV en células Sf9. La figura R21 muestra cinéticas similares, aunque ligeramente
desfasadas, en las que se puede observar que la expresión de poliedrina en la línea establemente
transformada comienza a ser detectable a las 30 hpi, mientras que en las células Sf9 infectadas
con el baculovirus wt la poliedrina comienza a detectarse a las 24 hpi.
86
Resultados- Capítulo I
0
6
18
24
30
42
48
54
66
hpi
Sf9POL/AcPOL-
Sf9/AcMNPV wt
Figura R21. Cinética de expresión de poliedrina por la línea celular Sf9POL en comparación con
células Sf9 infectadas con el baculovirus salvaje. A) Western blot de extractos de células de la línea
Sf9POL infectada con el baculovirus AcPOL-, cosechadas a distintos tiempos post infección. B)
Western blot de extractos de células Sf9 infectadas con el baculovirus AcMNPV wt, cosechadas a
distintos tiempos post infección.
4. Caracterización de los poliedros obtenidos de la línea Sf9POL infectada con
baculovirus polPara continuar con el estudio de la línea de poliedrina estable e inducible, se comenzó por
determinar si los poliedros obtenidos contenían baculovirus en su interior; es decir, si la línea
era capaz de ocluir baculovirus de genotipo pol-. A partir de estos resultados, se realizaron
bioensayos para confirmar la naturaleza infectiva de los poliedros.
4.1 Ensayos de oclusión por la línea Sf9POL
Los cuerpos de oclusión obtenidos por infección de la línea Sf9POL con el baculovirus AcPOLfueron purificados de acuerdo a lo descrito en Materiales y Métodos. Para determinar la
presencia o ausencia de baculovirus ocluidos dentro de los poliedros se ensayaron cuatro
estrategias. En primer lugar, se aisló ADN de los poliedros purificados y se detectó la presencia
de ácido nucleico por electroforesis en geles de agarosa (Figura R22).
87
Resultados- Capítulo I
WT
Figura R22. Aislamiento de ADN de poliedros de
Sf9POL
la línea estable Sf9POL infectada en comparación
con ADN aislado de poliedros wt.
En ambos
casos se observa la presencia de ADN dentro de los
poliedros.
La segunda estrategia consistió en la detección de la proteína baculoviral P74 (exclusiva del
fenotipo ODV) por Western blot en poliedros aislados, previa disolución de la matriz de
poliedrina utilizando una solución alcalina de Na2CO3, para liberar los baculovirus ocluidos.
Como control, se realizó el mismo ensayo para la línea PCPOL en la cual no se observó
producción de poliedros ni se detectó ARNm de poliedrina. La figura R23 muestra los
resultados del ensayo, donde se puede observar una banda correspondiente a la proteína P74
sólo en el caso de la línea Sf9POL infectada. En paralelo se sometió a la membrana a un
anticuerpo anti-poliedrina, para corroborar que la disolución de los poliedros fue satisfactoria.
La ausencia de una banda de reconocimiento de P74 en el caso de la línea PCPOL infectada
sugiere que las concentraciones de ODV recuperadas mediante el protocolo utilizado son
despreciables en ausencia de oclusión.
p C POL
-
+
Sf9POL
-
+
P74
POL
Figura R23. Ensayo de Western blot de la fracción insoluble de las líneas estables utilizando
anticuerpos contra las proteínas baculovirales P74 y POL. Los signos - y + refieren a la ausencia o
presencia de infección, respectivamente. La proteína P74 se reveló por quimioluminiscencia y poliedrina
por el método de fosfatasa alcalina.
88
Resultados- Capítulo I
La tercera estrategia consistió en determinar por Western blot la presencia de la proteína
mayoritaria de nucleocápside VP39, tanto en el exterior como en el interior de los poliedros
aislados. Para ello, se tomaron suspensiones de poliedros salvajes (wt) y de la línea Sf9POL y se
las enfrentó a SDS 0,5 %. Se calentó la muestra a 65 °C para desprender los baculovirus que
pudieran quedar adheridos a la superficie de los poliedros. A continuación se centrifugó, se
separó el sobrenadante (S) y se procedió a disolver la poliedrina de los pellets (P) utilizando
Na2CO3. La figura R24 muestra el resultado de este ensayo, donde se observa una banda
correspondiente a la proteína VP39 únicamente en los pellets de poliedros provenientes de la
línea Sf9POL y del control de poliedros wt. En paralelo sobre la misma muestra se ensayó la
detección de la proteína GP64, presente en la envoltura de los BV pero no en los ODV. En la
fracción interna de los poliedros en ambas muestras en las que se observa la presencia de VP39,
no se observa detección de la proteína GP64, indicando que los baculovirus detectados
pertenecen al fenotipo ODV.
Estos resultados en conjunto sugieren fuertemente la existencia de baculovirus ocluidos
dentro de los poliedros de la línea estable.
wt
Sf9POL
Sf9
S
P
S
P
BV
GP64
VP39
Figura R24. Ensayos de Western blot utilizando anticuerpos contra las proteínas baculovirales GP64
y VP39 en muestras de poliedros. Las suspensiones de poliedros fueron extraídas con SDS 0,5 % para
desprender los baculovirus adsorbidos en la superficie (S) y tratados con Na2CO3 con el objeto de
disolver la poliedrina y liberar los baculovirus de su interior (P). Muestras de poliedros de la línea
Sf9POL y wt así tratados fueron enfrentados a anticuerpos específicos. Sf9 corresponde a células sin
tratamiento, como control negativo del ensayo. BV corresponde a baculovirus brotados purificados
como control positivo de las proteínas GP64 y VP39.
89
Resultados- Capítulo I
Finalmente, para confirmar la presencia de baculovirus ocluidos, se realizaron cortes de células
de la línea Sf9POL y pCPOL infectadas y sin infectar y se observaron al microscopio electrónico.
Como se puede observar en la figura R25, los poliedros de la línea Sf9POL son capaces de ocluir
baculovirus (D-H) mientras que la línea pCPOL no presenta formación de poliedros y los virus
preocluidos permanecen en el interior del núcleo (B). Los signos de infección de la línea pCPOL
resultan similares a los de la infección de células Sf9 con un baculovirus de fenotipo occ-,
observándose viriones en el interior del núcleo; mientras que la línea Sf9POL infectada con el
baculovirus pol- muestra signos muy característicos de la infección con baculovirus AcMNPV wt
(occ+), con formación de poliedros que contienen baculovirus en su interior.
A
B
BV
EV
ODV
500 nm
500 nm
C
D
P
ODV
500 nm
POV
1 µm
90
Resultados- Capítulo I
E
P
F
POV
P
POV
ODV
ODV
500 nm
200 nm
G
P
H
ODV
POV
200 nm
1 µm
Figura R25. Micrografías electrónicas de las líneas establemente transformadas. A) Célula de la
línea pCPOL. B) Célula de la línea pCPOL infectada con el baculovirus AcPOL-. C) Célula de la línea
Sf9POL sin infectar. EV: Estroma Virogénico. POV: Virus Preocluido. ODV: Virus Derivado de
Cuerpo de Oclusión. Aumento en A, B y C: 100.00X. D) Núcleo de una célula de la línea Sf9POL
infectada con el baculovirus AcPOL-. P: Poliedro. Aumento: 6.000X. E), F) y G) Detalle de poliedros en
el interior de las células la línea Sf9POL infectada con AcPOL-. Aumento: E, 15.000X; F y G, 25.000X.
H) Poliedros producidos por el baculovirus AcMNPV en células Sf9 (fotografía tomada de Woo y
Ahn, 2006).
91
Resultados- Capítulo I
5. Estudio de la infectividad de los poliedros resultantes de la línea Sf9POL
infectada con baculovirus pol5.1 Ensayos de infectividad en larvas de Rachiplusia nu
Para estudiar la infectividad de los poliedros obtenidos por oclusión en la línea Sf9POL, se
dispusieron 3 grupos de 6 larvas de R. nu del tercer estadio seleccionadas al azar y se los infectó
oralmente con distintas fuentes de inóculo: poliedros obtenidos por infección de células con el
baculovirus recombinante AcGFPpol+, poliedros wt y poliedros obtenidos de la línea celular
Sf9POL infectada con el baculovirus AcGFPpol-. Las larvas se infectaron con 1 x 105 poliedros
totales por inóculo embebidos en la dieta artificial. Diariamente se las monitoreó bajo lupa y
microscopio para observar fluorescencia de GFP como signo de infección.
A los 4 dpi, tanto las larvas infectadas con poliedros AcGFPpol+ como las infectadas con
poliedros de la línea Sf9POL mostraron fluorescencia, mientras que ninguna de las larvas
control infectadas con poliedros wt lo hizo. La figura R26 muestra larvas infectadas con los
distintos inóculos visualizadas bajo lámpara de luz azul. Los resultados demuestran que los
poliedros derivados de la línea Sf9POL contienen baculovirus que son infectivos para las larvas.
En la figura R27 se detallan fotografías de larvas infectadas con poliedros derivados de la
línea Sf9POL que contenían baculovirus AcGFPpol- a los 5 dpi, observadas al microscopio. La
fluorescencia detectada en todo el cuerpo de la larva sugiere que los baculovirus liberados de los
poliedros derivados de la línea celular empaquetadora se diseminaron de manera similar a la
que ocurre en infecciones naturales.
92
Resultados- Capítulo I
Figura R26. Larvas infectadas con poliedros de distinto origen. a) Larva infectada con poliedros
derivados de la infección de células Sf9 con el baculovirus AcGFPpol+, b) Larva infectada con
poliedros wt, c) Larva infectada con poliedros derivados de la línea Sf9POL infectada con el
baculovirus AcGFPpol-.
Figura R27. Observación al microscopio de larvas enteras infectadas por vía oral con baculovirus
AcGFPpol- ocluidos por la línea Sf9POL. Las imágenes del panel superior corresponden a fotografías
tomadas bajo luz blanca en un aumento de 10X. Las imágenes del panel inferior corresponden a las
mismas imágenes pero tomadas bajo luz azul.
93
Resultados- Capítulo I
Para determinar el nivel de infección de las larvas, al 4° dpi se realizaron extractos larvales para
medición de fluorescencia. Cada muestra se homogeneizó y se clarificó dos veces por
centrifugación y el sobrenadante libre de cutícula y otros componentes fue separado. Se
sembraron iguales cantidades de proteínas de cada una en placas de 96 pocillos negras opacas y
fluorescencia
se realizó la medición en un fluorómetro. En la figura R28 se muestran los resultados.
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Sin infectar
GFPpol-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
# de larva
Figura R28. Medición de fluorescencia en extractos de larvas infectadas por vía oral con el
baculovirus AcGFPpol- ocluido por la línea Sf9POL. Cada barra corresponde a una larva infectada
con 1 x 105 poliedros totales adsorbidos en la dieta artificial. Se muestra una larva sin infección como
representación de los controles negativos.
Los distintos niveles de fluorescencia alcanzados por las larvas mostraron variabilidad de
infectividad entre individuos de un mismo grupo. A pesar de estas diferencias observadas,
todas las larvas inoculadas se infectaron con el baculovirus reportero AcGFPpol- ocluido por la
línea Sf9POL.
5.2 Comparación de la infectividad de poliedros AcPOL-/Sf9POL y poliedros wt
Con el objetivo de comparar la infectividad de los poliedros derivados de la línea Sf9POL
infectada con el baculovirus AcPOL- y los poliedros AcMNPV wt, se realizaron bioensayos con
larvas R. nu. Para ello, se seleccionaron al azar larvas del tercer estadio y se colocaron en placas
94
Resultados- Capítulo I
de 6 compartimientos. Se inocularon 12 larvas con 1 x 105 poliedros totales por inóculo:
AcMNPV wt y AcPOL-/Sf9POL, embebidos en la dieta artificial. A un grupo adicional se le
administró el mismo volumen de PBS como control negativo. Luego de la infección, las placas se
incubaron a 26 °C y se monitorearon diariamente para determinar el porcentaje de muertes por
día por inóculo. La determinación del número de larvas muertas se realizó hasta el momento en
que las larvas control alcanzaron el estado de pupa. En la figura R29 se puede observar a una
placa conteniendo larvas infectadas con 1 x 105 poliedros provenientes de la línea Sf9POL a los 5
dpi. El aspecto de las larvas infectadas se corresponde con el de la muerte debida a infección por
baculovirus, caracterizada por el proceso de melanización que le da otorga el color gris oscuro y
la licuefacción de tejidos.
Figura R29. Placa conteniendo larvas de R. nu infectadas con AcPOL-/Sf9POL al 5° dpi. En detalle
puede observarse el aspecto melanizado de las larvas, característico de la infección avanzada por
baculovirus.
Con los datos de mortalidad de larvas con 1 x 105 poliedros de cada inoculo ensayado en función
de los dpi, se construyó la curva que se muestra en la figura R30. En este gráfico se puede
observar que la infectividad de los poliedros de la línea Sf9POL resultó similar a la de los
poliedros wt. Ambos inóculos alcanzaron 100 % de mortalidad a los 7 dpi a esta dosis ensayada,
confirmando que la línea es capaz de producir poliedros infectivos.
95
Resultados- Capítulo I
Mortalidad (%)
100
80
60
Sf9POL/AcPOL-
40
wt
20
0
3
4
5
6
7
8
Días post infección (dpi)
Figura R30. Curvas de mortalidad de larvas infectadas por vía oral con poliedros AcPOL-/Sf9 (azul), y
AcMNPV (rosa). Se grafican los datos de porcentaje de muertes en función del tiempo hasta los 8 dpi.
Para confirmar el fenotipo de la progenie viral presente en las larvas en cada condición, se
extrajo un pequeño volumen de hemolinfa y tejidos y se los observó al microscopio óptico. Esta
extracción se realizó cuando el proceso de melanización se hizo evidente (entre los 5 y los 8 dpi).
Como se observa en la figura R31, la hemolinfa de las larvas infectadas con poliedros wt
presentó una alta densidad de poliedros salvajes (Figura R31 A), mientras que la hemolinfa de
las larvas infectadas con poliedros de la línea Sf9POL no mostró presencia de poliedros (Figura
R31 B). Este análisis confirmó la condición de infección de cada larva según el inóculo recibido y
demostró que la línea Sf9POL es capaz de aportar infectividad por vía oral al baculovirus
AcPOL-, manteniendo su genotipo pol- que le impide formar nuevos poliedros y transmitir la
infección a otros insectos susceptibles.
A
B
Figura R31. Muestras de hemolinfa
de larvas muertas por infección. A)
Hemolinfa de larva infectada con
poliedros AcMNPV. B) Hemolinfa
de larva infectada con poliedros
AcPOL-/Sf9POL.
96
Resultados-Capítulo II
Capítulo II
Caracterización de una mutación puntual en el gen poliedrina que genera
poliedros de morfología aberrante
1. Antecedentes
Para la obtención de la línea celular Sf9 transformada con poliedrina se utilizó el plásmido
pXXLPOL cuya construcción fue descrita en el Capítulo I. Este vector transporta el gen de
poliedrina regulado por una región de 2.640 pb río arriba del promotor mínimo de poliedrina y
a su vez posee un gen de resistencia a blasticidina que permite la selección de las células
transformadas. Este plásmido fue utilizado para transfectar células Sf9 y seleccionar líneas
policlonales que fueron amplificadas y analizadas en su expresión de poliedrina y morfogénesis
de poliedros luego de la infección con un baculovirus pol-. Cuando se utilizó el baculovirus
AcGFPpol- como reportero y las células se observaron diariamente al microspio de
fluorescencia, una de las líneas obtenidas mediante este procedimiento presentó cuerpos de
oclusión de morfología aberrante luego de los 3 dpi. Los cuerpos refringentes de forma cúbica
hallados en el interior de las mismas eran de mayor tamaño que los poliedros producidos por
los baculovirus salvajes. Además, se observaban entre uno y cinco poliedros por célula. La
figura R32 muestra en detalle células establemente transformadas con un clon del plásmido
pXXLPOL e infectadas con el baculovirus AcGFPpol-.
A
B
Figura R32. Fotografías al microscopio de células establemente transfectadas con un clon del
plásmido pXXLPOL e infectadas con el baculovirus AcGFPpol-. Las estructuras refringentes de forma
cúbica dentro del núcleo (señaladas con flechas) aparecen al infectar con el baculovirus de genotipo
pol-. A) Visualización del campo bajo luz blanca. B) Visualización del mismo campo bajo luz azul.
97
Resultados-Capítulo II
Para determinar si los poliedros con morfología diferente se habían originado por algún cambio
en la secuencia del gen poliedrina, se procedió a secuenciar este gen del clon pXXLPOL utilizado
en la construcción de estas líneas estables.
Al alinear la secuencia obtenida con la del gen poliedrina salvaje, se encontró una única
mutación puntual en nt 130 del gen poliedrina en el clon del plásmido pXXLPOL. Esta mutación
consistió en una sustitución de una A por una G, que se traduce a un cambio aminoacídico de
ácido glutámico (E) por glicina (G) en el aminoácido (aa) 44 de la proteína poliedrina (Figura
R33).
poliedrina
pXXLPOL
..110..... ..120..... ..130..... ..140..... ..150.....
CTTCGCCGAA CATGAGATCG AAGAGGCTAC CCTCGACCCC CTAGACAACT
CTTCGCCGAA CATGAGATCG AAGGGGCTAC CCTCGACCCC CTAGACAACT
aa 44
Poliedrina wt
Poliedrina mut
MPDYSYRPTIGRTYVYDNKYYKNLGAVIKNAKRKKHFAEHEIEEATLDPLDNYLVAEDPF
MPDYSYRPTIGRTYVYDNKYYKNLGAVIKNAKRKKHFAEHEIEGATLDPLDNYLVAEDPF
******************************************* ****************
LGPGKNQKLTLFKEIRNVKPDTMKLVVGWKGKEFYRETWTRFMEDSFPIVNDQEVMDVFL
LGPGKNQKLTLFKEIRNVKPDTMKLVVGWKGKEFYRETWTRFMEDSFPIVNDQEVMDVFL
************************************************************
VVNMRPTRPNRCYKFLAQHALRCDPDYVPHDVIRIVEPSWVGSNNEYRISLAKKGGGCPI
VVNMRPTRPNRCYKFLAQHALRCDPDYVPHDVIRIVEPSWVGSNNEYRISLAKKGGGCPI
************************************************************
MNLHSEYTNSFEQFIDRVIWENFYKPIVYIGTDSAEEEEILLEVSLVFKVKEFAPDAPLF
MNLHSEYTNSFEQFIDRVIWENFYKPIVYIGTDSAEEEEILLEVSLVFKVKEFAPDAPLF
************************************************************
TGPAYX
TGPAYX
******
Figura R33. Alineación de secuencias de poliedrina. Hallazgo de una mutación en un clon del
plásmido pXXLPOL. La sustitución de A por G hallada en el nt 130 del gen en el plásmido produce un
cambio del aa 44 de ácido glutámico (E) a glicina (G).
98
Resultados-Capítulo II
Para comprobar que esta mutación fuera la responsable del fenotipo alterado de los poliedros, se
construyó un baculovirus con la misma mutación en el gen poliedrina y se corroboró la
morfología de los poliedros resultantes.
2. Construcción de un baculovirus con poliedrina mutante en el aminoácido 44:
Con el objetivo de caracterizar la mutación hallada en el gen poliedrina, se construyó un
baculovirus recombinante con la secuencia de poliedrina mutante, que se denominó AcPOLE44G.
Para ello, se obtuvo por reacción de PCR la secuencia del gen pol mutado a partir del clon
del plásmido pXXLPOL que mostró anormalidades en la morfología de los poliedros. A este
plásmido se lo denominó pXXLPOLE44G. La secuencia de poliedrina mutada en el nt 130 se clonó
en el vector pFastBac para la construcción de baculovirus recombinantes por el sistema Bac-toBac. Brevemente, el bácmido recombinante se obtuvo mediante transformación de bacterias
DH10Bac con el vector pFastBacPOLE44G. Este bácmido fue transfectado en células Sf9 para la
generación del baculovirus recombinante AcPOLE44G.
Luego de ser titulado, el baculovirus AcPOLE44G se utilizó para infectar células Sf9 a una
moi=1. La figura R34 muestra una imagen al microscopio de células Sf9 a los 3° dpi con el
baculovirus mutante en poliedrina.
99
Resultados-Capítulo II
A
B
1
2
Figura R34. Visualización al microscopio de células Sf9 infectadas con el baculovirus con poliedrina
mutante, AcPOLE44G. A) Los poliedros anormales refringen dentro de las células. Se muestra el detalle
de una célula con un único poliedro cúbico de gran tamaño en su interior. B) Efecto citopático del
baculovirus AcPOLE44G (1) en contraste con el efecto del baculovirus AcMNPV wt (2).
De esta manera se confirmó que la mutación puntual en el gen poliedrina es la
responsable del fenotipo anormal de poliedros.
3. Caracterización de los poliedros anormales
Existen antecedentes que describen diversos efectos sobre la morfología de los cuerpos de
oclusión causados por mutaciones dentro de la secuencia codificante de poliedrina (ver Tabla I3
en Introducción). Carstens et al. (1986) y Lin et al. (2000) describieron mutaciones puntuales en
AcMNPV que generan enormes poliedros de forma cúbica en el núcleo de células infectadas.
Estos autores demuestran que estas estructuras presentan poca a nula oclusión viral.
100
Resultados-Capítulo II
Para determinar si los poliedros de morfología aberrante producidos por el baculovirus
AcPOLE44G son capaces de ocluir baculovirus, se infectaron células a una moi=1 y se dejó
progresar la infección hasta el 6° dpi. En ese momento se realizó la lisis de las células y se
aislaron poliedros según el protocolo detallado en Materiales y Métodos. De esta manera, se
obtuvo una suspensión de poliedros que se utilizaron en ensayos de Western blot e infección oral
de larvas para su caracterización.
3.1 Detección de baculovirus ocluidos en poliedros mutantes
Como primera estrategia de determinación de oclusión por parte de los poliedros anormales, se
procedió de manera similar que con los poliedros derivados de la línea Sf9POL. El protocolo en
este caso consistió en calentar a 65 °C la suspensión de poliedros en buffer cracking por 10 min y
luego de una centrifugación se conservaron los sobrenadantes (S1) y se trataron nuevamente los
pellets de poliedros con buffer cracking. De ese lavado se recuperaron nuevamente los
sobrenadantes (S2) y se procesaron los pellets (P) mediante su disolución con Na2CO3 para liberar
los baculovirus potencialmente ocluidos. La presencia de viriones ocluidos se infirió por la
determinación de proteínas virales por Western blot enfrentando las muestras con un anticuerpo
monoclonal contra la proteína VP39. El resultado se muestra en la figura R35.
AcMNPV wt
AcPOLE44G
S1
S2
*
P
S1
S2
P
*
VP39
Figura R35. Detección de la proteína VP39 como prueba de oclusión de baculovirus AcPOLE44G en
poliedros mutantes. La detección de la proteína baculoviral VP39 se ensayó sobre muestras de
poliedros extraídos con SDS (S1), lavados 1 vez (S2) y tratados con Na2CO3 (P) para exponer su
contenido por disolución de poliedrina. El asterisco muestra la presencia de baculovirus en el interior
de los poliedros mutantes y adsorbidos a la superficie de los mismos.
101
Resultados-Capítulo II
Para confirmar la presencia de baculovirus en el interior de los poliedros mutantes, se realizaron
cortes de células infectadas con el baculovirus AcPOLE44G y se obtuvieron imágenes al
microscopio electrónico. En la figura R36 se observan las fotografías obtenidas y se comparan los
poliedros producidos por este baculovirus con los poliedros salvajes. Puede observarse un
poliedro mutante con baculovirus en su interior y otro poliedro anormal sin baculovirus
ocluidos. Esto permite afirmar que la mutación en poliedrina responsable del fenotipo genera
una deficiencia en la oclusión viral, por un mecanismo desconocido.
A
B
ODV
POV
POV
1 µm
1 µm
C
Figura R36. Imágenes de microscopía electrónica
P
P
de transmisión de células infectadas A) y B)
Poliedros anormales producidos por infección de
P
células Sf9 con el baculovirus AcPOLE44G. P:
Poliedro. POV: Virus Preocluido. ODV: Virus
ODV
EF
Ocluido.
Aumento:
8.000X
C)
Poliedros
producidos por infección de células Sf9 con el
baculovirus AcMNPV salvaje. EF: Estructura
fibrilar. Aumento: 10.000X.
102
Resultados-Capítulo II
4. Infectividad de los poliedros mutantes
4.1 Ensayo de infectividad en larvas
Para probar la infectividad de los poliedros mutantes se utilizó un baculovirus reportero, al
igual que para analizar la infectividad de los poliedros derivados de la línea Sf9POL. Para ello,
se obtuvo una línea celular establemente transformada con el gen POL mutante en el nt 130 por
la misma metodología por la cual se obtuvo la línea policlonal Sf9POL. Esta línea, denominada
Sf9POLE44G, fue infectada con el baculovirus AcGFPpol- y los poliedros mutantes resultantes
fueron aislados y utilizados como inóculo de infección oral.
Se seleccionaron 12 larvas del tercer estadio al azar, 6 de las cuales fueron inoculadas con 1 x
105 poliedros mutantes y 6 fueron inoculadas con poliedros AcGFPpol+ como control. A los 4 dpi
las larvas fueron observadas al microscopio de fluorescencia para corroborar la infectividad de
los poliedros administrados. Cuatro de las 6 larvas infectadas con los poliedros AcGFPpol/Sf9POLE44G resultaron fluorescentes mientras que la totalidad de las larvas infectadas con el
baculovirus control fluorescieron. La figura R37 muestra fotografías de las larvas infectadas por
vía oral con baculovirus reporteros, observadas al microscopio de fluorescencia.
A
B
Figura
R37.
Observación
al
microscopio óptico de larvas enteras
infectadas
por
vía
oral
con
el
baculovirus AcGFPpol- ocluido por la
línea
Sf9POLE44G.
tomadas
bajo
A)
luz
Fotografías
blanca
en
un
aumento de 10X. B) Las mismas
imágenes
de
su
izquierda,
pero
tomadas bajo luz azul.
103
Resultados-Capítulo II
4.2 Comparación de la infectividad de poliedros AcPOLE44G y poliedros wt
Con el objetivo de comparar la infectividad de los poliedros mutantes y los poliedros AcMNPV
wt, se realizó un bioensayo con larvas de R. nu del tercer estadio, que fueron seleccionadas al
azar y colocadas en placas de 6 compartimientos. Se inocularon 12 larvas por inóculo: AcMNPV
wt y AcPOLE44G, cada una con con 1 x 105 poliedros totales depositados sobre cubos de alimento
artificial. A un tercer grupo se le administró PBS como control negativo. Se determinó el
porcentaje de muertes por día por inóculo, hasta el momento en que las larvas control
alcanzaron el estado de pupa. Con estos datos se construyó una curva de mortalidad que se
muestra en la figura R38.
M ortalidad (%)
100
80
60
AcPOLE44G
40
wt
20
0
3
4
5
6
7
8
Días post infección (dpi)
Figura R38. Curvas de mortalidad de larvas infectadas por vía oral con poliedros AcPOLE44G (azul) y
AcMNPV (rosa). Se grafican los datos de porcentaje de muertes en función del tiempo hasta los 8 dpi.
Una dosis de 1 x 105 poliedros producidos por el baculovirus AcPOLE44G produjeron un máximo
de mortalidad del 60 % hasta el final del experimento, mientras que la misma cantidad de
poliedros wt mataron al 100 % de las larvas a los 7 dpi. Es posible que la menor mortalidad
registrada para los poliedros mutantes se deba a la deficiencia de oclusión que presenta el
baculovirus AcPOLE44G como consecuencia de una mutación puntual en el gen poliedrina.
104
Resultados-Capítulo II
Cuando el proceso de melanización debida a la infección se hizo evidente, se extrajo hemolinfa
de las larvas y se la observó al microscopio. Como se observa en la figura R39, la hemolinfa de
las larvas infectadas con los poliedros mutantes contenía poliedros de morfología característica
de la infección con el baculovirus AcPOLE44G (Figura R39 A), siendo la mayoría de mayor tamaño
que los poliedros wt (Figura R39 B).
A
B
Figura R39. Muestras de hemolinfa
de larvas infectadas. A) Hemolinfa
de larva infectada con poliedros
AcPOLE44G. B) Hemolinfa de larva
infectada con poliedros AcMNPV.
Este análisis confirmó la condición de infección de cada larva según el inóculo recibido y
confirmó que la mutación puntual en poliedrina del baculovirus AcPOLE44G es responsable de las
alteraciones observadas en la morfología de los poliedros.
105
Discusión
Discusión
Discusión
Desarrollo de una línea celular empaquetadora de baculovirus polEl objetivo del presente trabajo de tesis consistió en determinar si es posible complementar la
deficiencia del gen poliedrina de baculovirus de genotipo pol- y fenotipo occ- con una o más
copias en trans desde el genoma celular, de manera de coordinar temporal y espacialmente la
expresión de adecuados niveles de poliedrina con la presencia en el núcleo de viriones
preocluidos para la formación de cuerpos de oclusión. Para esto se desarrolló una línea celular
en la que se insertaron diferentes secuencias río arriba del gen poliedrina para regular de
manera inducible su expresión tras la infección con virus deficientes en poliedrina.
La generación de una línea de insecto transformada con poliedrina fue recientemente
desarrollada en el modelo BmMNPV. El grupo de Chen fue capaz de ocluir baculovirus
BmMNPV recombinantes de genotipo pol- por expresión de poliedrina bajo la regulación del
promotor constitutivo OpIE1 en una línea celular establemente transformada (Chen et al., 2008).
La infectividad de los poliedros así obtenidos fue confirmada empíricamente por observación de
signos de infección en larvas de B. mori infectadas por vía oral. En otro experimento, estos
investigadores compararon la infectividad de los virus recombinantes ocluidos por la línea
estable con la de los poliedros derivados del baculovirus BmMNPV salvaje y pudieron notar que
la infectividad de los poliedros de la línea era significativamente menor que la de los poliedros
wt.
En el modelo AcMNPV, la construcción de una línea de células de insecto que exprese
poliedrina bajo la regulación de su propio promotor activable por factores virales, fue propuesta
con anterioridad, aunque sin éxito (Nagamine et al., 1995). Mediante cotransfección de células
Sf21 con dos plásmidos, uno que llevaba el gen de poliedrina completo regulado por su
promotor contenido en el fragmento EcoRI-I (Smith y Summers, 1979) y otro que confería
resistencia a geneticina, estos autores desarrollaron tres líneas estables que presentaban al menos
una copia del transgén. Para determinar si en dichas líneas se expresaba poliedrina, las células
fueron infectadas con un baculovirus de genotipo pol-. Tras la infección, los investigadores no
observaron poliedros al microscopio ni detectaron la expresión de poliedrina por Western blot
con un anticuerpo anti-poliedrina. La escasa o nula expresión de poliedrina cuando esta
secuencia se encontraba integrada en el genoma fue adjudicada al entorno en el que se ubicó el
106
Discusión
gen en el cromosoma. Fue sugerido, además, que la expresión, independientemente del
promotor que la regule, se veía interrumpida en etapas tardías de la infección debido al shutdown sobre los mecanismos celulares que pueden estar involucrados. Por lo tanto, Nagamine y
colaboradores propusieron que previo a expresar proteínas en un sistema inducible por
infección, habría que comprender más profundamente los mecanismos de shut-down de
proteínas celulares. Sin embargo, estos autores no discuten la importancia de secuencias
regulatorias adicionales a las contenidas en el fragmento por ellos utilizado. Las evidencias
sugieren que, de haber existido expresión de poliedrina, ésta debió ocurrir a niveles no
detectables e insuficientes para la formación de cuerpos de oclusión.
Se ha descrito que las secuencias río arriba de poliedrina en AcMNPV, conocidas como
secuencias pu (del inglés polyhedrin upstream) contienen elementos del tipo enhancer. Se demostró
que la presencia de la región pu produce un aumento en los niveles de expresión de genes
heterólogos en ensayos de transcripción transitoria y que esta actividad depende sólo de los
factores virales IE1, IE2 y PE38 (Wu et al., 2008).
Además de los factores virales requeridos para la transcripción a partir del promotor de
poliedrina, se ha determinado que algunos factores de la célula hospedadora tienen una
importante función en la transcripción de los promotores muy tardíos de AcMNPV. Por ejemplo,
la proteína de unión al promotor de poliedrina (PPBP) se une a la región promotora mínima de
95 pb (Etkin et al., 1994). Esta proteína celular se une también al promotor p10 con afinidad
similar (Jain y Hasnain, 1996).
Las regiones homólogas hrs son los enhancers baculovirales más conocidos. Estos elementos
pueden funcionar independientemente de factores virales. En el genoma se encuentran ocho
regiones homólogas, que son secuencias entre 120 y 800 pb que debido a su alto contenido de
A+T, ubicación simétrica y regiones de palíndromes imperfectos, se conoce que funcionan como
orígenes de replicación (oris). Esta función de ori fue hallada en experimentos de replicación
transitoria, en los que se sugirió que estas secuencias están involucradas en la replicación viral
(Cochran y Faulkner, 1983).
Se cree que hr1 actúa potenciando la activación del promotor de poliedrina mediante la
unión de la proteína celular hr-BP que contribuiría a mantener bajos niveles basales de
transcripción en etapas tempranas del ciclo de infección. Esta proteína celular también fue
hallada en extractos nucleares de mamíferos y es por ello que hr1 es capaz de activar promotores
heterólogos como el de citomegalovirus y el de Drosophila hsp70 (Viswanathan et al., 2003). A
107
Discusión
medida que la infección prosigue, este factor favorece la transcripción que responde a factores
inducibles del hospedador y a factores virales que se unen a sitios cercanos al hr1. Estudios
previos demostraron que cuando la secuencia hr1 es colocada a una distancia aproximada de 3,7
kpb río arriba del gen poliedrina en el genoma de AcMNPV wt, aumenta la transcripción desde
el promotor baculoviral muy tardío de poliedrina de manera independiente de la función de ori
del hr (Habib et al., 1996). Posteriormente se analizó el efecto de la inclusión de más de una copia
de hr1 sobre la expresión del promotor de poliedrina y se observó un importante aumento en los
niveles de expresión de un gen reportero como consecuencia directa de un aumento en el nivel
de ARN en la transcripción (Venkaiah et al., 2004).
Otra secuencia regulatoria que se une a factores celulares de la familia de proteínas Sp
presente a unos 450 pb río arriba del promotor de poliedrina juega también un rol importante en
la transcripción a partir de este promotor. Esta región denominada AcSp, que contiene el
consenso de reconocimiento de la proteína Sp1, genera in vivo un aumento de la transcripción
del gen reportero luciferasa regulado por el promotor de poliedrina (Ramachandran et al., 2001).
Con esta evidencia, la inclusión de una región río arriba del promotor de poliedrina que
comprenda sitios de unión para factores de transcripción virales y celulares, puede brindar una
regulación adecuada al gen poliedrina dentro del contexto genómico celular. Así, la ausencia de
dichas secuencias regulatorias en la línea desarrollada por Nagamine y col. pudo haber
contribuido en alguna medida a la baja expresión de poliedrina en ese sistema.
En este trabajo, con el propósito de determinar la secuencia regulatoria óptima para conducir
la transcripción de poliedrina en las líneas estables inducibles por la infección con baculovirus,
se diseñaron diferentes construcciones que transportaban regiones promotoras de complejidad
variable guiando la transcripción del gen reportero CAT. Los resultados de actividad enzimática
al transfectar transitoriamente células Sf9 con las construcciones obtenidas mostraron que la
expresión del gen reportero se activó y se mantuvo a niveles elevados y constantes a lo largo del
tiempo cuando las células se transfectaron con la construcción pXXLCAT y se infectaron con un
baculovirus occ- a las 4 horas post transfección. El resto de los vectores con promotores
inducibles no alcanzaron niveles tan elevados de expresión, habiendo llegado a un nivel máximo
de actividad de CAT a los 6 días post transfección, tras lo que decayeron. El aumento de la
expresión del gen reportero observado a partir de la región XXL con respecto al observado a
partir de las otras regiones promotoras menos complejas sugiere que la inclusión de la región
hr1 ejerce un efecto potenciador sobre la transcripción a partir del promotor de poliedrina en
108
Discusión
este sistema, resultado que concuerda con lo demostrado por Habib y colaboradores (Habib et
al., 2006).
La diferencia entre la región XL y la región XXL es que esta última, además de contener el
fragmento XL (unas 700 pb antes del promotor mínimo de poliedrina), contiene la secuencia río
arriba de poliedrina comprendida desde la posición -1.017 a la -1.537 río arriba del ATG, región
en la que fue insertada la secuencia hr1. Estas 837 pb dentro de la región XXL no contienen sitios
descritos de unión a proteínas celulares o virales que puedan ejercer algún efecto positivo en la
transcripción a partir del promotor de poliedrina. Recientemente fue publicado un trabajo por
Kumar y colaboradores en el que se realiza un minucioso análisis de las secuencias río arriba de
poliedrina. Los autores sugieren la existencia de factores transcripcionales pertenecientes a la
familia de los factores de heat shock y POU en las células de S. frugiperda (Kumar et al., 2009). Este
trabajo, además de apoyar la hipótesis de que las proteínas de la célula hospedadora cumplen
una función importante en la activación de la transcripción del promotor de poliedrina,
demuestra que la región comprendida entre el -703 y -1.625 no cumple un rol regulatorio
importante. Sin embargo, cuando la región entre -1.625 y -2.284 está ausente, ocurre una drástica
disminución de la transcripción. Esto refuerza el hecho de que el aumento de la transcripción de
CAT observado por la construcción pXXLCAT corresponde a la inserción de la región hr1 que
actúa como enhancer transcripcional del sistema y que es posible alcanzar niveles elevados de
actividad del promotor aún sin contar con la región comprendida entre los nt -1.625 y -2.284 río
arriba del gen.
Teniendo en cuenta la evidencia anteriormente enunciada y los resultados obtenidos en la
transactivación de las distintas regiones regulatorias de poliedrina ensayadas en este trabajo, se
escogió la región denominada XXL para ser utilizada en la transformación estable de células Sf9
con el gen poliedrina.
Mediante experimentos de transfección transitoria, se ensayó la capacidad de transcripción
del vector de transferencia pXXLPOL. Para inducir la expresión de poliedrina, se llevó a cabo una
infección con el baculovirus AcGFPpol- que permite monitorear el curso de la infección
mediante visualización de fluorescencia por microscopía. Se observó la presencia de estructuras
poliédricas a los 4 dpt en aquellas células que en las que coincidieron la transfección y la
infección, esta última evidenciada por la fluorescencia verde. Además fue posible detectar la
presencia de la proteína poliedrina en extractos de células transfectadas e infectadas. A pesar de
los altos niveles de actividad CAT obtenidos con el plásmido pcCAT en ausencia de infección,
109
Discusión
no se observaron estructuras poliédricas en las células transfectadas con el plásmido pCPOL ni se
detectó la proteína poliedrina en ensayos de Western blot. Estos resultados indican que
poliedrina podría resultar tóxica para las células de insecto cuando se expresa constitutivamente
o los niveles que se alcanzan no resultan suficientes para su detección ni para formar cuerpos de
oclusión. Por otro lado, en este trabajo se demostró que la actividad del gen reportero río abajo
del promotor constitutivo en la construcción pCCAT disminuye notablemente como
consecuencia de la infección.
Estos datos destacan las ventajas del uso del promotor de
poliedrina frente al promotor constitutivo OpIE-2 para regular la expresión del gen pol en el
contexto del genoma celular, durante una infección por baculovirus.
En base a los resultados obtenidos en los experimentos de expresión transitoria se pudo
concluir que es posible separar físicamente del genoma viral el gen poliedrina y sus secuencias
regulatorias y mantener la capacidad de formar poliedros en el núcleo de las células en las que la
transfección y la infección coincidieron. Así, se estableció la prueba de concepto para poder
complementar en trans la deficiencia de poliedrina desde el genoma celular.
Cuando se evaluó la transcripción de poliedrina a partir de las líneas estables pcPOL y
Sf9POL, se comprobó la transcripción de ARNm de poliedrina sólo a partir de la línea Sf9POL
infectada. No se detectó ARNm de poliedrina regulada por el promotor OpIE2 en la línea
pCPOL, confirmando la ineficiencia de transcripción de poliedrina a partir del promotor
constitutivo dentro de este sistema celular. Si poliedrina resulta tóxica para las células Sf9, es
posible que se seleccionen aquellas células que integran la copia del gen en una región de
heterocromatización que impide su transcripción.
La eficiencia en la regulación de la expresión que se conoce a partir del promotor OpIE-2
como promotor temprano de baculovirus es variable. Algunos autores como Morais y Costa
mostraron expresión estable en su sistema (Morais y Costa, 2003). Sin embargo, recientemente se
ha buscado el reemplazo de este promotor temprano de baculovirus por otros de mayor fuerza,
al comprobarse la baja expresión que se alcanza en células transformadas establemente en otros
sistemas (Ivanova et al., 2007; Shishiro et al., 2009). En contraposición a los resultados obtenidos
en esta tesis, Chen y colaboradores demostraron niveles de poliedrina suficientes para ocluir
baculovirus en una línea celular de B. mori cuando el gen fue controlado por un promotor
temprano (Chen et al., 2009). Quizás el número de copias que se integraron por el sistema
mediado por el transposón elegido para dar origen a las líneas estables fue mayor que el
alcanzado por la estrategia de integración con un plásmido. De todas maneras, la elección de un
110
Discusión
promotor muy tardío para la expresión de poliedrina en trans resultaría ventajosa para acoplar
temporalmente la presencia de la proteína con el empaquetamiento de virus en el núcleo.
La visualización al microscopio de diversas líneas Sf9POL infectadas con el baculovirus
AcGFPpol- reveló la presencia en el núcleo de cuerpos de oclusión desde los 3 dpi. Estos
poliedros resultaron en número y de morfología similar a los poliedros salvajes en todas las
líneas estables obtenidas, con excepción de una que presentó formación de estructuras
cristalinas de forma cúbica de tamaño sustancialmente mayor en el interior de las células, que
será discutida más adelante.
El hallazgo de poliedros tras la infección con baculovirus de genotipo pol- demuestra que es
posible complementar esta deficiencia desde el genoma celular, sin una replicación aparente del
ADN. Diferentes autores demostraron que la expresión de los genes tardíos de baculovirus
depende de la replicación de ADN y no ocurre cuando la replicación es inhibida por moléculas
como afidicolina (Friesen y Miller, 1986). Las regiones hr son consideradas “bifuncionales”, ya
que se han demostrado tanto propiedades potenciadoras de la transcripción como de función de
origen de replicación. Como se mencionó anteriormente, la secuencia hr1 incluida en una región
regulatoria presenta actividad enhancer. Sin embargo, también se descubrió su actividad de ori.
Fue posible observar que plásmidos que contenían secuencias hr replican en células de insecto
infectadas con AcMNPV, originando moléculas de movilidad electroforética compatibles con
concatémeros que podrían indicar un mecanismo de replicación del tipo de círculo rodante
(Kool et al., 1993). Así, no sólo es posible que luego de la replicación viral exista un período
transitorio o una porción de moléculas de ADN viral en las que el ADN no esté unido a
proteínas y pueda exponer un conjunto de promotores diferente con una activación facilitada,
sino también que los genes transcriptos por estos promotores, en particular los de poliedrina y
P10, sean producidos a partir de muchas más moléculas de templado que los promotores
tempranos, transcriptos antes de la replicación del genoma. El hecho de que hr1 aumente la
transcripción de manera independiente de la actividad de ori sugiere por otro lado un
requerimiento diferencial de factores de la célula hospedadora para estas dos funciones de los
elementos de hr (Habib et al., 1996).
Se ha demostrado además que la infección con el nucleopoliedrovirus Bombyx mori modifica
sustancialmente la cromatina celular, induciendo su relocalización marginal simultáneamente a
la expansión del estroma virogénico (Nagamine et al., 2008). Nuestros resultados demuestran
111
Discusión
que este fenómeno, si ocurre en AcMNPV, no impide la expresión de poliedrina a niveles
compatibles con la formación de poliedros.
La presencia de poliedros fue significativa en un número de células tras la infección con un
baculovirus pol-, pero no fue posible obtener poliedros en la totalidad de las células infectadas,
aún empleando multiplicidades de infección muy altas. Esto demuestra la heterogeneidad en el
número o posición de copias insertadas, provocando que en algunas células los niveles de
expresión fueran menores a los necesarios o se hallaran totalmente inactivos, hecho que puede
ser superado mediante el clonado de dicha población heterogénea.
Tanto el aislamiento de ADN en el interior de los poliedros obtenidos al infectar la línea
Sf9POL con el baculovirus AcPOL-, como el reconocimiento de las proteínas baculovirales P74 y
VP39 luego de la disolución de estos cuerpos de oclusión, son resultados compatibles con la
presencia de viriones dentro de los poliedros generados por la línea estable. Sin embargo, la
detección de estas estructuras que componen los ODV no confirma la oclusión de viriones
enteros. El hecho que permitió afirmar que poliedrina expresada por las células de la línea
Sf9POL es capaz de originar poliedros que ocluyen viriones fue la observación al microscopio
electrónico de transmisión de cortes de las células Sf9POL infectadas. En estos experimentos, fue
posible detectar claramente los ODV embebidos en la matriz de poliedrina. Las imágenes
demuestran que el proceso de oclusión por la línea Sf9POL se desarrolla de manera similar al
que ocurre en las células Sf9 infectadas con baculovirus wt (O´Reilly et al., 1994).
Una vez confirmada la oclusión de baculovirus mediada por poliedrina proveniente de la
línea celular Sf9POL, se analizó la infectividad por vía oral de estos poliedros de manera
cualitativa. Para ello, se infectó la línea estable con el baculovirus AcGFPpol- y los poliedros
aislados que contenían el virus reportero fueron administrados en la dieta de larvas de R. nu.
Las larvas mostraron fluorescencia en todo su cuerpo al ser irradiadas con una fuente de luz
azul, ello indica que los poliedros son capaces de disolverse en el intestino de las larvas y que la
infección se dispersa de manera similar a la natural. Los niveles de expresión de GFP en las
larvas infectadas con los poliedros Sf9POL/AcGFPpol- muestra la existencia de diferencias entre
larvas en cuanto al grado de infección alcanzado por cada individuo ante la administración de
cantidades iguales de poliedros. Estas diferencias pueden referir tanto a los estados fisiológicos
variables dentro de una misma población como a la ingesta del inóculo de forma total o parcial a
lo largo del experimento. Posteriormente, con el objetivo de comparar la infectividad por vía
oral que presentan los poliedros derivados de la línea Sf9POL con respecto a los poliedros
112
Discusión
salvajes, se realizó un bioensayo con larvas de R. nu del 2° estadio a las que se les administró
una dosis de 1 x 105 poliedros AcPOL-/Sf9POL o wt por larva. Las curvas de mortalidad no
mostraron diferencias de infectividad entre los poliedros de la línea Sf9POL y los poliedros wt.
Por otro lado, el análisis al microscopio de la hemolinfa de larvas infectadas confirmó la
ausencia de poliedros al transcurrir la infección por el virus AcPOL- ocluido en trans.
El único antecedente en el desarrollo de una línea celular empaquetadora fue el publicado
por el grupo de Chen y colaboradores en el año 2009. Hasta el momento, la construcción de una
línea similar en AcMNPV no había sido lograda. Los resultados mostrados en este trabajo de
tesis confirman que es posible obtener una línea celular Sf9 que exprese poliedrina luego de la
infección viral, permitiendo la complementación de baculovirus recombinantes que carecen del
gen pol en su genoma. Poliedrina expresada en trans alcanza niveles suficientes como para
permitir la morfogénesis de poliedros y estos poliedros resultan infectivos para larvas por vía
oral. Además, a diferencia de lo expuesto por Chen y col., los poliedros AcPOL-/Sf9POL
muestran una infectividad comparable a los poliedros wt.
Caracterización de una mutanción puntual en el gen poliedrina
Durante el desarrollo de las líneas estables, se observó que una de las líneas transformadas con
el vector pXXLPOL producía poliedros de morfología aberrante al ser infectada con el baculovirus
AcGFPpol-. Para determinar el origen de estos poliedros anormales, se secuenció el vector
empleado para establecer las líneas y se halló una mutación puntual en la secuencia de
poliedrina. Esta mutación determinó una sustitución de ácido glutámico (E) por glicina (G) en la
posición aminoacídica 44. Para confirmar que dicha mutación era responsable del fenotipo de
poliedros anormales, se construyó un baculovirus que transportaba la secuencia de poliedrina
mutante en lugar de la salvaje, al que se denominó AcPOLE44G. La infección con este baculovirus
produjo un fenotipo igual al observado en la línea infectada; es decir, se visualizaron poliedros
cúbicos de gran tamaño, indicando que la mutación puntual en poliedrina provoca un cambio
en la morfología.
En AcMNPV fueron descritas dos mutaciones que presentan un fenotipo similar de
poliedros. Ambas son producidas por sustituciones; la primera en el aminoácido 59 (Carstens et
al., 1986) y la segunda en el aminoácido 25 (Lin et al., 2000). Bravo-Patiño e Ibarra generaron,
mediante mutagénesis dirigida, la sustitución de los aminoácidos Lys34, His36 y Phe37 por tres
113
Discusión
triptofanos en la secuencia de poliedrina de AcMNPV de tipo salvaje (Bravo-Patiño e Ibarra,
1999). Estas sustituciones provocaron cambios significativos tanto en la morfología de los
poliedros como en el proceso de oclusión y la cristalización de la proteína. La ubicación de las
mutaciones dirigidas fue seleccionada para dilucidar el papel de algunos de los aminoácidos de
la región variable entre especies, comprendida entre los residuos 34 a 54 (Rohrmann, 1986).
Recientemente se logró cristalizar y deteminar la estructura de poliedrina en AcMNPV y se
la comparó con la estructura de poliedrina de cipovirus (Ji et al., 2009). Este hecho permitió
diferenciar con mayor claridad las regiones dentro de la molécula y su disposición
tridimensional. La figura D1 A muestra la organización secundaria de poliedrina propuesta por
Ji y colaboradores.
A partir de los datos aportados por investigadores que describieron las mutantes puntuales
halladas en el gen poliedrina, el grupo de Ji clasificó las mutaciones en dos clases: clase i, para
las que generan masas proteicas dispersas y ausencia de oclusión (Carstens, 1987; Ribeiro et al.,
2009) y clase ii, las que generan poliedros de forma cúbica y gran tamaño (Carstens et al., 1986;
Lin et al., 2000). Según estos autores, las mutaciones de clase i afectan regiones de láminas β ( βC
y βD), denominadas core, mientras que las de clase ii afectan zonas cercanas a la región
denominada D1, correspondiente a un loop de residuos “desordenados” entre los aa 32 y 48. La
mutación G25D informada por Lin y col. en 2000 se localiza en la región anterior a D1
denominada α1 y la mutación P59L informada por Carstens y col. en 1986 se localiza en el loop
posterior a D1 entre βA” y B. La mutación hallada en este trabajo de tesis se localiza dentro de la
región D1, al igual que las mutantes inducidas por Bravo-Patiño e Ibarra (K34W, H36W y
F37W), por lo tanto, se la puede clasificar como de la clase ii. La ubicación de las mutantes
mencionadas dentro de la estructura tridimensional de poliedrina se ilustra en la figura D1 B.
114
Discusión
A
B
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% & '
(
)
Figura D1: Estructura secundaria y terciaria de poliedrina de AcMNPV. A) Diferencias entre las
estructuras secundarias de poliedrina de AcMNPV y CpGV. B) Estructura terciaria de poliedrina, con
las respectivas regiones aminoacídicas delimitadas (Esquema tomado de Ji et al., 2009) y la ubicación de
las mutantes de tipo ii informadas en AcMNPV hasta el momento.
En los poliedros aislados a partir de la infección con el baculovirus AcPOLE44G, la detección de la
proteína VP39 dio un indicio de la presencia de baculovirus ocluidos. En los ensayos de
microscopía electrónica se pudo observar que algunos poliedros mutantes presentan
baculovirus en su interior, mientras que otros no ocluyen viriones. Este resultado coincide con lo
descrito por Carstens y colaboradores en el año 1986, los que demuestraron también por
microscopía electrónica la presencia de baculovirus ocluidos en algunos poliedros de morfología
anormal y ausencia de ODV dentro de otros (Carstens et al., 1986). Este hecho parece ser una
115
Discusión
característica de este tipo de mutaciones, aunque resta determinar la causa de la ausencia de
oclusión dentro de ciertos poliedros mutantes. Los mecanismos y las bases genéticas del proceso
de oclusión se desconocen aún y la frecuencia de aparición en la naturaleza de poliedros
carentes de viriones ocluidos no se ha investigado de forma sistemática. La formación de
poliedros de morfología similar a la salvaje y sin viriones ocluidos se observó en células en
cultivo (Goodwin y Adams, 1980) y este fenotipo no resulta poco frecuente. Esto puede deberse
a la ausencia de presiones de selección en el sistema de cultivo para la formación de cuerpos de
oclusión infectivos, en comparación con lo que ocurre en la naturaleza. A pesar de que el
mecanismo por el que ocurre la oclusión en AcMNPV no está definido con claridad, existen
indicios de que algunas proteínas de la envoltura de los baculovirus poseen una alta afinidad
por poliedrina y que éstas pueden desencadenar la polimerización por sí mismas (Blissard y
Rohrmann, 1990). Se ha descrito una mutante en AcMNPV que genera poliedros que no
contienen viriones en su interior y al caracterizar las proteínas necesarias para la restitución se
halló que tanto P26, P10 y P74 eran necesarias para que existiera oclusión (Wang et al., 2009).
También la ausencia del producto del gen Ac142 genera un fenotipo similar (Mc Carthy et al.,
2008). En el caso de la secuencia de poliedrina mutante E44G, la ausencia de oclusión observada
en algunos poliedros de morfología aberrante confirma que en presencia de viriones normales
pueden formarse cuerpos de oclusión vacíos y que la oclusión ineficiente se debería a un cambio
conformacional que sufre poliedrina en su ensamblaje impidiéndole adherirse a los ODV y
empaquetarlos de manera natural. Este defecto puede ser explicado a partir del descubrimiento
de la estructura de poliedrina por cristalografía, que permitió inferir la existencia de ciertas
regiones en la estructura de esta proteína que resultaban más vulnerables. Puntualmente, la
región D1 es la secuencia menos conservada entre los baculovirus de distinto género. Esta
variabilidad sugiere que la región juega un rol importante en la especificidad del
empaquetamiento. Los baculovirus, a diferencia de los cipovirus, no poseen simetría icosaédrica,
por lo que se requiere de flexibilidad en ciertas áreas de poliedrina que interactúan con las
proteínas de la envoltura de los viriones (Ji et al., 2009). La asimetría es inevitable, ya que se
requiere para ocluir los paquetes irregulares de nucleocápsides. Esta hipótesis se apoya en la
observación de que las diferencias estructurales que se observan en las mutantes cercanas a esta
región o dentro de la región misma (como la mutante descrita en esta tesis) interfieren con la
oclusión viral. Las sustituciones que caracterizan estas mutantes darían lugar a ensamblajes de
poliedrina que otorgan menos espacio físico a los virus para adherirse a la estructura cristalina.
116
Discusión
Sin embargo, aún no es posible especificar los residuos que interactúan ni la identidad de las
proteínas de la superficie de los viriones envueltos que están involucradas en dicha unión
(Rohrmann, 2008).
Los bioensayos realizados para comparar la infectividad de los poliedros mutantes con
respecto a los poliedros salvajes demostraron que los poliedros derivados de la infección por el
baculovirus AcPOLE44G alcanzan una infectividad máxima de 60 % aproximadamente, con la
misma dosis que la administración de poliedros wt causa un 100 % de mortalidad a los 7 dpi.
Esta baja infectividad de los poliedros mutantes podría deberse a la deficiencia de oclusión que
presenta el baculovirus AcPOLE44G como consecuencia de la mutación puntual en el gen
poliedrina, demostrada en este trabajo y que se condice con lo publicado por otros grupos que
describieron mutaciones similares (Lin et al., 2000; Carstens et al., 1986).
Es posible que la forma cúbica de los poliedros producidos a partir del baculovirus
AcPOLE44G guarde alguna relación con la incapacidad de los viriones de ser correctamente
ocluidos dentro de la matriz de poliedrina, como se mencionó anteriormente. Estos resultados
contribuyen a definir aún más las regiones del gen poliedrina involucradas en la morfología de
los poliedros y las interacciones moleculares entre los viriones y poliedrina durante la
morfogénesis de los cuerpos de oclusión de AcMNPV.
Potenciales aplicaciones de la línea Sf9POL
El concepto de la producción comercial y a gran escala de proteínas en larvas de lepidóptero,
principalmente de la especie Trichoplusia ni, se manifiesta como una alternativa de mejor relación
costo/beneficio frente a la obtención de proteínas en biorreactores (Liu et al., 2007). Esta
estrategia puede competir con la producción de proteínas en cultivos celulares, no solamente
por su ventaja económica sino también porque se ha demostrado que las modificaciones
postraduccionales que presentan las proteínas heterólogas resultan más representativas de la
proteína nativa cuando son expresadas en el sistema larval (Andersons et al., 1991; O´Reilly et al.,
1994). Sin embargo, como ya fue mencionado, la administración de baculovirus recombinantes
que no poseen poliedrina en su genoma, mediante inyección intracuticular, resulta muchas
veces un proceso complejo, tedioso y que ocasiona una alta mortalidad en las larvas. Éstas, al
permanecer lastimadas en el sitio de inoculación, son susceptibles a nuevas infecciones,
principalmente bacterianas. Una alternativa es la inoculación por vía oral, que presenta ventajas
117
Discusión
en seguridad y practicidad, aunque requiere de la presencia de poliedrina en cis o en trans para la
oclusión de los baculovirus recombinantes. La administración oral de baculovirus preocluidos
también es posible, aunque para su aislamiento se requiere de un paso de ultracentrifugación y
adsorción en algún tipo de material inerte que preserve su infectividad en el ambiente, previa a
la ingesta por el insecto susceptible. En el caso de los baculovirus de genotipo pol+ utilizados
como virus helper, se ha probado que existe una competencia entre los promotores de poliedrina
y p10 que reduce los niveles de expresión (Chaabihi et al., 1997; Tuan et al., 2007). Otro
inconveniente que presentan estos baculovirus es que carecen de la proteína P10, ya que para
mantener poliedrina en su genoma, el gen pol es colocado en el locus p10 bajo el promotor de
esa proteína viral. Se ha visto que mutantes sin p10 aumentan la DL50 en T. ni nueve veces con
respecto a los baculovirus wt (Cheng et al., 2001). Esto, sumado a los datos recientemente
aportados por Wang y col., los que afirman que la ausencia de P10 provoca una deficiencia en la
oclusión de los viriones, sugiere que P10 juega un papel importante en la generación de
poliedros infectivos (Wang et al., 2009). El empleo de virus helpers que aportan poliedrina en
trans también presenta desventajas, ya que se deben realizar coinfecciones que también generan
competencia por las maquinarias traduccionales.
Otra potencial aplicación de la línea que expresa poliedrina es el desarrollo de nuevos
insecticidas biológicos basados en baculovirus recombinantes. Como fue mencionado, la
desventaja de esta forma de control de insectos plaga, con respecto a los insecticidas químicos, es
su elevada latencia de acción (Moscardi, 1999). Con el advenimiento de las técnicas del ADN
recombinante, fue posible modificar a los baculovirus para otorgarles mayor potencia y
velocidad de acción (Stewart et al., 1991). La actividad de los baculovirus contra sus
hospedadores naturales pudo ser mejorada mediante la interferencia con la fisiología de los
insectos o la introducción de toxinas específicas (Bonning y Hammock, 1996; Inceoglu et al.,
2001; Muraleedharan y Gayathri Elayidam, 2008). Los cambios en la fisiología del hospedador
consisten en la introducción de genes que codifican para algunas hormonas de insectos y
enzimas modificadoras o en la eliminación del gen de la ecdisona glucosiltransferasa (egt) en el
genoma baculoviral. El producto del gen egt actúa durante la muda de la larva a su siguiente
estadio, prolongando el tiempo de alimentación e infección. La supresión de EGT en los
baculovirus modificados resulta en un aumento de un 30 % de la mortalidad de las larvas. Otra
ventaja de esta modificación del genoma es el hecho de que el gen egt no es esencial para la
replicación viral y puede ser reemplazado por un gen exógeno, que aumente la actividad
118
Discusión
insecticida del virus recombinante (Sun et al., 2004). Un ejemplo de ello son los genes de
neurotoxinas de artrópodos aisladas de escorpiones o arañas. La toxina que resulta más potente
y cuyo gen se utiliza para la construcción de baculovirus recombinantes es la del escorpión
Androctonus australis. Los baculovirus modificados por introducción del gen AaIT reducen en un
60 % los daños causados por las larvas infectadas en comparación con un baculovirus de tipo
salvaje (Inceoglu et al., 2001). Sin embargo, el impacto ecológico de la liberación a campo de los
baculovirus modificados no está suficientemente analizado y se requiere investigar con mayor
precisión sobre los posibles efectos no deseados de este biopesticida. La posibilidad de generar
un inóculo por vía oral para las larvas basado solamente en baculovirus de genotipo polresultaría un método con mayores beneficios a nivel ambiental, ya que las larvas infectadas no
podrían propagar el virus hacia las futuras generaciones de insectos susceptibles en ausencia de
poliedrina. En nuestros ensayos, las larvas de R. nu infectadas con poliedros obtenidos por
infección de la línea Sf9POL con un baculovirus de genotipo pol- no presentaron cuerpos de
oclusión en su hemolinfa, por lo que esta metodología permite la generación de un inóculo
baculoviral no propagable horizontalmente.
Por otra parte, la línea celular Sf9POL que expresa poliedrina inducida por infección viral es
una herramienta útil para el estudio de la biología de los baculovirus, en particular para la
caracterización de los mecanismos involucrados en la morfogénesis de los cuerpos de oclusión.
La posibilidad de empaquetar baculovirus de genotipo pol- mediante la expresión de poliedrina
en trans resulta ventajosa no sólo como herramienta de interés biotecnológico, sino también
como punto de partida al conocimiento de los mecanismos moleculares que operan entre el
virus y su hospedador.
119
Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones
A partir de los resultados obtenidos en este trabajo es posible extraer las siguientes conclusiones:
El agregado de secuencias de reconocimiento de factores virales y celulares, como AcSp y
hr1, río arriba del promotor mínimo de poliedrina, permite alcanzar los mayores niveles de
expresión de un gen reportero inducidos por la infección viral.
Es posible separar físicamente del genoma viral el gen poliedrina junto con sus secuencias
regulatorias y mantener la capacidad de formar poliedros en una infección de células Sf9,
tanto en transfecciones transitorias como en líneas establemente transformadas.
Los poliedros producidos por infección de la línea Sf9POL son capaces de ocluir baculovirus
de manera similar a la que ocurre en una infección de células Sf9 con baculovirus salvajes.
Los poliedros derivados de la línea Sf9POL resultan infectivos por vía oral para larvas de
Rachiplusia nu, en las que no se producen cuerpos de oclusión, demostrando que la estrategia
de empaquetamiento desarrollada permite dotar de infectividad por vía oral a baculovirus
de genotipo pol- sin propagar la infección horizontalmente.
La sustitución E por G en la posición aminoacídica 44 de poliedrina determina la formación
de poliedros cúbicos y de mayor tamaño, que ocluyen baculovirus en forma heterogénea.
La mutación E44G se sitúa en la región D1 de poliedrina, de alta variabilidad entre especies
de baculovirus, lo que aporta evidencia adicional sobre la importancia de esta región en el
proceso de oclusión.
Los datos aportados por este trabajo de tesis son relevantes para el estudio de la
morfogénesis de los baculovirus y sus aplicaciones biotecnológicas.
120
Anexo
Anexo
Anexo
Secuencias
(717 pb):
GFP for
1
1
ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC
M
V
S
K
G
E
E
L
F
T
G
V
V
P
I
45
15
46
16
CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG
L
V
E
L
D
G
D
V
N
G
H
K
F
S
V
90
30
91
31
TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG
S
G
E
G
E
G
D
A
T
Y
G
K
L
T
L
135
45
136
46
AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC
K
F
I
C
T
T
G
K
L
P
V
P
W
P
T
180
60
181
61
CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC
L
V
T
T
L
T
Y
G
V
Q
C
F
S
R
Y
225
75
226
76
CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC
P
D
H
M
K
Q
H
D
F
F
K
S
A
M
P
270
90
271
91
GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC
E
G
Y
V
Q
E
R
T
I
F
F
K
D
D
G
315
105
316
106
AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG
N
Y
K
T
R
A
E
V
K
F
E
G
D
T
L
360
120
361
121
GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC
V
N
R
I
E
L
K
G
I
D
F
K
E
D
G
405
135
406
136
AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC
N
I
L
G
H
K
L
E
Y
N
Y
N
S
H
N
450
150
451
151
GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC
V
Y
I
M
A
D
K
Q
K
N
G
I
K
V
N
495
165
496
166
TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC
F
K
I
R
H
N
I
E
D
G
S
V
Q
L
A
540
180
541
181
GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG
D
H
Y
Q
Q
N
T
P
I
G
D
G
P
V
L
585
195
586
196
CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA
L
P
D
N
H
Y
L
S
T
Q
S
A
L
S
K
630
210
631
211
GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG
D
P
N
E
K
R
D
H
M
V
L
L
E
F
V
675
225
676
226
ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG
T
A
A
G
I
T
L
G
M
D
E
L
Y
K
GFP rev
717
121
Anexo
Secuencia de poliedrina (737 pb)
POL ATG
1 - ATGCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGTACCTACGTGTACGACAACAAGTAC - 60
1 - M P D Y S Y R P T I G R T Y V Y D N K Y
- 20
61 - TACAAAAATTTAGGTGCCGTTATCAAGAACGCTAAGCGCAAGAAGCACTTCGCCGAACAT - 120
21 - Y K N L G A V I K N A K R K K H F A E H
- 40
121 - GAGATCGAAGAGGCTACCCTCGACCCCCTAGACAACTACCTAGTGGCTGAGGATCCTTTC - 180
41 - E I E E A T L D P L D N Y L V A E D P F
- 60
181 - CTGGGACCCGGCAAGAACCAAAAACTCACTCTCTTCAAGGAAATCCGTAATGTTAAACCC - 240
61 - L G P G K N Q K L T L F K E I R N V K P
- 80
241 - GACACGATGAAGCTTGTCGTTGGATGGAAAGGAAAAGAGTTCTACAGGGAAACTTGGACC - 300
81 - D T M K L V V G W K G K E F Y R E T W T
- 100
301 - CGCTTCATGGAAGACAGCTTCCCCATTGTTAACGACCAAGAAGTGATGGATGTTTTCCTT - 360
101 - R F M E D S F P I V N D Q E V M D V F L
- 120
361 - GTTGTCAACATGCGTCCCACTAGACCCAACCGTTGTTACAAATTCCTGGCCCAACACGCT - 420
121 - V V N M R P T R P N R C Y K F L A Q H A
- 140
421 - CTGCGTTGCGACCCCGACTATGTACCTCATGACGTGATTAGGATCGTCGAGCCTTCATGG - 480
141 - L R C D P D Y V P H D V I R I V E P S W
- 160
481 - GTGGGCAGCAACAACGAGTACCGCATCAGCCTGGCTAAGAAGGGCGGCGGCTGCCCAATA - 540
161 - V G S N N E Y R I S L A K K G G G C P I
- 180
541 - ATGAACCTTCACTCTGAGTACACCAACTCGTTCGAACAGTTCATCGATCGTGTCATCTGG - 600
181 - M N L H S E Y T N S F E Q F I D R V I W
- 200
601 - GAGAACTTCTACAAGCCCATCGTTTACATCGGTACCGACTCTGCTGAAGAGGAGGAAATT - 660
201 - E N F Y K P I V Y I G T D S A E E E E I
- 220
661 - CTCCTTGAAGTTTCCCTGGTGTTCAAAGTAAAGGAGTTTGCACCAGACGCACCTCTGTTC - 720
221 - L L E V S L V F K V K E F A P D A P L F
- 240
POL STOP
721 - ACTGGTCCGGCGTATTA - 737
241 - T G P A Y X
Secuencia hr1 de AcMNPV
(en negrita, sitios EcoRI)
hr1FOR
1 - ATCGATGATTGACCCCAACAAAAGATTTATAATTAATCATAATCACGAACAACAACAAGT - 60
61 - CAATGAAACAAATAAAACAAGTTGTCGATAAAACATTCATAAATGACACAGCAACATACA - 120
121 - ATTCTTGCATAATAAAAATTTAAATGACATCATATTTGAGAATAACAAATGACATTATCC - 180
181 - CTCGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTACCCGTAAAGCGAGTTTAGTTTTGAAAAACAA - 240
241 - ATGACATCATTTGTATAATGACATCATCCCCTGATTGTGTTTTACAAGTAGAATTCTATC - 300
301 - CGTAAAGCGAGTTCAGTTTTGAAAACAAATGAGTCATACCTAAACACGTTAATAATCTTC - 360
122
Anexo
361 - TGATATCAGCTTATGACTCAAGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGAGATAAGTTTATGAC - 420
421 - ATCATCCACTGATCGTGCGTTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCCAGTTCGGTTATGA - 480
481 - GCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATGACTCATACTTGATTGTGTTTTACGCGTAGA - 540
541 - ATTCTACTCGTAAAGCGAGTTCGGTTATGAGCCGTGTGCAAAACATGACATCAGCTTATG - 600
601 - AGTCATAATTAATCGTGCTGTACAAGTAGAATTCTACTCGTAAAGCGAGTTGAAGGATCA - 660
661 - TATTTAGTTGCGTTTATGAGATAAGATTGAAAAGCGTGTAAAATGTTTCCCGCGCTTGGC - 720
721 - ACAACTATTTACAATGCGGCCAAGTTATAAAAGATTCTAATCTGATATGTTTTAAAACAC - 780
781 - CTTTGCGGCCCGAGTTGTTTGCGTACGTGACTAGCGAAGAAGATGTGTGGACCGCAGAAC - 840
hr1REV
841 - AGATAGTAAAACAAAACCCTAGTATTGGAGCAATAATCGAT - 881
Secuencia del promotor de poliedrina del vector pVL1393
ORF 603
1 - TGTGTGGGTGAAGTCATGCATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAAC - 60
61 - TGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTC - 120
121 - AATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAACAATTATAAATGCTAAATTTGTTTTTTATT - 180
181 - AACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGT - 240
241 - AGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCG - 300
301 - ACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCT - 360
361 - TCTCTTTTTCATTTTTCTCCTCATAAAAATTAACATAGTTATTATCGTATCCATATATGT - 420
421 - ATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATATATATGTCTTTTTTAATGGGGT - 480
AcSp
481 - GTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAACAGTGCTATTTTCTGGTAGTT - 540
541 - CTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATCAATGAATTTGGGATCGTCGG - 600
POLSeqFOR
601 - TTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACACCATTTT - 660
NaeI
661 - TTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTACGAACCGTTAAACAAAAACA - 720
721 - GTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAATAACAG - 780
781 - CCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAGT - 840
ORF 630 PHEcoRV
841 - TGCTGATATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTAC - 900
EcoRV
901 - TGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGT - 960
BglII
961 - CCCACCATCGGGCGCGGATCCCGGGTACCTTCTAGAATTCCGGAGCGGCCGCTGCAGATC - 1020
BamHI
POLSeqREV
1021 - TGATCCTTTCCTGGGACCCGGCAAGAACCAAAAACTCACTCTCTTCAAGGAAATCCGTAA - 1080
1081 - TGTTAAACCCGACACGATGAAGCTTGTCGTTGGATGGAAAGGAAAAGAGTTCTACAGGGA - 1140
1141 - AACTTGGACCCGCTTCATGGAAGACAGCTTCCCCATTGTTAACGACCAAGAAGTG - 1195
121
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