QUÍMIC CA BIOLÓG GICA. Año 2016 Trabajo Práctico Nº 1: PUR RIFICACIO ON DE LA A ENZIMA LISOZIMA A DE CLA ARA DE HUEVO O E trabajo prráctico consiiste en 4 sessiones (días 1-4) El 1 donde se s purificará la enzima liisozima a partir dee clara de hu uevo y se evvaluará la puureza y el renndimiento alcanzados. Además, A se estudiará la depenndencia de laa actividad y la estabiliddad de la lisoozima en funnción del pH. RMACIÓN GENERAL L: INFOR L lisozima es una enzim La ma abundantte en las lágrrimas, la seccreción nasal y la saliva en donde actúa coomo una barrrera frente a las infeccioones (Fleminng, 1922). Además, A se comercializann algunos producttos con lisozzima para laa higiene buccal que tieneen eficacia como c antimicrobianos orales. o La medida de la activ vidad de estta enzima en e sangre y orina contrribuye al diiagnóstico de d ciertas enfermeedades (Nearr y Lefford, 1992). L lisozima también es muy La m abundaante en la claara del huevo, de donde se extrae paara su uso industriial, en particcular para ell control de las bacteriaas lácticas en e vinos y quesos q (Cunnnigham y col., 19991). E nombre de lisozima o muramiddasa (EC 3.22.1.17) incluuye a un grrupo de enzzimas que El catalizaan la hidróliisis de enlaces glicosíddicos β(1→44) de los polisacáridos de la pareed celular bacteriaana (peptido oglicano) cuuyo disacáriido constituttivo es N-aacetilglucosaamina(NAG))-N-acetil murámiico (NAM, Figura F 1) (Chhipman y Shharon, 1969). F Figura 1 1 Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 residuos aminoácidicos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 kDa (14,4 KDa para la lisozima de Gallus gallus). Estas proteínas contienen puentes disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue unas de las primeras proteínas secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso un mecanismo de acción detallado (Canfield, R. E. 1963; Blake y col., 1965 y Chipman y Sharon, 1969). MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO: Guardapolvo. Guantes. Alcohol (1 litro por comisión). Lavandina (1 litro por comisión). Papel absorbente (2 rollos por grupo). Marcador indeleble. 2 Huevos (por comisión). Cronómetro. Jabón líquido para manos (1 por comisión) ATENCIÓN: Una vez finalizada cada sesión cada grupo deberá dejar su lugar de trabajo ordenado y los tubos de vidrio utilizados lavados y desrotulados. 2 CONSIDERACIONES ANTES DE COMENZAR A TRABAJAR EN EL LABORATORIO 1. Se debe utilizar guardapolvo de mangas largas y guantes. Se deberá usar el cabello recogido evitando el uso de accesorios colgantes. 2. No se debe pipetear con la boca. Se deben utilizar dispositivos para pipetear (pro-pipetas). 3. No está permitido comer, beber, fumar o maquillarse en el ámbito del laboratorio. Fumar está prohibido en cualquier espacio cerrado. 4. Las manos deben lavarse cuidadosamente con agua y jabón después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 5. Toda persona que utilice guantes descartables no deberá tocar objetos, ni superficies de uso común, tales como: teléfono, lapiceras, picaportes, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. Los guantes descartables se deben desechar en los sitios que corresponden según el tipo de material manipulado. 6. No se debe correr o realizar movimientos bruscos en los laboratorios. 7. Utilizar las zonas especialmente indicadas para el manejo de sustancias peligrosas, no contaminar áreas destinadas a otros usos. 8. No arrojar líquidos en las piletas de lavado ni residuos sólidos sin consultar al docente a cargo. Los residuos tóxicos y biológicos deben descartarse según las normas indicadas en el Manual de manejo de residuos peligrosos de la FCByF. 9. Avisar inmediatamente al docente cualquier incidente o accidente. 3 Día 1: TÉCNICA DE PIPETEO Y CURVA DE CALIBRACIÓN DEL MÉTODO DE BRADFORD Objetivos: Comprender la correcta manipulación de las micropipetas y realizar una curva de calibración del método de Bradford para su posterior utilización en la cuantificación de proteínas. A- Manipulación de las micropipetas Las micropipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Todas las micropipetas de pistón disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un código de color según el volumen a dispensar (Figura 2). 2‐200 µl Hasta 10 µl 100‐1000 µl Figura 2 Instrucciones para el manejo de una micropipeta (Figura 3): 0. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado y colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste. 1. Oprimir pistón con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido. 2. Liberar lentamente la presión sobre el pistón. Después de 2–3 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente. 3, 4 y 5. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el líquido, presionar lentamente el pistón hasta el primer tope. Después de un segundo, y sin soltar el pistón, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope. 4 6. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente y descartar la punta de plástico. Figura 3 PARA NO DAÑAR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES QUE POSEE LA MICROPIPETA: - El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta. - Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba. - Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido. - Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta. Profundidad de inmersión de la punta La profundidad de inmersión de la punta es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños (Figura 4). Si la punta se sumerge demasiado, se aspirará más líquido debido al aumento de la presión. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%. 5 Figura 4 Uniformidad al pipetear Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión también hasta un 5%. Ángulo de inmersión vertical Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º de ésta, puede mejorar la precisión hasta en un 2,5%. Técnica de dispensación Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier líquido restante en el orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta en un 1%. Otra técnica consiste en emitir directamente en la superficie del líquido. Si se dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de la dispensación. 6 Enjuague previo de puntas Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la película de líquido en el interior de la punta. El enjuague previo también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra. Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la precisión. Utilización de una pipeta adecuada para el volumen que se aspira Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la pipeta. Seguir este consejo puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. Cometemos mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen máximo de la pipeta que estamos utilizando. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Reconocimiento del rango de volumen permitido por cada micropipeta. 2. Pipetear los siguientes volúmenes de agua utilizando las micropipetas adecuadas: 625, 170, 55 y 10 µl. B- Determinación de la concentración de proteínas Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV o en la capacidad que tienen de unir determinados colorantes. Absorción ultravioleta de las proteínas. Todas las proteínas son capaces de absorber fuertemente debajo de los 230 nm debido al enlace peptídico. Sin embargo, a esta longitud de onda también absorben otros compuestos que pueden interferir en la utilización de esta medida en la determinación de la concentración de proteína (por ejemplo, altas concentraciones de ciertos buffers). Ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético; sin embargo, tres de ellos (tirosina, triptófano y fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano. Dado que la mayoría de las proteínas poseen residuos de aminoácidos aromáticos, 7 las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución. Método de Bradford. Este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de proteínas (Bradford, 1976). Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar. El complejo colorante-proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. Este método es más sensible, simple y rápido que otros como por ejemplo el método de Gornall (Gornall y col., 1949). En este trabajo práctico se realizará la curva de calibración del método de Bradford para posteriormente (Día 3) cuantificar la concentración de proteínas en las distintas fracciones de la purificación de la lisozima. MATERIALES: -Solución de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95% + 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar con papel Whatman N° 1. Conservar a 4°C. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Agregar distintos volúmenes del testigo, completando a 0,7 ml con H2O, mezclar y adicionar 0,7 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 580 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora. Trabajar en tubos Eppendorf. El blanco se realizará por triplicado. Testigo: BSA 0,1 μg/μl Sensibilidad: 1-12 μg de proteína en el volumen final de la determinación. Curva de calibración sugerida: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 μg del testigo. NOTA: El alumno deberá concurrir a la siguiente clase de laboratorio con la curva de calibración en Abs vs µg proteína para que el docente la evalúe. No es necesario que esté con formato de informe. 8 Día 2: PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA Objetivos: Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina de carboximetilcelulosa. A- Purificación de la lisozima Cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas (Bollag y col., 1996, Capítulo 9). Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una resina con carga negativa (por ejemplo, Carboximetil-celulosa, CM-celulosa, Figura 5) y en el segundo a una resina con carga positiva (por ejemplo, Dietilaminoetil-celulosa, DEAEcelulosa, Figura 5). Celulosa o Agarosa Celulosa o Agarosa Grupo Carboximetilo (CM) Forma desprotonada Grupo Dietilaminoetilo (DEAE) Forma protonada Figura 5 Una vez unida la proteína a la resina, esta se puede eluir de dos formas: variando el pH del medio hasta alcanzar y/o sobrepasar el pI o bien mediante un gradiente iónico. Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas de la clara del huevo, a un pH de 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas de la clara mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes. 9 En este trabajo práctico utilizaremos la CM-celulosa a pH 10 (cargada negativamente debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a ese pH, resina intercambiadora de cationes) para la purificación de la lisozima a partir de clara de huevo. A este pH la enzima quedará unida a la columna mediante una interacción electroestática y el resto de las proteínas de la clara no serán retenidas. Posteriormente, puede disociarse la lisozima de la resina mediante un lavado con un buffer de alta fuerza iónica. MATERIALES: - Buffer A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10 - Buffer B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 100 mM NaCl - Buffer C: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 300 mM NaCl - Buffer D: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 500 mM NaCl - Carboximetil-Celulosa (CM): Suspensión de resina previamente activada Activación de la CM: Inicialmente el polvo comercial de carboximetilcelulosa se hidrata toda la noche en agua destilada. Luego la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con H2O (o hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (o hasta pH neutro). Por último se hace una suspensión 1/1 (vol/vol) en buffer A. Las centrifugaciones son de 5 minutos a máxima velocidad, salvo luego del tratamiento con NaOH que es de 20 minutos. - Extracto Crudo: 50 ml de una dilución 1/5 (vol/vol) en buffer A de la clara procedente de un huevo. Se reparten 10 ml a cada grupo. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min suficiente cantidad suspensión de CM-celulosa previamente activada y equilibrada para obtener de 1 ml de resina. Descartar el sobrenadante. ATENCIÓN: en este y en los siguientes pasos el pipeteo debe realizarse con sumo cuidado para evitar la resuspensión de la resina. 2. Separar una alícuota de 1 ml (EC). Sobre la resina de CM-celulosa agregar los 9 ml restantes de Extracto crudo. Agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina. 10 4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min. Luego, medir el volumen del sobrenadante, guardar una alícuota de 1 ml del mismo en un tubo Eppendorf en hielo (Flow through o fracción no retenida de la siembra, FT) y descartar el resto. 5. Añadir a la resina 10 ml de buffer A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Medir el volumen del sobrenadante y guardar una alícuota de 1 ml del mismo en un tubo Eppendorf en hielo (Lavado 1, L1) y descartar el resto. 6. Repetir el paso anterior con 10 ml buffer B (Lavado 2, L2). 7. Resuspender la CM-celulosa con 5 ml de buffer C e incubar, agitando suavemente, durante 10 minutos. Centrifugar y recoger TODO el eluído en un tubo falcon de 15 ml (Elución, E). 8. Resuspender la CM-celulosa con 5 ml de buffer D agitando suavemente y centrifugar de nuevo. Descartar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de H2O destilada. NOTA: Medir el volumen de cada una de las fracciones obtenidas y guardarlas debidamente rotuladas (comisión y grupo) a -20°C. Las mismas serán utilizadas para determinar la concentración proteica (Día 3) y para medir su actividad enzimática (Día 4). B- Preparación de las muestras para SDS-PAGE MATERIALES: - Solución de siembra para muestras de proteínas 5X: Tris-HCl 60 mM pH 6.8, glicerol 25% v/v, SDS 2% p/v, β-ME 0,1% v/v y azul de bromofenol 0,1 % p/v. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Mezclar en tubos Eppendorf 10 µl de solución de siembra para proteínas con 40 µl de cada una de las fracciones: EC, FT, L1 y L2 obtenidas durante la purificación. Para el caso del eluído (E) mezclar 10 µl de la solución de siembra, 20 µl de H2O y 20 µl del eluído. 2. Hervir 5 minutos. 3. Guardar a -20°C hasta su análisis por SDS-PAGE. 11 Día 3: ANÁLISIS POR SDS-PAGE DE LA PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA Y CUANTIFICACIÓN PROTEICA. Objetivos: Utilizar la técnica de la electroforesis en gel para analizar el proceso de purificación de la lisozima, en cuanto a la composición proteica de las distintas fracciones y el grado de pureza alcanzado. Cuantificar la concentración de proteínas en cada una de las fracciones. A- Separación de proteínas en geles de poliacrilamida Electroforesis La electroforesis es una de las técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica y consiste en la migración de moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) en un campo eléctrico (Bollag y col., 1996, Capítulo 5). La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH de trabajo. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN y Proteínas), en el cual un entramado tridimensional impide o reduce la movilidad de las moléculas, participando así en el proceso de separación. Los soportes pueden ser más o menos restrictivos según el tamaño del poro. Entre los más restrictivos están los geles de acrilamida-bisacrilamida, y entre los menos restrictivos están los de agarosa. En la electroforesis, el gel retarda en mayor medida a las moléculas mayores respecto a las de menor tamaño. De esta manera, la movilidad de una molécula en una electroforesis dependerá de su tamaño (su capacidad de atravesar el tamizado molecular) así como también de la carga neta que posea. En este trabajo práctico, realizaremos una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (dodecilsulfato sódico, Figura 6). En este tipo de electroforesis, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su carga. Esto se debe a que este detergente se une a las proteínas desnaturalizándolas y confiriéndoles carga negativa en forma proporcional a su tamaño y que enmascara la carga intrínseca de cada proteína. De esta manera, todas las proteínas tratadas con SDS presentan la misma relación carga/masa, por eso, la separación será debida sólo a la diferente retención por el soporte, es decir depende únicamente de la masa molecular de la proteína (Figura 7). 12 Parte hidrofóbica Parte hidrofílica Confiere la carga negativa Dodecilsulfato sódico (SDS) Figura 6 Mezcla de macromoléculas Electroforesis Gel poroso Figura 7 Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de tensión que proporciona el campo eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece la diferencia de potencial (Figura 8). B) una cuba o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos (Figura 8). Figura 8 C) el buffer: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la proximidad del cátodo; el buffer evitará que el 13 entorno anódico se acidifique y el catódico se haga más básico a lo largo de la corrida electroforética. D) un gel: el polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bisacrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato de amonio, TEMED, Figura 9). Acrilamida Bis-acrilamida Radical sulfato inicia la polimerización Figura 9 La preparación de los geles de poliacrilamida se llevará a cabo según el método descrito por Laemmli (Laemmli, 1970): Gel de separación: poliacrilamida 15% (vol. final para 2 geles 10 ml) - Acrilamida (30%)- Bis-acrilamida (0.8%): 5 ml - Tris 1,5M pH8.8: 2,5 ml - H20: 2,3 ml - SDS: 10% 0,1 ml - TEMED: 10 μl - Persulfato de amonio 10%: 100 μl 14 Verter, cuidadosamente, la mezcla entre los cristales. Cubrir, cuidadosamente con alcohol 96% (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. Esperar a que el gel polimerice. Una vez gelificado retirar el agua. Gel concentrador: poliacrilamida 6% (vol. final para 2 geles 6 ml) - Acrilamida (30%)- Bis-acrilamida (0,8%): 1,2 ml - Tris 0,5 M pH 6,8: 1,5 ml - H20: 3,2 ml - SDS 10%: 60 μl - TEMED: 6 μl - Persulfato de amonio 10%: 60 μl Verter, cuidadosamente, la mezcla entre los cristales. Colocar el peine y esperar a que polimerice. Retirar el peine. ATENCIÓN: La acrilamida y el TEMED son agentes extremadamente tóxicos que pueden ser absorbidos por la piel. Al manipular estas soluciones usar siempre guantes y tener cuidado con el material contaminado. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Sembrar según se detalla a continuación. El marcador de peso Molecular está compuesto por una mezcla de BSA (66 KDa), ovoalbúmina (45 KDa), Inhibidor de tripsina (20,1 KDa) y alfalactoalbúmina (14,2 KDa). 15 Gel 1: Calles Gel 2: Calles 1: 10 μl EC Grupo 1 o 2 2: 10 μl FT Grupo1 3: 10 μl L1 Grupo1 4: 10 μl L2 Grupo1 5: 10 μl E Grupo1 6: 10 μl FT Grupo2 7: 10 μl L1 Grupo2 8: 10 μl L2 Grupo2 9: 10 μl E Grupo2 10: 5 μl Marcador de Peso Molecular 1: 2 μl EC Grupo 3 o 4 2: 2 μl FT Grupo3 3: 10 μl L1 Grupo3 4: 10 μl L2 Grupo3 5: 10 μl E Grupo3 6: 2 μl FT Grupo4 7: 10 μl L1 Grupo4 8: 10 μl L2 Grupo4 9: 10 μl E Grupo4 10: 5 μl Marcador de Peso Molecular 2. Correr la electroforesis en buffer Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol esté, aproximadamente, a 0,5 cm del extremo inferior del gel. 3. Desmontar el gel y teñirlo con etanol/acético/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l). B- Cuantificación de proteínas por método de Bradford MATERIALES: -Solución de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95% + 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar con papel Whatman N° 1. Conservar a 4°C. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Cada grupo deberá determinar la cantidad de proteínas presente en cada una de las fracciones de la purificación utilizando la siguiente tabla y la curva de calibración realizada el Día1. Trabajar en tubos Eppendorf y realizar el experimento por duplicado. Fracción Blanco EC (dil 1/50) FT (dil1/50) L1 L2 E Volumen (µl) 0 20 20 5 20 20 Volumen de H2O (µl) csp. 700 µl 700 680 680 695 680 680 Volumen de Bradford (µl) 700 700 700 700 700 700 Abs1 Abs2 16 Respetar el orden de los agregados. Considerar que los valores de absorbancia medidos deben caer dentro del rango determinado en la curva de calibración. De lo contrario, deben realizarse nuevas medidas utilizando cantidades mayores o menores de las fracciones correspondientes. C- Cuantificación de proteínas por Absorbancia a 280 nm La concentración proteica en la fracción E también será determinada por absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción teórico de la lisozima: Coeficiente de extinción (Ɛ280nm): 38,94 cm-1 mM-1 La determinación se hará por duplicado. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Colocar 700 µl de la fracción E en una cubeta especial para UV y medir absorbancia a 280 nm. Realizar por duplicado. 17 Día 4: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LISOZIMA Objetivos: Determinar la actividad de la lisozima en las diferentes fracciones de purificación y su dependencia con el pH del medio. Medida de la actividad enzimática Exceptuando unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas espectroscópicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia para la investigación y análisis de proteínas. La figura 10 muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo para una reacción catalizada enzimáticamente (Segel, 1982, Capítulo 4). Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas: - El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración de sustrato (S) - La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al aumentar la concentración de P - Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima. 8 P 6 4 2 0 2 4 6 Tiempo 8 10 Figura 10 La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad inicial, esto es, obtener la tangente al origen del gráfico mostrado en la figura 10 (Dixon y Webb, 18 1979, Capítulo 2). De esta manera, las diferentes causas que producen la disminución de la actividad con el tiempo son eliminadas. La figura 11 ejemplifica medidas experimentales de la formación de P en función del tiempo (como en la figura 10), determinadas a tres concentraciones diferentes de S. Puede observarse que la velocidad (v) que se obtendría en cada caso dependería del intervalo de tiempo que se tomara para medirla. Figura 11 En este ejemplo, si medimos v para cuando S=S3, obtendríamos el mismo valor, independientemente del intervalo de tiempo elegido. En cambio para S=S2, la v obtenida sería distinta según el intervalo escogido. Para estos dos casos, la v podría calcularse adecuadamente eligiendo el intervalo 0-1, donde la formación de P es función lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 11, cuando S=S1, la determinación de v usando el intervalo 0-1 no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de v realizada. Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de actividad enzimática. La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la aparición de un P de la reacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o de P puede 19 hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos (los más comunes), volumétricos, potenciométricos, radioquímicos, espectrofluorométricos. Independientemente del método utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una reacción enzimática: Sa + Sb P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros componentes de la mezcla de reacción. En este caso, la reacción enzimática podría seguirse continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática. Los ejemplos típicos de métodos continuos empleados para medir actividad los constituyen las deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como coenzima. Estos métodos se basan en que la forma reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma oxidada (NAD(P)), absorbe a 340nm. Así, la actividad de la Glutamato deshidrogenasa (GluDH): NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+ Glutamato + NAD+ podría seguirse por un método continuo midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm, con lo que se obtendría la curva mostrada en la figura 12. Figura 12 En ciertos casos, aunque no haya una propiedad analítica diferencial de un S o de un P que permita su dosaje continuo, aún puede medirse la actividad de una enzima por un método continuo si se acopla otra reacción enzimática a la de la enzima en cuestión. Por ejemplo, la actividad de la enzima Ureasa puede medirse en forma continua por un método que utilice a la Glutamato 20 Deshidrogenasa como enzima acoplada de forma que se cuantifique el Amonio producido por acción de la Ureasa: (CO(NH2)2 + 2 H2O 2 NH4 + + CO2) (Ureasa) NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+ Glutamato + NAD+ (GluDH) Si las cantidades de GluDH y de NADH agregadas al medio de reacción son lo suficientemente elevadas, la disminución de la absorbancia a 340 nm va a ser equivalente a la velocidad de producción de NH4+ por parte de la Ureasa. En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere detener la reacción enzimática. En estos casos se utilizan métodos discontinuos, en los que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. Por ejemplo, la actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa (ADPGlc + PPi Glc1P + ATP) puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formación de ATP radioactivo. Si no se separa el ATP formado del PPi que no reaccionó no se observa cambio de la radioactividad en el medio de reacción. Para determinar cuánta radioactividad está en forma de ATP es necesario detener la reacción enzimática y separar el ATP del PPi. De esta forma, para tener una curva de ATP formado en función del tiempo, es necesario preparar tantos tubos de reacción como puntos experimentales se deseen, en cada uno de los cuales se cortará la reacción en el tiempo adecuado. Un método discontinuo puede comprender también aquel en el que el dosaje de un S o P no implique su separación del medio de reacción, sino su reacción química en condiciones que afectan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la Fosfoglucosa isomerasa (Glc6P Fructosa6P) podría medirse cuantificando Fru6P por el método de Roe. Pero las condiciones del método de determinación hacen que necesariamente se detenga la reacción enzimática con cada medida de Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental de cantidad de Fru6P producida. Nótese que, en general, el uso de un método continuo brinda con mayor facilidad un número elevado de medidas de variación de S o P en función del tempo (inclusive puede tenerse un trazo continuo) que un método discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo antes mencionado sobre la variación de v en función del tiempo, al usar un método discontinuo para medir actividad enzimática hay que ser particularmente cuidadoso para estar seguro de medir velocidades iniciales. 21 En este trabajo práctico se utilizará un método continuo para la medida de actividad de la enzima lisozima. Medida de la actividad lisozima La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión del microorganismo Bacillus subtilis en concentración suficientemente elevada para atenuar, por dispersión, la transmisión de luz monocromática a través de la cubeta de un espectrofotómetro. Al incubar esta suspensión con lisozima, la pared celular de las bacterias se hidroliza, y en un medio hipotónico produce la lisis de las mismas, lo que reduce la dispersión de la luz, que se manifiesta en una reducción en la absorbancia a una longitud de onda fija de 600 nm. La actividad enzimática es proporcional a la disminución de la absorbancia a 600 nm. Por definición, se considera que 1 unidad de actividad enzimática de lisozima (U) produce una disminución en la absorbancia de 0,001 en 1 minuto cuando se ensaya en un final de reacción de 1,5 ml a 25 ºC y en 0,1 M fosfato. MATERIALES: - Buffer citrato-fosfato 100 mM, pH 4 - Buffer citrato-fosfato 100 mM, pH 5 - Buffer fosfato sódico 100 mM, pH 6,2 - Buffer fosfato sódico 100 mM pH 7 - Buffer fosfato sódico 100 mM pH 8 - Suspensión de la bacteria Bacillus subtilis. Las bacterias se crecen ON en medio Luria Bertani a 37°C, se centrifuga el cultivo y se resuspende en buffer fosfato sódico pH 6,2 a una DO de 2 a 600 nm. ATENCIÓN: Tener precaución a lo largo de todo el trabajo práctico en la manipulación de las células bacterianas. A pesar de que se trate de una cepa no patogénica se considera residuo peligroso por tratarse de material biológico. El descarte del material sólido (por ejemplo tips, guantes, etc) debe realizarse en bolsas rojas, mientras que las soluciones deben tratarse con lavandina en una concentración final del 10% V/V. 22 A- Medida de la actividad de las distintas fracciones de la purificación PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. En una cubeta, añadir la suspensión bacteriana, el buffer fosfato sódico 100 mM pH 6,2 y por último, la fracción que corresponde siguiendo el siguiente esquema: Volumen de suspensión Volumen de buffer Volumen de cada Fracción de bacterias (µl) fosfato pH 6,2 (µl) fracción (µl) 100 1310 EC 90 100 1100 FT 300 100 1100 L1 300 100 1100 L2 300 100 1310 E 90 2. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg. B- Medida de la actividad en función del pH PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. En una cubeta, añadir 100 µl de la suspensión bacteriana, 1310 µl del buffer que corresponda en cada caso y por último, 90 µl de la fracción E. Se deben realizar las medidas a pH 4, pH 5, pH 6,2, pH 7 y pH 8. 2. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg. C- Estabilidad en función del pH PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Incubar en un tubo Eppendorf 90 µl de la fracción E con 210 µl del buffer que corresponda en cada caso por 20 minutos. Se deben realizar las incubaciones a pH 4, pH 5, pH 6,2, pH 7 y pH 8. 2. Luego de los 20 minutos, añadir en una cubeta 100 µl de la suspensión bacteriana, 1100 µl el buffer fosfato sódico 100 mM pH 6,2 y por último, agregar el contenido del tubo Eppendorf. 23 3. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg. 24 REFERENCIAS - Blake, C. C., Koenig, D. F., Mair, G. A., North, A. C., Phillips, D. C. y Sarma, V. R. (1965) Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 Angstrom resolution. Nature. 206(4986):757–761. - Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-54 - Bollag, D. M., Rozycki, M. D. y Edelstein S. J. (1996) Protein Method, Segunda Edición,WileyLiss, Inc., New York. - Canfield, R. E. (1963). The amino acid sequence of egg white lysozyme. J. Biol. Chem. 238: 2698–2707. - Chipman, D. M. y Sharon, N. (1969). Mechanism of lysozyme. Science 165, 454– 465. - Cunnigham, F. E., Proctor, V. A. y Goetsch, S. J. (1991) Egg-white lysozyme as a food preservative. A world overview. Poultry Sci. J.;47:141–63. - Dixon, M., y Webb, E. C. (1979). Enzymes, Tercera Edición, Academic Press Inc., New York. - Fleming, A. (1922). On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions. Proc. R. Soc. Lond. B. 93(653): 306-317. - Gornall, A. G., Bardawill, C. S. y David, M. M. (1949). Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. 177:751 - Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685 - Near, K. A. y Lefford, M. J. (1992). Use of serum antibody and lysozyme levels for diagnosis of leprosy and tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 30(5): 1105–1110. - Segel, I. H. (1982). Cálculos de Bioquímica, Segunda Edición, Acribia, Saragoza. 25 INFORME DE LABORATORIO: INTEGRANTES DEL GRUPO COMISIÓN OBJETIVOS GENERALES RESULTADOS I- Purificación de la lisozima I.a- SDS-PAGE (foto y descripción) I.b- Cuantificación de proteínas (curva de calibración, ejemplo del cálculo de la concentración de al menos una de las fracciones por ambos métodos) I.c- Medidas de actividad de cada fracción (al menos un ejemplo del cálculo de la Aesp en una de las fracciones) I.d- Complete la siguiente tabla: Fracción Vol (ml) [Prot] (mg/ml) ProtT (mg) A (U/ml) AT (U) Aesp (U/mg) EC FT L1 L2 E A partir de esos datos construya la tabla de purificación. II- Estabilidad y actividad de la lisozima vs pH: una única gráfica que contenga los valores de actividad (U/mg) vs pH de medida y los de actividad (U/mg) vs pH de preincubación. DISCUSIÓN - Método de cuantificación de proteínas: a- La medida de absorbancia a 280 nm: ¿Es un método confiable para la determinación de la concentración de proteínas? ¿Se puede aplicar a cualquier proteína? b- ¿Es correcto utilizar la concentración de proteínas de la fracción E medida por absorbancia a 280 nm para la construcción de la tabla de purificación? Justifique comparando con el resultado obtenido por el método de Bradford. 26 c- Calcule la concentración de proteínas totales en la clara de huevo y compare con la bibliografía. - Método de medida de actividad: ¿Qué tipo de método (continuo o discontinuo) se utiliza para la determinación de la actividad enzimática? Explique. - Purificación: Complete la siguiente tabla en base a datos bibliográficos: Proteína Abundancia en clara de huevo (%) Peso Molecular (kDa) pI Ovoalbúmina Ovotransferrina Lisozima Ovomucina Ovomucoide Avidina Teniendo en cuenta esta tabla, la del ítem I.d y el patrón observado en el gel, discuta las siguientes cuestiones: proteínas que se identifican en el gel, la eficiencia del proceso de purificación y alternativas para mejorar este protocolo de purificación. - Actividad y estabilidad en función del pH Determine e informe rango de estabilidad y pH óptimo. 27