Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) El incremento del contenido en las bases de datos de secuencias de macromoléculas biológicas ha permitido caracterizar y comenzar a entender la distribución y significado de dicha información. En particular, los análisis realizados hasta el momento han revelado que las secuencias de DNA repetidas y dispersas constituyen una gran proporción del genoma de muchos organismos procariotas y eucariotas. La existencia de algunas de estas regiones, pueden explicarse mediante los mecanismos de transposición y retrotransposición. De esta forma, los elementos transponibles constituyen una fuente de cambio para los genomas (Eickbush, 1992; Charleswotr et al., 1994). La primer descripción de la existencia de elementos móviles en el DNA la realizó Barbara McClintock al inicio de los años 50, estudiando la herencia del color y distribución de la pigmentación del maíz (McClintock, 1951). Desde entonces, han sido descriptos un gran número de elementos móviles con capacidad de trasladarse de un lugar a otro dentro del genoma huésped, tanto en organismos procariotas como eucariotas. Además, en base al estudio y dilucidación de los mecanismos que gobiernan su funcionamiento se ha elaborado un sistema de clasificación basado en el tipo de organismo hospedador (procariota o eucariota), en las estructuras terminales que los flanquean (repeticiones terminales invertidas o directas) y en la similitud de secuencias entre genes homólogos, como aquellos que codifican para las transposasas. Transposones procariotas En los procariotas, los elementos genéticos transponibles aparecen tanto en el cromosoma como en los plásmidos. En general, estos elementos están flanqueados por repeticiones invertidas y tienen la capacidad de transponerse de un lugar a otro dentro del cromosoma, dentro de los plásmidos y también entre los plásmidos y el cromosoma. Los elementos transponibles conocidos en bacterias se han clasificado en dos clases, denominadas I y II (Tabla 1, Fig. 1). Los elementos transponibles de clase I fueron divididos en dos subclases: las secuencias de inserción (IS) y los transposones compuestos. Los primeros tienen un tamaño aproximado de 0,3 kpb y en ambos extremos presentan dos secuencias denominadas ITR (Inverted Terminal Repeat). Además, contienen un gen que codifica para una transposasa, la enzima que interviene en el mecanismo de transposición. Se ha observado que estos elementos móviles componen en promedio más del 10 % de los genomas bacterianos conocidos. En cambio, los transposones compuestos tienen un tamaño que oscila entre 2,5 y 10 kpb, presentando en ambos extremos dos elementos IS y, además, contienen genes que codifican para proteínas que les confieren resistencia a diferentes antibióticos. Los transposones de clase II comprenden la familia del transposón 3 (Tn3), con un tamaño de aproximadamente 5 kpb. Estos poseen en los extremos secuencias ITR y, además de contener un gen que codifica para la transposasa, poseen otro gen codificante 2 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) para la enzima resolvasa (res), que lleva a cabo la resolución del cointegrado durante la transposición (cataliza la deconcatenación del DNA en sitios específicos llamados sitios res). Tabla 1. Clasificación y caracterización de los elementos transponibles procariotas. Figura 1. Representación esquemática de los distintos tipos de transposones procariotas. Transposones eucariotas En los organismos eucariotas, los elementos transponibles suelen ser de mayor tamaño que los estudiados en procariotas y, en algunos casos, se transponen mediante una molécula intermediaria de RNA. De acuerdo a su modo de transposición, estos elementos eucariotas se pueden clasificar también en dos grupos (Finnegan, 1992): los elementos de clase I, que se transponen por transcripción reversa de un intermediario de RNA (mediante un mecanismo DNA-RNA-DNA) y los elementos de clase II, que se transponen directamente de DNA a DNA (Tabla 2, Fig. 2). 3 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) En la década del ’90, se ha descripto un nuevo tipo de elementos transponibles, los MITEs (miniature inverted-repeat transposable elements, transposones en miniatura con repeticiones invertidas), que comparten propiedades de las dos clases de elementos antes citados (Wessler et al., 1995). Estos últimos se caracterizan por ser secuencias cortas (100400 pb) con repeticiones invertidas mínimas y sin capacidad codificante. En cuanto a su distribución, están presentes en un alto número de copias (3000-10000) por genoma y en el caso de las plantas, el conjunto de organismos que los poseería en mayor proporción (Casacuberta et al., 1998), se insertan generalmente en las secuencias TAA o TA y se asocian a las regiones regulatorias de los genes. El ejemplo más representativo lo constituyen los elementos encontrados en Arabidopsis thaliana (Casacuberta et al., 1998). Los MITEs se describieron también en Xenopus (Morgan, 1995), Homo sapiens (Morgan, 1995; Smit and Riggs, 1996) y en el mosquito transmisor de la fiebre amarilla Aedes aegypti (Tu, 1997). En todos los eucariotas en los que se han encontrado estos elementos, los mismos han perdido la capacidad de transponerse independientemente. (López et al.,1999; Kidwell and Lisch, 2000). Entre los elementos de clase I, o retrotransposones, se distinguen dos grupos de elementos móviles. El primero incluye a aquellos que no tienen la capacidad de codificar las enzimas necesarias para su transposición, donde se encuentran los elementos SINE (short interspersed elements, elementos cortos de DNA dispersos), que comprenden el 12% del genoma humano y tienen un tamaño aproximado de 130-500 pb. Dentro de este conjunto de elementos se encuentran las secuencias denominadas “Alu” (300 pb), con alrededor de un millón de copias en el genoma humano (Weissenbach and Esnault, 2001). A pesar de no codificar para una transposasa, estas secuencias aún tienen la capacidad de transponer gracias a la acción de enzimas similares derivadas de otros elementos transponibles. Aparentemente, su origen derivaría del gen codificante para el RNA 7SL, el cual está implicado en el movimiento de proteínas en las células, o de otros genes de RNA transcriptos por la RNA polimerasa III. Si bien no se les conoce función aparente, es posible observar grandes cantidades de RNA derivados de esta secuencia en células humanas, posiblemente debido a su proliferación. El segundo grupo incluye a los elementos con capacidad de codificar las enzimas que utilizan para la replicación de sus propias secuencias. Estos elementos pueden ser divididos, de acuerdo a su estructura, en retrotransposones LTR (long terminal repeat, repeticiones largas terminales) y en retrotransposones no-LTR o elementos LINE (long interspersed elements, elemento largo de DNA disperso), representando estos últimos el 14% del genoma humano. En las regiones LTR 5´ existen motivos de secuencia que pueden actuar como regiones promotoras, mientras que en las LTR 3´ se encuentran señales de poliadenilación. Las denominadas secuencias L1 (6500 pb) son las más difundidas dentro de la categoría de elementos LINE (Boeke, 1989) y se caracterizan por presentar en el extremo 3' una cola de poly-A, lo cual revelaría que es una secuencia que se ha transpuesto a partir de una molécula de RNA sintetizada por la RNA polimerasa II (Cruz-Cubas and 4 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Rolland-Burger, 2002). En los elementos no-LTR, algunos de los marcos de lectura codificantes para transposasas carecen de promotores y por ende caen dentro de la categoría de pseudogenes. Sin embargo, otros están completos y actúan de elementos helper para los primeros. Los elementos de clase II tienen aproximadamente 1-3 kpb de longitud con secuencias terminales de 10-30 pb en orientación repetida e invertida, aunque algunos elementos tienen repeticiones de aproximadamente 300 pb. Dentro de los límites dados por las repeticiones terminales existe un marco de lectura abierto que codifica para una proteína denominada transposasa, la cual cataliza la escisión precisa del transposón y su subsiguiente reinserción en otro sitio cromosomal (conocida como reacción de “corte y pegado”). A esta clase pertenecen los transposones P de Drosophila melanogaster (Engels, 1989), Ac/Ds de Zea mays (Kunce, 1996) y piggyBac detectado en baculovirus pero procedente de lepidópteros (Shimizu et al., 2000). Los transposones de clase II son excelentes candidatos para generar vectores de transferencia genética, debido a que son activos en un amplio rango de organismos. Tabla 2. Clasificación y caracterización de los elementos transponibles eucariotas. 5 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Figura 2. Representación esquemática de los distintos tipos de transposones eucariotas. Mecanismos de transposición Los mecanismos de transposición que sólo involucran DNA pueden comprenderse mediante dos modelos: el modelo replicativo y el no replicativo. El primero implica que durante el evento se genera una copia del elemento transponible (Fig. 3). Este proceso genera una unión covalente entre el elemento transponible y el sitio blanco (target), el cual puede ser seleccionado al azar o no, disparando la síntesis localizada de DNA y generando dos copias de la secuencia. Una de ellas será insertada en el sitio target, mientras que la otra permanecerá en el lugar de origen. 6 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Figura 3. Representación esquemática del modelo replicativo para explicar el mecanismo de transposición en el cual se hace una copia del elemento transponible. En el modelo no replicativo (Fig. 4), conocido como de “corte y pegado” (cut & paste), la transposasa se une a los dos extremos repetidos e invertidos del transposón permitiendo que estos puedan unirse mientras cataliza el proceso de recombinación. Esta enzima corta los extremos y cataliza un ataque directo de los mismos sobre el sitio target, rompiendo dos enlaces fosfodiéster cercanos, para ligar posteriormente la hebra del DNA target con los extremos del transposón (Alberts et al., 1994). En la mayoría de los organismos las transposasas requieren de proteínas adicionales de la maquinaria celular para poder realizar este proceso, proteínas que ayudan al ensamblaje de complejos nucleoproteicos, proteínas que aumentan la afinidad de unión por el DNA o proteínas que intervienen en la localización del sitio target. Además, también son necesarias otras proteínas celulares para la reparación de los nicks que quedan una vez que el transposón se insertó en el sitio target. 7 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Figura 4. Representación esquemática del modelo no replicativo de “corte y pegado”, para explicar el mecanismo de transposición en el cual no hay duplicación del elemento transponible. El tercer mecanismo postulado involucra a los retrotransposones (Fig. 5). En este conjunto de elementos, el proceso involucraría en un primer paso la transcripción utilizando al LTR 5´ como promotor. Luego, a partir de ese mRNA se sintetiza la proteína polimerasa, quien posteriormente se encarga de copiar el RNA a DNA. Para iniciar este proceso la enzima requiere de un oligonucleótido que actúe como primer, y en general, ese papel lo cumplen ciertos tRNAs celulares que hibridan en la región LTR. El RNA del híbrido resultante es luego degradado por la actividad RNAsa H presente en la misma polimerasa. Posteriormente, se sintetiza la segunda cadena de DNA utilizando como primer un extremo de la molécula de ssDNA. Y por último, el dsDNA producido se integra en el sitio blanco del genoma a través de la acción de la proteína integrasa codificada por el mismo elemento transponible. 8 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Figura 5. Representación esquemática del proceso de transposición de los retrotransposones. Elementos transponibles y evolución La fracción no codificante del genoma de los vertebrados, ampliamente mayoritaria, comprende tres tipos de secuencias: únicas, repetidas en serie y agrupadas, y otras repetidas y dispersas (Cruz-Cubas, 2002). Durante décadas las secuencias repetidas dispersas se han calificado como elementos que se mantienen en el genoma solamente por su posibilidad de replicarse junto a él. Sin embargo, estos elementos repetidos, con capacidad de duplicarse para moverse de un lugar a otro del genoma y para provocar reordenamientos, posibilitan sin duda una importante flexibilidad y capacidad evolutiva en los genomas huéspedes. Se ha demostrado que estas secuencias interactúan activamente con el genoma y pueden desempeñar diversas funciones, entre las que se encuentra la regulación de la expresión de genes, la activación e inactivación de genes por inversiones cromosomales, la adquisición de genes mediante transferencia horizontal y el reordenamiento genómico (Jurka, 1998). Muchos ejemplos demuestran que la inserción de elementos transponibles actúa como una fuente de variación que conduce a cambios útiles, seleccionados positivamente, que son mantenidos en el curso de la evolución de distintas especies. 9 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) Se estima que la mayor parte de las secuencias repetidas tienen una antigüedad superior a los 100 millones de años. En la actualidad, los genomas de todas las especies procariotas y eucariotas conocidas contienen un número significativamente grande de elementos transponibles. Como ejemplos, más del 22% del genoma de Drosophila melanogaster está compuesto por DNA móvil y aproximadamente el 50% del genoma humano esta compuesto por elementos transponibles. Los retrotransposones LINE son la subclase mayoritaria en el genoma humano (14%), mientras que los retrotransposones LTR (secuencias homólogas a algunos retrovirus) representan el 8% del genoma humano y los transposones de clase II, el 3% del mismo (Cruz-Cubas, 2002). Estos últimos se asemejan a sus homólogos bacterianos y quizás cuando eran activos en el genoma humano provocaron redistribuciones inter e intracromosómicas importantes. En el curso de la evolución, los elementos transponibles acumularon probablemente características que aumentaron su capacidad de incrementar el número de copias, hasta alcanzar en la actualidad la gran distribución que presentan dentro de algunos genomas. Bajo esta premisa, se los ha implicado en, al menos, dos niveles de selección, una a nivel positiva y otra negativa. La primera se basa en la capacidad de las secuencias de los elementos transponibles de replicarse mucho más que el genoma huésped, constituyendo la base de la “hipótesis del DNA parásito” o “DNA egoísta”, aumentando la flexibilidad del genoma. La selección negativa se produce comúnmente como causa de mutaciones insercionales inducidas por los elementos transponibles, que son deletéreas para el huésped; o como causa de recombinación entre secuencias homólogas de elementos transponibles localizadas en regiones no homólogas del genoma (Kidwell and Damon, 2000). Algunas de estas secuencias pueden ser consideradas como neutrales, dado que no producen ninguna selección, especialmente cuando los elementos transponibles son inactivos. Respecto de la hipótesis de la selección positiva surgieron dos posturas diferentes. Una asegura que es un fenómeno muy raro como para impactar en la evolución del huésped (Charlesworth et al., 1994). La otra, postula que los elementos móviles generan efectos beneficiosos más que cambios perjudiciales (Deininger, 1989). En los últimos años, gracias a los análisis moleculares realizados sobre los elementos transponibles se modificaron las dos posturas. Si bien se acepta que pueden ser descriptos como parásitos genómicos, también se reconoce que las mutaciones inducidas contribuyen a la evolución de su huésped (Kidwell and Damon, 2000). En distintos organismos, existe una amplia variación en el número de copias, distribución y tipo de elementos transponibles de una especie a otra y, en general, comprenden una gran fracción del genoma de muchos animales y plantas (Smit and Riggs, 1996). Incluso, a través de los años, las inserciones de los elementos móviles pueden ser la causa del incremento en el tamaño de algunos genomas (San Miguel et al., 1998). Respecto de esta característica se han planteado dos modelos. Uno de ellos postula que el hecho que estos elementos ocupen una gran fracción de los genomas se convierte en suficiente evidencia para confirmar la ausencia de cualquier rol importante en la evolución de los organismos 10 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) huéspedes (Henikoff et al., 1997). Por lo contrario, el otro modelo plantea que la alta distribución es la clara manifestación de los beneficios evolutivos que implica la flexibilidad del genoma (Henikoff et al., 1997). Existe evidencia de que los cambios en la longitud de intrones y en la cantidad de otros DNA no codificantes son generados por cambios en las frecuencias de inserción y deleción del genoma (Petrov et al., 1996; Gregary and Herbert, 1999). Por lo tanto, un genoma eucariota existiría en un equilibrio dinámico, con el potencial para cambios masivos en su tamaño, balanceado por la existencia de mecanismos de control codificados por el huésped, tales como la metilación del DNA y la autorregulación de los transposones. El silenciamiento transcripcional de genes, asociado con la metilación, refleja una defensa del genoma contra los elementos transponibles. Debido a las semejanzas entre el silenciamiento de genes dependiente de homología y otros fenómenos como el silenciamiento transcripcional de genes por elementos transponibles, podría deducirse que los transposones han influido en la evolución de los sistemas de regulación de genes complejos (Kidwell and Lisch, 2000). En general, los elementos transponibles se encuentran en todos los compartimientos genómicos ya que pueden moverse a cualquier lugar del genoma debido a que la mayoría de los sitios target consisten en pocos pares de bases. Sin embargo, no están distribuidos al azar, sino que son observados frecuentemente en regiones reguladoras o de heterocromatina. Una excepción son la mayoría de los transposones del genoma humano, cuya actividad global ha disminuido en los últimos millones de años (Weissenbach, 2001). La mayoría de los elementos transponibles humanos son inactivos transcripcionalmente y serían mucho más antiguos que los presentes en otros organismos eucariotas, lo que les permite tener una mayor densidad de los mismos en la eucromatina. En cambio, en ratones y moscas los DNA móviles serían mucho más recientes, pues tienen una mayor actividad y siguen siendo un importante “motor de la evolución”, ya que al transportar con ellos secuencias adyacentes pueden contribuir a crear nuevas regiones reguladoras, cambiando la estructura de los genes, creando nuevos genes y modificando la arquitectura general del genoma. Bajo condiciones ecológicas y genómicas estables la velocidad de transposición de los elementos transponibles es relativamente baja. Por otra parte, las velocidades de transposición en cepas de laboratorio son uno o dos órdenes de magnitud menores que las derivadas de las poblaciones naturales. De acuerdo a la descripción sugerida por McClintock acerca de que la reestructuración del genoma mediada por la actividad de elementos transponibles puede ser un componente esencial de respuesta del huésped al estrés, facilitando la adaptación de la población a los cambios del ambiente (McClintock, 1951), los elementos transponibles deben cumplir tres condiciones esenciales: 1. Ser capaces de responder al estrés aumentando su actividad transcripcional y transposicional. 2. El aumento de su movilidad debe ser suficiente para generar una variación genética en el genoma huésped. 11 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) 3. Esta nueva variabilidad genética debe ser transmisible de una generación a la siguiente. Respecto de estas tres características, aún subsisten algunas inconsistencias. En primera instancia, no todos los tipos de elementos transponibles son capaces de activar su transposición debido al estrés. Por otra parte, muchos de los casos reportados de movilización inducida por estrés se dieron en tejidos somáticos solamente y una adaptación a largo plazo del huésped a cambios del medio ambiente requeriría necesariamente de modificaciones germinales (Capy et al., 2000). Elemento transponible piggyBac El elemento piggyBac es parte de la clase II de transposones que fueron encontrados en lepidópteros. Inicialmente fue identificado por su asociación con una mutación causante del fenotipo FP (few polyhedra, pocos cuerpos de oclusión poliédricos o pocos poliedros), debida a su inserción en el gen 25 K de los Nucleopoliedrovirus (NPV, o virus de la poliedrosis nuclear) de Autographa californica (AcMNPV) y Galleria mellonella, luego del pasaje seriado de los virus en la línea celular TN-368 del lepidóptero Trichoplusia ni (Fraser et al., 1983). El piggyBac se encuentra disperso y repetido en el genoma de esta línea celular y en muchos otros organismos no tan relacionados. La mutación FP confiere un fenotipo dominante para los virus bajo condiciones de propagación en cultivo celular, caracterizado por un incremento de los virus brotantes extracelulares infecciosos (ECV) y una disminución en la formación de los cuerpos de oclusión (OB). Esto se debe a que la inserción interrumpe el gen que codifica para la proteína 25K, la cual se presume tiene un rol en el ensamblaje “de novo” de envolturas intranucleares, requeridas para la eficiente oclusión de viriones en el núcleo de las células infectadas. Como consecuencia, la encapsulación de los viriones en OBs es mucho menos eficiente en células infectadas con mutantes FP, lo que lleva a una disminución en el número de OBs por célula. Esta característica permite distinguir fácilmente a los mutantes FP de los virus wilde type (MP [multiple polyhedra], muchos cuerpos de oclusión poliédricos o muchos poliedros) mediante ensayos de plaqueo sobre células huésped susceptibles. El piggyBac es un transposón de ~2,5 kpb de largo, conteniendo secuencias terminales repetidas invertidas (ITRs) de 13 pb y repeticiones subterminales de 19 pb, localizadas a 31 pb del ITR 3’ y a 3 pb del ITR 5’, y un marco de lectura abierto de 2,1 kpb. Es parte de una subclase de elementos originalmente encontrados en lepidópteros que tienen un sitio target de inserción exclusivo, TTAA, que es duplicado luego de la inserción. Aparte de esto, los elementos TTAA dependientes no parecen compartir otras identidades estructurales aparentes (Cary et al., 1989). Mediante ensayos de transposición en líneas celulares se encontró que el piggyBac funciona autónomamente (Fraser et al., 1995, 1996) y mediante ensayos de expresión transitoria en embriones se sabe que funciona en varios órdenes de insectos, con 12 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) velocidades de movimiento similares en diferentes especies de dípteros y lepidópteros (Elick et al., 1995; Tamura et al., 2000). Esto sugiere que los vectores basados en piggyBac pueden mediar la transformación de líneas germinales en estos y, potencialmente, en otros órdenes. El uso de una transposasa helper no modificada, bajo el control del promotor del piggyBac, demostró que el transposón retiene funciones autónomas, debido a que la regulación transcripcional y la actividad enzimática se mantienen. El elemento piggyBac fue empleado primero para transformar la mosca de la fruta del mediterráneo Ceratitis capitata, utilizando un vector con un gen indicador (ojos blancos, we) y un helper conteniendo la transposasa del piggyBac autorregulada (bajo su propio promotor) (Handler et al., 1998). Las frecuencias de transformación, medidas como los embriones G0 inyectados que desarrollaron en adultos fértiles, fueron relativamente bajas (aprox. 3-5% por G0->fértil). Aún cuando la proporción fue baja, este experimento demostró la funcionalidad enzimática y transcripcional del piggyBac en un órden de insecto diferente del huésped original. Las transformaciones de insectos con transposones anteriores al piggyBac utilizaban vectores de dípteros para transformar el mismo o diferentes organismos, la mayoría con un helper regulado por promotores activables por shock térmico como hsp70. Drosophila melanogaster fue transformada con piggyBac en una frecuencia similar, aunque el uso de un helper regulado por hsp70 aumentó la frecuencia a 26% (Handler and Harrell, 1999; Li et al., 2001). El piggyBac se utilizó también para transformar la mosca de la fruta Caribbean sp. (Handler and Harrell, 2001), la mosca de la fruta Oriental Anastirepha suspensa (Handler and Harrell, 2001) y la mosca Bactrocera dorsalis (Handler and McCombs, 2000). Este elemento también funcionó en otros órdenes de insectos, tales como Lepidópteros, incluyendo Bombyx mori (Tamura et al., 2000) y Pectinophora gossypiella (Peloquin et al., 2000), y Coleópteros como Tribolium castaneum (Berghammer et al., 1999). Existe también evidencia preliminar de la transformación de los mosquitos Aedes aegypti (Fraser and Lobo, sin publicar), del vector de la malaria sudamericana Anopheles albimanus (Perera, 2002; Harrell and Handler, 2002), de líneas germinales de Musca domestica (Hediger, 2001) y de Anopheles gambiae (Genelle et al., 2000). En la actualidad, este elemento es ampliamente empleado como vector para la transformación de una gran variedad de insectos y, dado su amplio rango de funcionamiento, podría llegar a ser activo en muchas otras especies aún no analizadas. Un interesante descubrimiento en la mosca de la fruta Oriental fue la detección de diez o más elementos piggyBac en el genoma de la cepa huésped, obteniéndose secuencias de productos de PCR de ~1,5 kpb que mostraban una identidad cercana al piggyBac de Trichoplusia ni (Handler and McCombs, 2000). La existencia del elemento transponible en organismos relacionados, aún de distintos géneros, no es rara, debido a la función autónoma del mismo. El movimiento interorganismo debe haber ocurrido mediante transmisión horizontal. Se tienen evidencias 13 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) preliminares de la existencia del piggyBac en otros organismos no relacionados, pero no se sabe nada acerca de la divergencia de estos elementos (Handler, 2001). Si en la especie huésped utilizada para la transferencia genética, existen el piggyBac o elementos relacionados, la estabilidad transgénica puede estar comprometida. Hasta ahora, las integraciones en Bactrocera dorsalis tienen una estabilidad de más de diez generaciones (Handler, 2001). Sin embargo, estas consideraciones no son una gran desventaja, ya que estos elementos endógenos pueden ser detectados mediante hibridación y PCR, y los sistemas de movilización cruzada pueden ser detectados mediante ensayos de movilidad. Una consideración más preocupante es el potencial para la transmisión horizontal del transgen a organismos no target. Aunque los transgenes deben ser no autónomos (o inmóviles en ausencia de la transposasa), pueden ser transferidos fortuitamente por organismos intermediarios, tales como Baculovirus, a organismos no target que tienen la transposasa funcional. Los informes iniciales han descripto a todas las inserciones del piggyBac como eventos de transposición precisos de “corte y pegado” en el sitio target, TTAA, el cual resultó duplicado luego de la reacción. Pero, recientemente se han descripto eventos de transposición excepcionales en donde se insertaron múltiples copias del piggyBac en tandem; además, este complejo de integración llevó incorporado secuencias del plásmido helper conteniendo la transposasa del piggyBac (Grossman et al., 2000; Adelman et al., in press). Esta diferencia puede deberse a mecanismos de transposición no canónicos o a mecanismos de recombinación no relacionados con la transposición (O’Brochta et al., 2003). Respecto de la removilización, se reportaron casos en Drosophila melanogaster y en Tribolium castaneum, aunque también hay eventos no muy documentados de removilización en mosquitos (O’Brochta et al., 2003). Transformación de genes en insectos La transformación de líneas germinales de insectos con importancia en la agricultura ha sido un campo de investigación intensa durante los últimos años; siendo los vectores derivados de elementos transponibles muy útiles para manipular el genoma de estos insectos, encontrando, aislando y analizando sus genes para realizar modificaciones genéticas con el propósito de controlar insectos que son plagas. También, los estudios de desarrollo embrionario tomando como modelo a los insectos es otro importante campo de aplicación de los transposones. Drosophila melanogaster fue uno de los primeros organismos en ser transformado rutinariamente y trece años después se realizó la transformación de la mosca de la fruta del Mediterráneo mediada por el elemento Minos (Loukeris et al., 1995). Los vectores genéticos basados en el elemento P para transgénesis estable de Drosophila melanogaster no funcionan en insectos de otro género (Handler et al., 1993). El descubrimiento de otros elementos con un amplio rango de huésped, tales como Mariner (Mos 1), Minos, Hermes y piggyBac, ha llevado al desarrollo de 14 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) sistemas de vectores capaces de transformar una gran cantidad de órdenes, géneros y especies de insectos. Por otra parte, en los últimos años, se han aislado y caracterizado otros elementos transponibles de la familia Tc1/mariner con capacidad para transponer con gran eficiencia distintos vertebrados, desde peces y anfibios hasta mamíferos (Horie et al., 2003; Ivics, 1997) El uso del elemento P en Drosophila melanogaster sirvió como base teórica y práctica para muchos de los sistemas de transformación que se encuentran actualmente en uso para otros insectos. Con estos ensayos se demostró que un elemento P completo en un plásmido podía transponerse en un genoma de insecto. Además, se verificó que la transposasa obtenida a partir de este elemento podía actuar en trans a modo de helper para catalizar la transposición de elementos defectivos conteniendo las secuencias terminales intactas pero el gen de la transposasa no funcional. El primer sistema de transformación binario vector/helper en Drosophila melanogaster consistió en la introducción de un gen marcador, como el gen de color de ojos rosy+, dentro de un elemento defectivo para crear un vector cuya transformación pudiera ser fácilmente monitoreada en una cepa mutante que no tuviera dicho gen (Rubin and Spradling, 1982). La transformación mediada por el elemento P, y la de todos los sistemas constituidos por transposones desarrollados desde entonces, utilizan un sistema binario similar donde los plásmidos vector y helper son coinyectados en preblastodermos de embriones antes de la formación del polo celular (polo posterior del cigoto donde se localizan las células germinales primordiales antes de la formación del blastodermo). Los plásmidos se introducen en el núcleo y tienen el potencial de facilitar la transposición del vector en el cromosoma de la línea germinal. Algunos de los helpers originales fueron elementos P autónomos, estructuralmente completos, que podían integrarse junto con el vector, lo que aumentaba la posibilidad de removilización del mismo. Esta probabilidad fue eliminada con nuevos helpers que contenían uno o ambos extremos delecionados (referidos como “sin brazos”) (Karess and Rubin, 1984). El elemento Minos, aislado de Drosophila hydei, fue el primer transposón utilizado para la transformación de líneas germinales de insectos de géneros diferentes a Drosophila (Handler, 2001; Atkinson, 2002). Uno de los mayores problemas en el desarrollo de sistemas de mutagénesis mediante transposones es, como se mencionó anteriormente, que algunos elementos necesitan de factores accesorios del huésped para una transposición eficiente (como el elemento P de Drosophila melanogaster) (Berg and Berg, 1983; Kleckner, 1991). Por esta razón, muchos de ellos no tienen una actividad completa en especies poco relacionadas que carecen de proteínas suficientemente similares a los factores esenciales. Una solución a este problema es utilizar transposones nativos, por lo que en la actualidad los vectores en desarrollo para insectos de órdenes distintos a Drosophila derivan de transposones que pertenecen a familias de elementos ampliamente distribuidas. En particular, estos tienen la capacidad de funcionar en huéspedes foráneos, lo que los ha hecho atractivos para el desarrollo de 15 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) vectores para transgénesis (Zhang et al., 2000). Esta distribución de los elementos móviles entre distintas especies demuestra que los mismos tienen la capacidad de cruzarse entre especies relacionadas y propagarse exitosamente en un nuevo huésped (Capy et al., 1997; Bushman, 2002). Esta característica es también llamada “hipótesis de la transferencia horizontal”. Desafortunadamente, el tamaño y la distribución de estas familias de elementos hace posible que el insecto target usado como huésped en un experimento de transformación pueda contener un sistema transponible de la misma familia, lo cual podría comprometer la efectividad del vector por varias razones. Primero, los transposones se pueden insertar en copias nativas por recombinación homóloga, más que en sitios nuevos por medio de mecanismos de transposición. Segundo, la transposasa producida por elementos endógenos puede desestabilizar transgenes y elementos heterólogos integrados. Tercero, la transposasa perteneciente al sistema de vectores usada en la creación del insecto transgénico puede causar el movimiento de elementos transponibles endógenos, dando como resultado una mutación o reducción de la viabilidad. Finalmente, la transposasa proveniente del elemento transponible endógeno puede interferir con el funcionamiento de la transposasa asociada al sistema de vector, bloqueando sitios de unión a través de la formación de multímeros de transposasa no funcionales, y reduciendo así la frecuencia con la que son producidos los animales transgénicos (Sundararajan et al., 1999). Debido a estas razones, la elección de un transposón como sistema de transgénesis de insectos debe estar influenciada por la posibilidad de que el mismo pueda interactuar con elementos endógenos. El potencial de esta interacción y la desestabilización del vector sugieren que el insecto huésped debe ser examinado para verificar si posee en su genoma elementos transponibles pertenecientes a una familia relacionada con el elemento usado como vector. Para probar la funcionalidad de un transposón en insectos es necesaria la disponibilidad de sistemas de selección de resistencia a drogas para los transformantes. El sistema más usado es el gen codificante para Neomicina fosfotransferasa II (NPT) bacteriana, que permite a los transformantes sobrevivir bajo dosis letales de neomicina o de sus análogos (G418 o Geneticina) (Steller and Pirrotta, 1985; Ashburner et al., 1998). Actualmente, existen variantes que permiten la selección con distintos antibióticos, tales como Zeocina, Blasticidina, etc. Los ensayos que permiten una evaluación rápida y eficiente de los transposones como vectores de transformación en huéspedes nuevos son una ayuda considerable, debido a que los experimentos de transformación de insectos de otros géneros distintos a Drosophila no son muy conocidos. Los ensayos originales monitorean la escisión del transposón a partir de un plásmido, y los ensayos subsiguientes monitorean la escisión del transposón a partir del plásmido donor y la inserción en un plásmido target. El primero de estos experimentos se desarrolló para el elemento P sobre un cultivo de células de Drosophila melanogaster (Rio et al., 1986). También se han desarrollado ensayos de transposición para los elementos hobo y Hermes (O’Brochta et al., 1994, 1996; Pinkerton et al., 1996; Sarkar et al., 1997), se han reportado ensayos de transposición y escisión para Mariner (Coates et al., 1995, 1997) 16 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) y más recientemente para el elemento piggyBac en embriones de varios géneros de insectos (Lobo et al., 1999; Thibault et al., 1999; Klinakis et al., 2000). En la actualidad existen cuatro sistemas de vectores de transferencia de genes, Mos-1mariner, Hermes, Minos y piggyBac utilizados para transformar especies de insectos con importancia en la agricultura. El desarrollo exitoso de estos sistemas de transferencia ayuda a la generación de insectos transgénicos y a la investigación de su utilidad como herramientas para el control de plagas de insectos. Estos elementos pertenecen a cuatro familias distintas de la clase II de elementos móviles, los cuales se integran en el genoma del insecto mediante el mecanismo de “corte y pegado” (Eggleston and Zhao, 2001; Atkinson, 2002). 17 Seminario de Investigación:Carolina Cerrudo (Director: M. Belaich, P. D. Ghiringhelli) REFERENCIAS • Adamczak, Porollo, A., Meller, J. (2004). Combining prediction of secondary structure and solvent accessibility in proteins. Proteins: Structure, Function, and Genetics 59, 467-475. • Adamczak, R., Porollo, A. and Meller, J. (2004). Acurate prediction of solvent accessibility using neural networks based regression. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 56, 753-767. • Adelman, Z., Jasinskiene, N., Vally, K., Peek, C., Travanty, E., Olson, K., Brown, S., Stephens, J., Knudson, D., Coates, C. and James, A. (2004). Formation and loss of large, unstable tandem arrays of the piggyBac transposable element in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. 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