Western Blot

Western Blot
Introducción y Optimización
10 Abril 2013
Ariana Veiga
Western Blot
¿En qué
consiste el
Western
Blot?
• También llamado Inmunoblot
• Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene
varias proteínas
• Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su
¿Cómo
funciona?
•
•
peso molecular
A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés
El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad
relativa en la muestra
Calle 1:
Anticuerpo anti- β Actina (ab8226) diluido 1/1000
Calle 2:
ab8226 diluido 1/10000
Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500
Calle 1:
Lisado celular HeLa (humano)
Calle 2:
Lisado celular HeLa (humano)
Calle 3:
Lisado celular HEK293 (humano)
Calle 4:
Lisado celular 3T3 (ratón)
2
¿En qué casos es útil utilizar
Western Blot?
¿Está la proteína de interés presente en mi muestra?
El tratamiento con un determinado agente “X”,
¿aumenta o reduce el nivel de expresión de mi
proteína?
¿Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en
distintos tejidos o líneas celulares?
¿Mi muestra es sana o patológica? El WB permite
detectar enfermedades tales como la enfermedad de
Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.…
3
Organización del Webinar
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
4
Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
5
Preparación de las muestras para la
electroforesis
Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se
degradan mecánicamente para liberar las proteínas
•
Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por
cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC
•
Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente
en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido).
Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después
durante 2 horas a 4 ºC
•
Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo
6
Lisis
Mantener las muestras en hielo o a 4ºC para evitar degradación de las proteínas
Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en frío. Antes de realizar la
lisis, añadir al tampón un cocktail de inhibidores de proteasas
Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de
fosfatasas al tampón de lisis
Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína
de interés
Localización de la proteína
Tampón de lisis recomendado
Célula entera
NP-40 o RIPA
Citoplasmática (soluble)
Tris-HCl
Citoplasmática (citoesqueleto)
Tris-Triton
Membranal
NP-40 o RIPA
Nuclear
RIPA
Mitocondrial
RIPA
7
Preparación de las muestras para la
electroforesis
Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se
degradan mecánicamente para liberar las proteínas
• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis
(~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC
• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar
inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl
por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300
µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC
• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo
Determinar la concentración de proteínas
Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente
tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas
(dímeros, estructuras terciarias)
• Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100ºC o
durante 5-10 minutos a 70ºC
8
Condiciones reductoras y
desnaturalizantes
Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y βmercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
• El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de
cargas negativas
• El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los
puentes disulfuro
• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular
mediante SDS-PAGE
• La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del
anticuerpo a su sitio de unión
SDS y DTT/
β-mercaptoetanol
Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las proteínas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o β-mercaptoetanol o
DTT no deben añadirse a los tampones.
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
10
SDS-PAGE
Definición
Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico
de acuerdo a su movilidad electroforética
SDS : Dodecilsulfato Sódico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida
11
SDS-PAGE
•
•
¿Cómo
funciona?
•
•
•
•
El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el
tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris;
190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre
20 y 40 µg por calle
Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas
hacia el polo positivo
Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas
endógenas de las mismas son despreciables
El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o
peso molecular
Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del
gel y por tanto migran mas rápidamente
Corriente eléctrica
Frente de migración
+
12
Geles
Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de
amonio (APS) y TEMED
La estructura del gel puede modificarse alterando la proporción de acrilamida
Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un porcentaje elevado de
acrilamida, y viceversa para proteínas de gran tamaño
Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamaño
de la proteína es desconocida
Tamaño de la proteína (kDa)
Porcentaje del gel
4-40
20
12-45
15
10-70
12,5
15-100
10
25-200
8
13
Electroforesis en condiciones no
reductoras y/o no desnaturalizantes
Forma requerida de Condiciones
la proteína
electroforesis
Tampón de carga
Tampón de
migración
ReducidaDesnaturalizada
Reductor y
Con ß-mercaptoetanol
desnaturalizante o DTT
Con SDS
Con SDS
Reducida - Nativa
Reductor no
desnaturalizante
Con ß-mercaptoetanol o Sin SDS
DTT
Sin SDS
Oxidada –
Desnaturalizada
No reductor y
desnaturalizante
Sin ß-mercaptoetanol ni
DTT
Con SDS
Con SDS
Oxidada - Nativa
No reductor y
nativo
Sin ß-mercaptoetanol ni
DTT
SinSDS
Sin SDS
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
15
Objetivo de la transferencia
Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés
para poder visualizarla
El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas
•
•
Los anticuerpos no son retenidos en el gel
Los geles son frágiles y difíciles de manipular
Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado
16
¿Cómo funciona la transferencia?
El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas
negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico
Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo
Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que
en el gel
Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF).
Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol
Montaje de la transferencia
17
¿Transferencia en medio
húmedo o semi seco?
Ventajas
•
•
Medio
Húmedo
•
•
Semi
Seca
•
•
El gel y la membrana se intercalan y fijan
firmemente entre finas esponjas y papel
absorbente
Este montaje “sándwich” se sumerge en un
compartimento que contiene el tampón de
transferencia donde se aplica a continuación
la corriente eléctrica
Un tampón de transferencia se compone
normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina
y 20% de Metanol
Inconvenientes
El proceso de
Adecuado
para proteínas transferencia es
más largo
grandes o
difíciles de
transferir
Más rápido
El montaje papel-gel-membrana-papel se
humedece con tampón de transferencia
El montaje se coloca directamente entre el
cátodo y el ánodo donde se aplica la corriente
El tampón de transferencia estándar suele
contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04%
SDS, y 20% Metanol
La membrana
puede secarse
afectando a la
transferencia de
las proteínas
18
Transferencia de proteínas >100 kDa
Transferencia en medio húmedo durante la noche a 4 ºC y bajo voltaje
Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de
aglomerados en el gel
Reducir la cantidad de metanol en el tampón de transferencia a 10% o incluso
menos para evitar la dispersión de proteínas en el gel
Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del
tampón (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
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¿Por qué se utilizan anticuerpos?
Colorantes como Coomassie pueden
usarse para teñir las proteínas
después de realizar el SDS-PAGE
SDS3
Pero, ¿cuál de las bandas
corresponde a la proteína de interés?
El uso de anticuerpos específicos
soluciona el problema detectando
únicamente la proteína de interés
Lisado celular de SDS3 transfectado
(ab94303) en SDS-PAGE (izquierda)
y en Western Blot con el anticuerpo
ab89345 anti-SDS3 (derecha).
21
Inmunodetección
Bloqueo de la
membrana
Leche, BSA, etc…
Epítopo
Incubación con el
anticuerpo primario
Proteína
Proteína
Anticuerpo
Lavado (TBST)
Incubación con
anticuerpo secundario
conjugado
Proteína
Proteína
Anticuerpo
Lavado (TBST)
Detección
Proteína
22
Detección
Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol)
Producto (sensible a la luz)
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo
secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en
una película fotográfica
Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las
enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la
membrana próximo a la zona del anticuerpo
Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse
siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial
ECL : Enhanced chemiluminescence
DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
HRP : HorseRadish Peroxidase
AP : Alkaline Phosphatase
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
24
Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de
SDS PAGE es constante
Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares
independientemente del tipo de muestra
Control de carga
Tipo de
muestra
Peso molecular
(KDa)
Precauciones
β Actina
Célula entera /
Citoplasma
42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en
las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los
componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de
la proteína actina (Farmer et al, 1983)
GAPDH
Célula entera /
Citoplasma
Tubulina
Célula entera /
Citoplasma
55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a
sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al,
1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porinas
Mitocondria
31
COXIV
Mitocondria
16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que
COXIV
Lamin B1
Núcleo
66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la
membrana nuclear
Proteína de unión
a TATA (TBP)
Núcleo
38 No es válido para muestras sin ADN
30-40 Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan
el nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares
25
Controles de carga
Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o
recombinante), etc…
Todas las calles - anticuerpo anti - Actina – control de
carga (ab8227) diluído 1/1000
Calle 1:
Células HeLa (humano) a 20 µg
Calle 2:
Células 3T3 (ratón) a 20 µg
Calle 3:
Hígado de pescado a 20 µg
Calle 4:
Hígado de conejo a 20 µg
Calle 5:
Células MDCK (perro) a 20 µg
Calle 6:
Células EBTr (bovino) a 20 µg
Calle 7:
Células SL-29 (pollo) a 20 µg
Calle 8:
Células CHO (Hamster chino) a 20 µg
Calle 9:
Embrión de Xenopus a 20 µg
26
Controles positivos y negativos
Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras
en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de
interés
•
•
•
Proteína recombinante
Células transfectadas con la proteína de interés
Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína
Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar
•
•
Muestras knockout o siRNA
Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína
27
Péptidos de bloqueo
La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de
manera específica los sitios de unión del anticuerpo
Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no
puede unirse a la proteína en la membrana
Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la
proteína o proteínas no específicas
Todas las calles:
Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml
Calle 1:
Preparado de Histona, células HeLa
Calle 2:
Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida
Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo
Histona H3 – fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml
Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg
con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
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Adecuado para Western Blot
Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot
Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la
ficha técnica del anticuerpo
30
Inmunógeno y especificidad
Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal
para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella
La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre
una región específica de la proteína (epítopo)
Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés
cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un
precursor de la misma – si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína
NERTCRCDKP
NERTCRCDKP
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Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
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Ausencia de bandas,
o bandas muy débiles
Origen del problema
Solución
Incompatibilidad con el anticuerpo
secundario
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea
compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo
primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratón
con anticuerpo primario IgM hecho en ratón)
No hay suficiente proteína o
anticuerpo para producir una señal
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo
primario o de anticuerpo secundario (incluso una
combinación de los tres)
Tiempo de incubación insuficiente
para producir una señal
Incubar la membrana con el anticuerpo primario
durante la noche a 4ºC
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente
de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al
tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo
al agente de bloqueo
La proteína no se ha transferido
correctamente del gel a la
membrana
Comprobar que se ha producido la transferencia
usando un colorante como rojo de Ponceau. Es
posible que sea necesario aumentar o disminuir el
tiempo de transferencia
Las proteínas hidrófobas son más
difíciles de transferir
Para este tipo de proteínas usar membranas de
PVDF
La muestra no expresa la proteína
de interés
Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína
de interés
El anticuerpo no reconoce la
proteína de interés
Verificar que la secuencia del inmunógeno está
presente en la proteína a estudiar
33
Ruido de fondo
Origen del problema
Solución
Exceso de lisado celular, anticuerpo
primario o secundario que provocan
uniones no específicas
Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más
los anticuerpos
Temperatura de incubación del
anticuerpo primario muy elevada
Incubar durante la noche a 4ºC
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un
detergente, como Tween 20, al tampón de lavado.
Probar otro agente de bloqueo
Uso de una membrana no
adecuada
Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos
ruido de fondo que las membranas de PVDF
Degradación de la proteína
Optimizar la preparación de la muestra. Mantener
las muestras en hielo y añadir una solución recién
preparada de inhibidores de proteasas.
Almacenamiento de muestras a largo plazo puede
dañar las proteínas
Presencia de isoformas o
Consultar la literatura y SwissProt
fragmentos de la proteína de interés
Presencia de polímeros
Hervir las muestras durante 10 minutos antes de
realizar la electroforesis
34
Exceso de proteína y/o anticuerpo
Dilución de
la muestra y
anticuerpo
primario
35
Optimización del tampón de bloqueo
5% leche
5% BSA
5% BSA 5% leche
Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control
(ab9484) a una dilución 1/1000
A cada anticuerpo le corresponderá una solución de bloqueo óptima
36
Burbujas de aire, lavados insuficientes,
transferencia incompleta
Durante la transferencia,
contacto insuficiente entre
el gel y la membrana
Burbujas de aire entre el
gel y la membrana durante
la transferencia
Lavados insuficientes
37
Proteínas en estado nativo
Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las
proteínas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas
La imagen muestra un Western Blot de colágeno III humano purificado, en la
forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha
La estructura tridimensional del sitio de unión del anticuerpo al antígeno se
pierde al desnaturalizar y reducir la proteína
Forma reducida y Forma
desnaturalizada nativa
Colágeno humano purificado (ab7535) a 5 µg por
calle con el anticuerpo anti-colágeno III(ab6310)
Calle 1: Proteína en su forma reducida y
desnaturalizada
Calle 2: Proteína nativa (son reducir ni desnaturalizar)
Imagen cortesía de un Abreview enviado por
Michaela Leyh
38
Conocer la proteína de interés
Las proteínas no siempre muestran una única banda al peso
molecular esperado
Posibles motivos: fragmentación de la proteína, modificaciones post
-traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas
Una diferencia del 10-15% respecto al tamaño esperado se
considera aceptable y dentro de la normalidad
Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura
39
Protocolo de Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
40
Protocolos y material de interés
SwissProt – www.uniprot.org
•
Protocolos detallados de WB
www.abcam.com/protocols
•
Guía sobre controles de carga:
http://www.abcam.com/loadingcontrolguide
•
Vídeo detallado sobre WB:
http://www.abcam.com/westernblotguide
Guía de trucos para WB
Descarga tu guía de trucos para WB en nuestra página de protocolos
O pide tu copia por e-mail: mailrequest@abcam.com
41
Reactivos para Western Blot
Optiblot
• Geles prefabricados y soluciones tampón optimizadas para WB
• Otros reactivos (tinción de gel, Bradford, etc …)
• www.abcam.com/Optiblot
Marcadores
de peso
molecular
Prism
• Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usar
• www.abcam.com/prismproteinladders
Anticuerpos
secondarios
AbExcel
• Anticuerpos secundarios validados para WB
• Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP)
• www.abcam.com/abexcel
Kits ECL
• Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB
• www.abcam.com/ecl
42
Optiblot – reactivos para WB
Fáciles de usar – pocillos
coloreados para facilitar la
carga de la muestra
Hasta 10 veces más
fuertes que los geles
convencionales
Pocillos de alta
capacidad y sin peine
que remover
Larga duración – 1-2
años de caducidad
Fáciles de abrir, sin
espátulas o cuchillos
Geles compatibles con la
mayoría de tanques
Todos los reactivos necesarios para tus experimentos:
•
•
•
•
Tampones optimizados
Optiblot Blue (ab119211) – tinción tipo Coomassie del gel en tan sólo 15 minuots
Reactivo Bradford y ensayo BCA – compatible con detergentes en la muestra
Otros productos – membranas PVDF de baja fluorescencia, etc …
Más información: www.abcam.com/Optiblot
43
Anticuerpos monoclonales de conejo
(
), óptimos para WB
Histona H3
(fosfoT3) RabMAb
Anticuerpo histona H3 (fosfoT3)
(ab78351), dilución 1/500,000 en HeLa.
1) Sin tratar,
2) Tratadas con FBS + Caliculina A.
RabMAb: ventajas para WB
•
Alta afinidad – mayor factor de dilución (hasta
1:500.000 en algunos RabMAbs)
•
Alta especificidad – señal específica, sin o
con muy poco ruido de fondo
•
Reconocen epítopos diversos – ideal para la
detección de modificaciones posttraduccionales (ej. fosforilación, metilación,
acetilación)
•
Cada RabMAb has sido testado en WB en
muestras humanas, de ratón y rata para
determinar la reactividad
•
Más de 4000 RabMAbs disponibles
Más información: www.abcam.com/rabmabs
44
AbExcel anticuerpos secundarios
5 razones para usar secundarios AbExcel
• Altamente testados
• AbExcel conjugados a AP se pueden usar en
diluciones de 1/5000 a 1/50000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se
pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando
dilución 1/5000 en 3ml leche/BSA)
• AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en
diluciones de 1/2000 a 1/20000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se
pueden conseguir hasta 600 blots (usando
dilución 1/2000 en 3ml leche/BSA)
Más información:
AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel
45
Bolígrafo Luminol para membrana
(ab166858)
La forma más fácil y segura de calcular el peso molecular de la proteína de
interés. Una vez las proteínas han sido transferidas a la membrana:
Marca los estándares de PM con el boli Lumimol en la membrana
Continúa con la hibridación de la membrana según tu procedimiento
habitual (bloqueo, etc…)
Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetría
Visualiza y localiza las bandas del estándar con película o procesador
CCD
46
Contáctanos
soportecientifico@abcam.com
España: Teléfono: 91 114 65 54, email: orders@abcam.com
Argentina: Tecnolab; Teléfono: +54-11-4555-0010, email: patologia@tecnolab.com.ar
Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: ventas@biosonda.cl
Méjico: CTR Scientific; Teléfono: +52-81-8158-0600, email: nallely.lopez@ctr.com.mx
Otros paises: Abcam; Teléfono: +1-617-577-4200, email: us.orders@abcam.com
47
Promoción especial para participantes
20% descuento en los siguientes productos:
(hasta el 31 de mayo 2013)
•
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•
Gama Optiblot
RAbMAbs
Gama AbExcel
Código : SPWEB-XBIS1
48
¿Preguntas?
49