MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.

MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.
Muchas proteínas no están “terminadas” cuando se completa la
traducción, y requieren “madurar”, a través de modificaciones posttraduccionales.
Estas modificaciones pueden consistir en:
Modificación covalente de residuos de aminoácidos (más de 200).
Proteólisis parcial.
Las modificaciones pueden ser:
Reversibles o irreversibles.
Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas.
Enzimáticas o no enzimáticas.
Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales
tardías.
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MAS
COMUNES EN LAS PROTEINAS.
-
Formación de puentes disulfuro.
N- y O- glicosilación (Asn, Ser/Thr).
Fosforilación (Ser/Thr; Tyr; His; Arg; Lys; Asp o Glu)
Acetilación (N-terminal)
Amidación (C-terminal)
Remoción reversible del C-terminal en tubulinas.
Metilación (Leu, Isoprenil-Cys, Lys, Arg, His)
Hidroxilación (Pro, Lys)
Sulfatación (Tyr)
ADP-ribosilación
- Modificaciones para inserción en membranas:
- Palmitoilación y miristoilación.
- Prenilación (farnesilación, geranilgeranilación).
- Unión de ancla de glicosil fosfatidil inositol.
- Procesado proteolítico:
- Remoción del péptido señal.
- Remoción de dominios pro- Procesamiento de precursores hormonales, poliproteínas virales.
- “Splicing” de proteínas.
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ALGUNAS SECUENCIAS CONSENSO PARA
MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.
1) N-Glicosilación: N*XT/S (X no puede ser Pro).
2) O-glicosilación: PXS*/T*XXP
3) Fosforilación:
Ser/Thr: RRXS* ; KRXXS* ; K/RK/RXS*/T* ;
K/RS*/T*XK/R; K/RS*/T*P
Tyr:
K/RXXXD/EXXXY*
4) Sulfatación: XE/DY*X
5) Prenilación: C*AAX ; C*C ; C*XC* (en el C-terminal).
6) Miristoilación: M-G*XXXS/T
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ALTERACIONES DE LOS AMINOACIDOS TERMINALES.
1)
N-terminal:
1)
Metionina N-terminal: Grupo formilo: Deformilasa.
Metionina inicial:
Aproximadamente la mitad de las proteínas, tanto
eucarióticas como procarióticas. Metionina aminopeptidasa, asociada con
los ribosomas.
2)
Agregado de residuos al N-terminal: Transferencia de residuos de
aminoácidos desde tRNAs cargados (p.ej.: Leu o Phe a una Arg o Lys Nterminal). Función desconocida: ¿Marcado de la proteína para degradación
inmediata?
3)
Acetilación del N-terminal:
60 a 90 % de las proteínas sintetizadas en el
citosol de células eucarióticas.
N-α-acetil transferasa. Acetil-CoA.
Co-traduccional. Recientemente se ha propuesto que puede participar en el
marcado de proteínas para su degradación en el proteasoma. Problema para
la secuenciación automática de la proteína intacta por Edman.
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4)
Otras acilaciones: Adición de grupos formilo, piruvoílo, α-cetoacilo,
glucuronilo.
Formación de piroglutamilo, a partir de Gln N-terminal.
Acido piroglutámico. Acido L-2-pirrolidona-5-carboxilico.
Puede ser eliminado de las proteínas que lo contienen como residuo N-terminal por las
piroglutamil peptidasas.
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LIPIDACION
El
morfógeno
secretado
Hedgehog se autoprocesa en un
motivo GCF y a la nueva Gly Cterminal se le une colesterol;
luego este producto es Npalmitoilado en la Cys en la
zona N-terminal.
Otro morfógeno secretado, Wnt,
es S-palmitoilado en Cys 77 y
O-acilado
con
ácido
palmitoleico en Ser 209; la Oacilación está asociada a la
salida del retículo endoplásmico
y su ulterior secreción.
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5)
Miristoilación: Proteínas citosólicas. Miristoil-CoA: proteína Nmiristoil transferasa. Co-traduccional. Gly N-terminal. Permitiría
asociaciones débiles con membranas o interacción con otras proteínas.
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2)C-terminal:
1)
Anclas de glicosilfosfatidilinositol. Se sintetizan completas y se
transfieren a la proteína en el RE, enseguida de la traducción. Permiten la rápida
difusión en el plano de la membrana.
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THE GPI:PROTEIN TRANSAMIDASE COMPLEX
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2)
Farnesilación y geranilgeranilación: Secuencia CAAX, con A alifático. El
grupo SH es prenilado, se eliminan proteolíticamente los tres residuos del Cterminal, y la Cys C-terminal se metila en el carboxilo a partir de la S-adenosilmetionina (SAM).
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Procesamiento de la
Prelamina A. La falta de
la enzima responsable de
la última etapa causa una
forma
de
progeria
humana.
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Palmitoilación de Cys:
Unión tioéster, reversible. Presente en general en proteínas que ya son
intrínsecas de membrana. Agregado en el RE o en el Golgi. Algunas veces se presenta sólo si el Cterminal está farnesilado. Funciones: 1) Aumentar la afinidad de una proteína soluble por las
membranas, regulando su tráfico o retención; 2) modular la estabilidad de algunas proteínas, a através
de un control de calidad del plegamiento correcto.
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LIPIDACION DOBLE: FARNESILACION Y PALMITOILACION
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REGULACION DEL TRAFICO DE
PROTEINAS POR PALMITOILACION
Panel A: AMPA: acido α-amino-3hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico.
Su receptor es un canal de cationes
regulado por ligando que media el
componente rápido de las corrientes
excitatorias post-sinápticas mediadas
por glutamato. 4 subunidades, GluR1 4, todas son palmitoiladas en dos sitios:
1, segunda TMD;
2, C-terminal,
después de cuarta TMD.
La
palimitoilación del sitio 2 inhibe la
asociación de GluR1/2 con la proteína
asociada al citoesqueleto 4.1 N, que
atrapa a GluR1/2 en la membrana
plasmática.
GluR
no
palmitoilado,
verde;
palimotilado
en
TMD2,
rojo;
palmitoilado en el C-terminal, azul.
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ACETILACION DE RESIDUOS INTERNOS DE LISINA.
Recientemente se ha descripto que un número muy sustancial de enzimas
de vías metabólicas centrales (glucólisis, ciclo de Krebs, ciclo de la urea,
metabolismo del glucógeno, metabolismo de los ácidos grasos) pueden ser
acetiladas por acetilasas y deacetiladas por deacetilasas, teniendo esta
reacción finalidad regulatoria, pues producen cambios en la actividad de
esas enzimas. Se ha propuesto que esta modificación, detectada en
muchos organismos, desde bacterias hasta el hombre, tendría una
significación similar a las reacciones de fosforilación y defosforilación.
Una comparación entre las proteínas acetiladas en hepatocitos humanos y
de ratón demostró un 70 % de identidad, en tanto que hubo sólo un 14 %
de coincidencia entre las presentes en hepatocitos y una linea celular de
leucemia humana, lo que sugiere que hay grandes variaciones en los
patrones de acetilación en diferentes células.
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SULFATACION DE PROTEINAS
Sulfatación de Tyr (O-sulfatación): Tirosil proteína sulfotransferasa, proteína integral de
membrana con su sitio activo en el lumen del trans-Golgi. Dador de sulfato: PAPS (3’
fosfoadenosina-5’ fosfosulfato). Función desconocida; podría estar relacionada con las
modulación de interacciones proteína - proteína en proteínas secretadas o ligadas a
membrana.
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SULFATACION DE PROTEINAS
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3) Amidación del C-terminal: El grupo amido deriva de una Gly C-terminal. La
reacción es catalizada por dos enzimas, con intervención de ácido ascórbico, Cu y
O2 .
4) Eliminación reversible de la Tyr C-terminal en la tubulina:
La α-tubulina se
sintetiza con Tyr C-terminal. Hay una tubulinil-tirosina carboxipeptidasa y una
tubulinil-tirosina ligasa (Tyr y ATP). Importante en la formación y desensamblado de
microtúbulos (monómero tirosinado).
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Carboxilación de Glu:
Carboxilasa dependiente de vitamina K, que
requiere O2 y CO3H . Proteína integral de membrana, con su sitio activo en
el lumen del RE. Presente en factores de coagulación. En el factor X, el
propéptido dirige la carboxilación de los 12 residuos de Glu más cercanos
al N-terminal. El Gla está involucrado en la unión de Ca++. Las proteínas
sintetizadas en presencia del antagonista dicumarol son inactivas.
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Hidroxilación:
Pro y Lys. Maduración del colágeno en el RE. Las enzimas
son la prolil 4-hidroxilasa, la prolil 3-hidroxilasa y la lisil 5-hidroxilasa.
Requieren Fe++, ascorbato, O2 y α-oxoglutarato.
Son esenciales para el
plegamiento y ensamble del colágeno maduro.
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Fosforilación:
Normalmente reversible, con funciones
regulatorias. Proteína quinasas y proteína fosfatasas.
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ADP-ribosilación:
Reversible.
Regulatoria. Núcleo y citosol. Las monoADP-ribosil transferasas (MART) usan el
NAD para transferir el grupo ADP-ribosilo a
cadenas laterales de aminoácidos (N de
His, Arg, Asn o Lys, carboxilo de Glu,
carboxilo de Lys C-terminal). Este grupo
puede ser removido por la mono-ADPribosil-X-hidrolasa. Existe además una
familia de poli-ADP ribosa polimerasas
(PARP) capaces de polimerizar numerosas
unidades de ADP-ribosa, dando estructuras
lineales o ramificadas de poli-ADP ribosa,
pero no hay evidencia de que estos
polímeros estén unidos covalentemente a
proteínas. Estos polímeros pueden ser
hidrolizados por la poli (ADP-ribosa)
glicohidrolasa, y el grupo directamente
unido a la PARP por la ADP-ribosil proteína
liasa. Los efectos tóxicos de las toxinas
diftérica, colérica y pertussis se deben a la
ADP-ribosilación de proteínas regulatorias.
La ADP-ribosilación tiene un papel
importante
en
procesos
como
la
señalización inter- e intracelular, la
transcripción, la reparación del DNA, la
regulación del ciclo celular y la mitosis, así
como de necrosis y apoptosis.
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REACCIONES DE ADPMONORIBOSILACION
El residuo de aminoácido
aceptor puede ser Arg, Asn,
Cys, Glu, Asp, P-Ser.
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METABOLISMO DE POLI-ADP-RIBOSA.
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O-GLICOSILACION
Las mucinas son típicas glicoproteínas que presentan O-glicosilación.
Cuando el porcentaje de carbohidrato es alto, como en este caso, estas
proteínas se extraen en solución acuosa en una partición fenol/agua,
como lo hacen los ácidos nucleicos, y no son precipitables por ácidos
tricloroacético o perclórico.
Hay heterogeneidades en el peso molecular, dependiendo del contenido
variable en carbohidrato, y tienen comportamiento anómalo en SDSPAGE.
El contenido en carbohidrato puede determinarse por el método del
fenol-sulfúrico, que tiene relativamente poca interferencia con los
aminoácidos de la parte proteica.
FUNCIONES: estabilización de la proteína contra proteólisis y
desnaturalización térmica. Modulación de agregación. Funciones en el
reconocimiento celular (selectinas, por ejemplo)
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TIPOS COMUNES DE O-GLICOSILACION
1) Tipo O-GalNAc. Son las mas abundantes, con GalNAc unida a Ser o Thr por una
unión α-glicosídica: Mucinas.
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2) Tipo O-GlcNAc. Proteínas regulatorias, nucleares o citosólicas.
3) O-fucosilación. Presente en algunas proteínas involucradas en procesos tales
como coagulación (Factor VII, Factor XII) y señalización celular.
4) O-manosilación.
Frecuente en levaduras, pero tambien presente en
glicopéptidos de cerebro de rata.
5) O-glucosilación. Detectada en proteínas de la cascada de coagulación, como
Factor VII y Factor IX.
6) Fosfoglicosilación. GlcNAc, Fuc y Man ligadas a Ser indirectamente por una
unión fosfodiester. Probablemente involucrada en tráfico intracelular.
7) Glicosilación tipo O-glicosaminoglicano. Los mucopolisacáridos se unen a
los proteoglicanos a través de una xilosa unida en β a Ser o Thr. P. ej.:
condroitinsulfato.
8) Glicosilación tipo colágeno. HidroxiLys glicosilada por una Gal unida en β.
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Estas uniones son lábiles al alcali, y se rompen por tratamiento con
OHNa 0.05 - 0.1 M , durante 24 hs. a temperatura ambiente.
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Esta unión, en configuración β-D- es más estable que la unión peptídica a la hidrólisis
alcalina. En presencia de 2M OHNa a 90 - 105oC, durante 16 - 20 hs. se aísla Gal-Hyl o
Glc(1-2)Gal-Hyl.
Tambien es estable en condiciones ácidas (0.05 M H2SO4 a 100oC, durante 28 hs.),
debido a que la carga positiva del ε-amino estabiliza la unión.
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BIOSINTESIS DE PROTEÍNAS O-GLICOSILADAS
Hay diferentes N-acetilgalactosaminil transferasas, cuya localización es
específica del tipo celular y puede variar con la diferenciación.
Una glicoproteína puede estar O-glicosilada de manera diferente en
diferentes tejidos.
La O-glicosilación se produce luego de la traducción y del plegamiento de
la proteína. Por eso sólo los residuos de Ser y Thr expuestos podrán ser
glicosilados. Por eso ocurre en general en los giros β o en regiones
extendidas, por su alto contenido en Pro.
Este proceso ocurre en general en el Golgi, aunque en algunos casos
podría iniciarse en el retículo endoplásmico. Los monosacáridos se
transfieren de a uno por vez, no en bloque como en la N-glicosilación.
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BIOSINTESIS DE LOS DETERMINANTES DE LOS GRUPOS
SANGUINEOS A Y B
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IDENTIFICACION DE MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES.
1) Establecer la presencia de un “aminoácido inusual” en la proteína, ya sea
por predicción a partir de la secuencia del cDNA, o por características
inusuales de la proteína, o por observaciones casuales.
2)
Determinar la estructura química del compuesto y establecer su
localización en la cadena polipeptídica.
NO HAY REGLAS O PROCEDIMIENTOS GENERALES, PUES HAY CERCA DE
200 AMINOACIDOS “SECUNDARIOS” DERIVADOS DE LOS 20 PRIMARIOS.
Se requiere, en general, equipo para análisis de aminoácidos, secuenciación
(Edman), espectrometría de masa, NMR.
Hidrólisis enzimática preferible a la ácida.
Comportamiento del derivado en los métodos de análisis standard.
Edman: No se obsrvará el derivado si el N-terminal está bloqueado, o si el
producto primario no pasa a la fase orgánica, por ejemplo por ser muy
hidrofílico, o si el PTH derivado eluye fuera de la región monitoreada en el
cromatograma standard.
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Determinación de la presencia de N-glicosilación:
Unión a ConA-Sepharose y elución específica.
Aumento de movilidad electroforética después del tratamiento
con enzimas como la endo-N-acetilglucosa-minidasa H (Endo
H).
“X” en secuenciación automática por Edman.
Una vez determinado el sitio de la cadena peptídica donde se
encuentra unido el oligosacárido, su composición y estructura
deben determinarse por métodos de química de carbohidratos,
incluyendo HPLC (Dionex) y el uso de glicosidasas específicas
de monosacárido y tipo de unión.
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O-glicosilación: β-eliminación
Estos compuestos absorben en el UV y se puede detectar su formación por absorbancia. La βeliminación reduce el nivel de Ser y hr en la proteína, y su cuatificación antes y después sirve
para cuantificar. El NaNH4 reduce el carbohidrato eliminado a alditol, y puede ser usado
para su identificación.
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Fosforilación:
32P ,
i
Marcación con
in vivo o in vitro. Localización del fosfato:
Método de Edman modificado para extraer el fosfoaminácido-PTH
y contar la radioactividad.
Tambien puede hacerse por βeliminación, agregando β-mercaptoetanol para formar un tioéter
con la dehidroalanina o la β-metil dehidroalanina, detectando el
derivado con el secuenciador (Edman).
Puentes disulfuro:
1) establecer si hay puentes disulfuro (SDS-PAGE con muestras
reducidas y sin reducir). 2) Evitar el intercambio de puentes
disulfuro (catalizado por trazas de tioles a pH algo alcalino). 3)
Fragmentar la proteína sin reducirla; separar los péptidos;
romper los puentes por oxidación (ácido perfórmico) o reducción
(β-mercaptoetanol); repetir el método de separación. Esto se
hacía (Hartley) por cromatografía bidimensional en papel, con
oxidación con vapores de ácido perfórmico después de la primera
corrida, y actualmente por HPLC en fase reversa.
La respuesta definitiva sobre los puentes disulfuro la da la
determinación de la estructura tridimensional de la proteína.
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MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL POR
PROTEOLISIS LIMITADA.
Puede llevarse a cabo por autoproteólisis, en enzimas proteolíticas,
o por proteinasas específicas de procesamiento.
La proteólisis debe llevarse a cabo de modo muy específico, y
requiere la presencia de la o las enzimas necesarias en el mismo
compartimento en que se encuentra la proteína a procesar.
Veremos cuatro casos principales:
- Remoción del péptido señal.
- Remoción de dominios pro- Procesamiento de precursores hormonales y
poliproteínas virales.
- “Splicing” de proteínas.
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“PROTEIN SPLICING” : INTEINAS Y EXTEINAS
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